TSG101在病毒出芽過程中的作用及其機制

許 巖， 張 瑩

(1.中國醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)七年制，遼寧 沈陽 110000；2.中國醫(yī)科大學(xué) 科學(xué)實驗技術(shù)中心三部，遼寧 沈陽 110013)

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TSG101在病毒出芽過程中的作用及其機制

許 巖1， 張 瑩2*

(1.中國醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)七年制，遼寧 沈陽 110000；2.中國醫(yī)科大學(xué) 科學(xué)實驗技術(shù)中心三部，遼寧 沈陽 110013)

TSG101基因是新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因候選者，定位于人類 11號染色體 p1511-p1512，其編碼產(chǎn)物TSG101蛋白N端區(qū)域與泛素結(jié)合酶(UBC)同源。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TSG101基因具有多種重要的功能，與多種病毒出芽密切相關(guān)，所以TSG101可作為一個新的抗病毒靶點。本文主要從TSG101在多種病毒(HIV、IAV、MARV、ASV等)出芽過程中扮演的角色，TSG101與多種蛋白(泛素、Nedd4、ARMMs、Tom1、Gag、VP40、NP等)的相互作用進而輔助病毒出芽的機制，以及TSG101抑制劑的研究等方面進行闡述。

TSG101;UBC ;病毒出芽;抗病毒靶點

TSG101基因是1996年由Li等在鼠成纖維細胞3T3中發(fā)現(xiàn)的，因具有抑制腫瘤的功能，被命名為腫瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101,TSG101)。該基因的表達產(chǎn)物TSG101蛋白是細胞內(nèi)體分選復(fù)合物-I (Endosomal sorting complexes required for transport-I, ESCRT-I)的組成部分, TSG101蛋白在細胞液泡蛋白分選途徑(vacuolar protein sorting,Vps)中起著重要作用，是細胞正常生理功能必須的，其表達過多或過少都會影響細胞的正常生命活動。隨著研究的逐漸深入，人們發(fā)現(xiàn)TSG101和病毒有密切關(guān)系，現(xiàn)將其綜述如下。

1 TSG101基因與蛋白的結(jié)構(gòu)

人類TSG101基因位于人類 11號染色體 p1511-p1512，基因組全長46.63 kb，包括10個外顯子，mRNA全長1 550 bp，通過轉(zhuǎn)錄翻譯，生成含有 390個氨基酸殘基、相對分子質(zhì)量為 46 kDa的人TSG101蛋白。人TSG101與小鼠TSG101有94%的同源性，兩者之間只存在20個不相一致的氨基酸和一個間隙。這些都表明人和鼠的TSG101基因都具有高度保守的全長結(jié)構(gòu)。人TSG101蛋白由N端至C端在結(jié)構(gòu)上可分為4個主要功能區(qū)[1](圖1)：第一個功能區(qū)為N端的UEV結(jié)構(gòu)域(ubiquitin E2 variant)，這一結(jié)構(gòu)域與泛素結(jié)合酶UBC(Ubiquitin-conjugated domain)具有明顯的同源性，但其缺少UBC執(zhí)行功能所必須的氨基酸半胱氨酸；第二個功能區(qū)為富含脯氨酸區(qū)域 (proline rich region, PRR)，此區(qū)為轉(zhuǎn)錄調(diào)控的活性區(qū)域；第三個功能區(qū)為一個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域CC(coiled-coil domain)，此結(jié)構(gòu)域中的DNA結(jié)合單元具有轉(zhuǎn)錄因子特性；第四個功能區(qū)為C端的羥基末端卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的保守序列SB區(qū)(steadiness box domain)，該區(qū)域能夠調(diào)節(jié)甾類激素受體的轉(zhuǎn)錄活性。

圖1 人TSG101基因結(jié)構(gòu)模式圖Fig.1 Genetic structure of human TSG101

2 TSG101對病毒的作用

大部分包膜病毒出芽都需要從宿主細胞中獲取包膜，這就需要ESCRT的參與。ESCRT是四聚體蛋白復(fù)合物，分別為ESCRT-0、I、II、III。這些成員輔助病毒形成多泡體(multivesicular body,MVB)時細胞膜的分裂，介導(dǎo)病毒顆粒從宿主細胞的釋放。TSG101蛋白是ESCRT-I的組成單位之一，ESCRT-I由TSG101、VPS28、VPS37、MVB(最新發(fā)現(xiàn))4個亞基組成[2]。ESCRT與TSG101蛋白涉及HIV從細胞內(nèi)的出芽過程，并且在Vps中起重要作用，其主要功能是識別泛素化的物質(zhì)，并且也被證明是多種病毒體出芽過程中不可或缺的?，F(xiàn)今研究認為，ESCRT-I和III的招募是病毒出芽所必需的，在出芽的后期和ESCRT裝置的再循壞利用需要AAA-ATPase VPS4的作用。

