2株可感染大腸埃希菌工程菌的噬菌體的鑒定與分析

邢 穎， 朱芷葳， 張利環(huán)， 侯燕平， 范 華， 李慧鋒*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，山西 太谷 030801)

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2株可感染大腸埃希菌工程菌的噬菌體的鑒定與分析

邢 穎1， 朱芷葳1， 張利環(huán)1， 侯燕平2， 范 華2， 李慧鋒1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，山西 太谷 030801)

大腸埃希菌來源的基因工程菌是應(yīng)用最為頻繁的工程菌，但在基因工程菌規(guī)模化制備生物活性制劑的過程中常常會(huì)被噬菌體感染。通過對(duì)雞糞中噬菌體大量篩選及鑒定，對(duì)工程菌防御相應(yīng)噬菌體感染機(jī)制開展基礎(chǔ)研究。實(shí)驗(yàn)以大腸埃希菌工程菌為宿主菌(CICC編號(hào)：10424)，采用雙層瓊脂平板法從雞場(chǎng)糞樣中分離噬菌體，結(jié)果獲得2株噬菌體，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。經(jīng)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)一株(CX)為短尾噬菌體，其頭部外廓呈長(zhǎng)六角形，非收縮性尾部，其噬菌斑清晰透亮，周圍無暈環(huán)，裂解性較強(qiáng)；另一株(B1X)為長(zhǎng)尾科噬菌體，其噬菌斑呈雙層環(huán)狀，中心澄清透明，直徑約0.8～1.3 mm，外環(huán)呈半透明，云霧狀區(qū)域,寬約0.8～1.3 mm?？蛇M(jìn)一步研究這2株噬菌體的侵染機(jī)制。

噬菌體；大腸埃希菌；雙層平板法；工程菌

噬菌體作為細(xì)菌病毒，最早由英國(guó)細(xì)菌學(xué)家Twort[1]和加拿大細(xì)菌學(xué)家D′Herelle[2]分別于1915年和1917年發(fā)現(xiàn)，在自然界中廣泛存在，凡是有細(xì)菌的場(chǎng)所，就可能有相應(yīng)噬菌體的存在，其對(duì)維持自然界微生物的動(dòng)態(tài)平衡起著重要作用。據(jù)估計(jì)，在生物圈內(nèi)噬菌體種類繁多，形態(tài)各異，高達(dá)1031多種，而目前已經(jīng)被描述的卻僅有5 000多種，分離和鑒定新的噬菌體物種仍然任重道遠(yuǎn)[3]?；蚬こ叹菓?yīng)用基因工程技術(shù)，按照人為設(shè)計(jì)對(duì)基因或基因的部分進(jìn)行定向重組所構(gòu)建的，能夠在特定受體細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的重組微生物菌株。它是分子生物學(xué)研究與應(yīng)用中重要的生物學(xué)工具與材料，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究、食品工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)牧業(yè)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域[