在病毒的出芽過程中，內(nèi)體小泡的形成是不可缺少的。Thomas 等[3]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)體小泡的形成是ESCRT依賴的，因為這個過程被hVps4的K173Q顯性失活突變體抑制。TSG101通過作用于正性調(diào)節(jié)者，從而控制內(nèi)體小泡的形成。Luyet等[4]發(fā)現(xiàn)，TSG101介導(dǎo)受體分選到多泡體，對于病毒包膜與核內(nèi)體膜融合和病毒RNA轉(zhuǎn)運到多泡體(也就是晚期內(nèi)體,late endosomes,LEs)不是必需的，但對于感染是必需的。與ESCRT-0成分Hrs相比，TSG101在介導(dǎo)核衣殼從多泡核內(nèi)體釋放到胞質(zhì)中的過程中起直接作用，大概是通過控制后融合過程。TSG101通過與Hrs和Alix (細胞內(nèi)宿主蛋白ALG-2相關(guān)作用蛋白X,ALG-2 interacting protein X)選擇性相互作用，連接受體分選和溶酶體靶向到后融合的過程,這個過程參與病毒衣殼的釋放。

2.1 TSG101與HIV

人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)的生命周期需要從宿主細胞蛋白和通路中獲得廣泛的幫助，其病毒顆粒包含 3種必要的結(jié)構(gòu)蛋白，其中 Gag蛋白是含量最豐富的蛋白質(zhì)，大約構(gòu)成了病毒結(jié)構(gòu)蛋白的85%，而且是在病毒顆粒形成過程中唯一必需的蛋白質(zhì)，Gag蛋白在質(zhì)膜中的裝配過程是HIV病毒顆粒生產(chǎn)的驅(qū)動力。有研究發(fā)現(xiàn)HIV病毒的成熟和釋放依賴于細胞中TSG101的表達[5]，TSG101被獨特地暴露在HIV感染細胞的外膜，且在HIV病毒體出芽過程中通過與Gag蛋白結(jié)合招募ESCRTIII到出芽的部位，從而形成一個復(fù)雜的細胞蛋白裝置幫助HIV病毒顆粒的釋放。消耗病毒感染細胞中的TSG101將導(dǎo)致HIV病毒顆粒的出芽缺陷。Leyla等[6]研究發(fā)現(xiàn)，TSG101在輔助耐藥株和猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)從感染細胞內(nèi)出芽的過程中也扮演著同樣的角色。

2.2 TSG101與其他病毒

EB病毒 (Epstein-Barr virus,EBV)編碼的早期蛋白Rat通過超激活一個裂解性基因表達的級聯(lián)控制著病毒裂解性感染程序的再活化。Chua 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，TSG101對Rat介導(dǎo)的L-基因活性的激活在EBV裂解性感染周期的完成中起重要作用。TSG101通過在漿膜組裝的晚期病毒包膜多泡體分選過程中發(fā)揮作用，從而進一步促進EBV的復(fù)制。

甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)的出芽過程現(xiàn)今被認為是非ESCRT依賴的，但并不意味著TSG101不影響IAV的出芽。血凝素HA是IAV包膜蛋白中的一種，分布在病毒的表面，決定了流感病毒的感染部位在呼吸道。在IAV出芽的過程中若耗竭胞質(zhì)中TSG101蛋白則會導(dǎo)致HA不能從高爾基復(fù)合體中順利送往細胞膜，不能對子代病毒進行包被，從而影響病毒的出芽[8]。

馬爾堡病毒(Marburg virus, MARV)感染后的宿主細胞會表達基質(zhì)蛋白VP40，TSG101與VP40相互作用在病毒樣顆粒(Virus Like Particles,VLPs )出芽中起重要作用。VP40也是埃博拉病毒(Ebola virus, EBO)編碼數(shù)量最多的結(jié)構(gòu)蛋白，功能類似于反轉(zhuǎn)錄病毒中的Gag蛋白，通過與TSG101蛋白特異性結(jié)合對病毒的裝配和出芽過程起驅(qū)動作用。

此外，有研究表明，禽類肉瘤病毒(avian sarcoma virus, ASV)[9]、乙肝病毒(Hepatitis B Virus)[10]、胡寧阿根廷出血熱病毒[11](Junin Argentine hemorrhagic fever virus)等病毒的出芽也與TSG101蛋白表達密切相關(guān)。

3 TSG101對病毒的作用機制

3.1 TSG101與泛素

ESCRT復(fù)合物參與泛素化蛋白質(zhì)的降解，ESCRT對已泛素化蛋白質(zhì)的識別和處理能力預(yù)示著ESCRT依賴的病毒的釋放有可能受泛素化的控制[12-16]。就HIV病毒而言，去泛素化的TSG101蛋白對于Alix非依賴的病毒粒子釋放過程是抑制的。而對于無TSG101表達的馬傳染性貧血病毒(EIAV)來說，病毒顆粒的釋放依靠Alix途徑，該途徑同樣受去泛素化的Alix的制約。不僅如此，去泛素化Gag蛋白的存在也是阻止病毒顆粒釋放的重要原因之一。雖然沒有直接的證據(jù)說明泛素和病毒出芽有關(guān)，但是近些年越來越多的發(fā)現(xiàn)支持此觀點。

3.2 TSG101與Nedd4

Nedd4蛋白家族屬于泛素連接酶的一種，在各種形式的蛋白質(zhì)翻譯后修飾(post-translational modifications, PTM)的過程發(fā)揮重要作用。Nedd4參與病毒出芽過程已經(jīng)得到證實，如HIV病毒[17]、貓免疫缺陷病毒(FIV)[18]、禽類肉瘤病毒[9]、鼠白血病病毒(MLV)[19]等。

實驗證明，當(dāng)獼猴受到猴免疫缺陷病毒感染后，胞漿內(nèi)Nedd4水平會大幅度提升。有研究發(fā)現(xiàn)TSG101蛋白與Nedd4結(jié)合從而招募Gag與TSG101蛋白的復(fù)合體進入晚期內(nèi)體[20]。免疫共沉淀技術(shù)(Co-Immunoprecipitation)可從感染細胞的胞漿中分離出Nedd4與TSG101蛋白的復(fù)合物，兩者結(jié)合的機制還需進一步實驗證明。TSG101和Nedd4也可分別通過與Gag蛋白結(jié)合促進子代病毒的釋放，并且TSG101在促進病毒出芽過程中在一定程度上可代替Nedd4的功能[9]。

3.3 TSG101與ARMMs

Joseph等[21]發(fā)現(xiàn)了一個內(nèi)在的細胞機制導(dǎo)致超微小泡從質(zhì)膜直接釋放，該過程被證明病毒通過非MVB依賴的途徑在質(zhì)膜表面直接出芽(direct plasma membrane budding,DPMB)。輔助蛋白ARRDC1(arrestin domain-containing protein 1)通過它的捕獲子結(jié)構(gòu)域定位在質(zhì)膜上，與PASP作用后致使TSG101的定位從內(nèi)體轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜上，并且介導(dǎo)包含TSG101蛋白、ARRDC1和其他細胞蛋白的超微小泡釋放。不同于外生體來源于多泡體，ARRDC1介導(dǎo)的超微小泡(ARRDC1-mediated microvesicles, ARMM)缺乏已知多泡體標志。ARMM的形成需要VPS4-ATP酶，并且被E3連接酶WWP2加強，此酶與ARRDC1作用并且使ARRDC1泛素化。研究表明，DPMB正是由TSG101與ARRDC1的四肽PASP結(jié)構(gòu)域的特異相互作用驅(qū)動的。降低感染細胞內(nèi)ARRDC1蛋白水平會導(dǎo)致病毒出芽缺陷。此機制被證明與許多病毒有關(guān)，包括HIV。HIV的Gag蛋白和其他病毒蛋白正是模仿了ARRDC1促進超微小泡釋放的機制來介導(dǎo)子代病毒從宿主細胞中的釋放。

3.4 TSG101與Gag蛋白的P6區(qū)域

在病毒出芽的過程中，病毒蛋白酶裂解Gag 產(chǎn)生一系列新的病毒蛋白和間隔肽 (spacer peptide, SP)。這些新蛋白分別稱為基質(zhì)蛋白 (matrix, MA)、衣殼蛋白 (capsid, CA)、SP1、核衣殼蛋白 (nucleocapsid, NC)、 SP2 和p6, 這些蛋白質(zhì)重排產(chǎn)生成熟感染性病毒顆粒。P6蛋白的L區(qū)攜帶著富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域的高度保守的“PTAP”(Pro-Thr-Ala-Pro)氨基酸序列[22]。此序列與TSG101蛋白特異性結(jié)合招募ESCRT-I到病毒出芽位點，繼而招募ESCRT-II和ESCRT-III到內(nèi)涵體膜上以輔助病毒顆粒出芽。

Susan等[23]發(fā)現(xiàn)，HIV中P6的保守氨基酸殘基S40若發(fā)生突變不但會影響Gag蛋白的成熟，而且還對HIV出芽過程有著廣泛的影響。

3.5 TSG101與Tom1

Yuko等[24]發(fā)現(xiàn)，Tom1(target of Myb1)有TSG101的潛在結(jié)合序列，此結(jié)合序列是多泡體MVB形成的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。Tom1和其家族蛋白Tom1L1(target of Myb 1-like 1)、Tom1L2共有GAT結(jié)構(gòu)域。研究表明Tom1L1中GAT結(jié)構(gòu)域與泛素特異性結(jié)合對已泛素化的蛋白質(zhì)分選后送往MVB的過程中起重要作用。GAT 結(jié)構(gòu)域中的PYAP序列和C端的PSAP序列負責(zé)Tom1L1與TSG101的UEV結(jié)構(gòu)域 結(jié)合從而影響病毒出芽，并且Tom1L1依靠TSG101在胞質(zhì)分裂期間與核內(nèi)體和中間體聯(lián)合。

3.6 TSG101與VP40

馬爾堡病毒(Marburg virus,MARV)在質(zhì)膜的裝配期間，核衣殼被基質(zhì)蛋白VP40和包含跨膜糖蛋白(glycoprotein,GP)的病毒包膜包裹。VP40中的PPPY序列是MARV出芽的關(guān)鍵。Urata等[25]研究發(fā)現(xiàn)PPPY結(jié)構(gòu)域通過使NP和GP的共表達在相當(dāng)大程度上增加了VLPs的產(chǎn)生。在MARV中，TSG101與VP40相互作用取決于PPPY域。與馬爾堡病毒不同的是，埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)VP蛋白的N端有PTAP和PPEY兩個與TSG101結(jié)合的區(qū)域。TSG101首先直接或間接地與脂筏上(去垢劑不溶)的膜蛋白結(jié)合，然后招募VP40(分布在溶于去垢劑的區(qū)域)進入脂筏微區(qū)域，VP蛋白也對招募起促進作用并在此區(qū)域輔助病毒出芽。

3.7 TSG101與NP

根據(jù)重組表達，VP40單獨能夠誘導(dǎo)病毒樣顆粒VLPs的形成和釋放，這些VP40誘導(dǎo)的VLPs的釋放部分依賴于細胞ESCRT機制，這個機制與VP40中L-結(jié)構(gòu)域基序相互反應(yīng)。和NP的共表達很大程度上通過一個未知的機制提高了VP40誘導(dǎo)的VLPs的出芽。存在于NP中的L-結(jié)構(gòu)域?qū)LPs的釋放是有影響的。ESCRT-I蛋白TSG101被NP招募到NP誘導(dǎo)的核周區(qū)域包含體中，在VP40存在的情況下，NP然后被招募到VP40陽性的細胞膜簇上，轉(zhuǎn)而，通過一個NP中C端的PASP L-結(jié)構(gòu)域基序招募TSG101。這個PASP結(jié)構(gòu)域也介導(dǎo)TSG101結(jié)合到VLPs的增加，并且它的缺失很大程度上減少了NP在VLPs釋放上的正性作用。總而言之，NP通過一個PASP L-結(jié)構(gòu)域基序招募TSG101到VP40陽性出芽部位，從而提高VLPs的出芽[26]。

3.8 TSG101與PI(4,5)P2/Ca2+信號通路

Ehrlich等[27]研究發(fā)現(xiàn)，TSG101通過調(diào)控PI(4,5)P2/Ca2+信號通路來影響Gag的合成，細胞內(nèi)Ca2+不僅對Gag在細胞膜上的定位起穩(wěn)定作用，而且對子代病毒的生成和釋放有促進作用。磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(phospholipase C,PLC)可將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(phosphatidyalinosital-4,5-diphosphate,PIP2)分解成重要的第二信使-二脂酰甘油(diacylglycerol,DAG)和肌醇三磷酸(inositol-1,4,5-triphosphate,IP3)。IP3是水溶性分子，可擴散到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，并與其受體結(jié)合。IP3的受體是IP3控制的Ca2+通道，結(jié)合IP3后開放，促進細胞鈣庫內(nèi)的Ca2+迅速釋放。研究發(fā)現(xiàn)在細胞內(nèi)Ca2+升高的同時細胞內(nèi)Gag蛋白表達水平也上升，對Ca2+的進一步釋放有誘導(dǎo)作用，并且防止Ca2+濃度過高。Gag對Ca2+的調(diào)控能力必須經(jīng)過PTAP序列和TSG101蛋白結(jié)合之后才具備。綜上所述，TSG101通過賦予Gag蛋白調(diào)節(jié)細胞中Ca2+濃度的能力進而影響Gag蛋白的合成和病毒的釋放。

4 TSG101抑制劑的研究

HIV病毒顆粒從感染細胞中釋放是通過招募正常情況下介導(dǎo)宿主細胞內(nèi)吞作用功能的蛋白完成，這個過程需要HIV Gag蛋白與宿主細胞蛋白的相互作用。Tavassoli等[28]運用細菌逆向雙雜交系統(tǒng)(bacterial reverse two-hybrid)篩選環(huán)肽庫(cyclic-peptide library)的方法,找到能干擾TSG101與HIV Gag蛋白結(jié)合并抑制HIV病毒出胞的肽適體(aptamer)。肽適體是人工體外合成的一段寡核苷酸序列，有與靶分子結(jié)合的極高的親和力和特異性。肽適體與HIV轉(zhuǎn)錄正調(diào)控蛋白Tat相連后能穿過培養(yǎng)的人類細胞膜，通過消減TSG101來抑制這些細胞產(chǎn)生VLPs。該實驗通過肽適體干擾TSG101-Gag的結(jié)合、減少VLPs的釋放的方式達到治療HIV感染的目的，肯定了小分子肽類藥物阻斷病毒與宿主蛋白分子相互作用在抗HIV治療上的重要意義。Leyla等[6]研究發(fā)現(xiàn)，由于TSG101被獨特地暴露在HIV感染細胞的外膜，所以TSG101的特異抗體，例如CB8-2，能夠與TSG101特異性結(jié)合從而減少感染細胞中病毒的產(chǎn)生，因此TSG101可以作為基因治療的靶點。

5 結(jié) 語

TSG101作為病毒出芽過程中一個必要的宿主細胞因子與HIV、IAV、MARV、EB、ASV等病毒的出芽有關(guān)，并且通過與泛素、Nedd4、ARMMs、P6、Tom1等相互作用來影響病毒出芽，由此成為病毒在體內(nèi)擴散傳播的門檻。根據(jù)它的作用機理設(shè)計出相應(yīng)的病毒抑制劑，將可能在抗病毒藥物研究中有新的突破。到目前為止，人類對TSG101基因的研究還處于探索階段,TSG101與其他病毒是否也存在某種關(guān)系，這種關(guān)系是否有特異性，TSG101抑制劑是否可以有效地預(yù)防疾病等，所有的疑問都需要進一步研究。

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The Action and Mechanism of TSG101 during Virus Budding

XU Yan1, ZHANG Ying2

(1.ClinicalMedicSeven-yearProgram,ChinaMed.Uni.,Shenyang110000;2.The3rdExperim'lTechnol.Ctr.,ChinaMed.Uni.,Shenyang110013)

TSG101 gene is a newly discovered candidate of tumor suppressor genes and locates in the human chromosome XI p1511-p1512. Its product TSG101 protein N-terminal region is isogenous with ubiquitin-conjugated domain (UBC). It was found in recent studies that TSG101 has many important functions and it is closely associated with viral budding, therefore, TSG101 would be a useful anti-virus target for drug design. The role of TSG101 played in the process of virus budding (such as HIV, IAV, MARV, ASV), the mutual action mechanism of TSG101 and proteins (ubiquitin, Nedd4, ARMMs, Tom1, Gag, VP40, NP etc.) in assisting virus budding, and TSG101 inhibitors and other aspects were elaborated in this paper.

TSG101; UBC; virus budding; anti-virus target

遼寧省自然科學(xué)基金項目(2014021095)；沈陽市科學(xué)技術(shù)項目(F12-264-4-01)

許巖 女，七年制本科生。研究方向為分子病毒學(xué)。E-mail: 576599259@qq.com

* 通訊作者。女，講師，醫(yī)學(xué)博士。研究方向為TSG101基因與病毒的關(guān)系。Tel：024-31939617，E-mail：20769876@163.com

2015-04-17；

2015-07-15

Q939.4

A

1005-7021(2015)06-0090-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.06.018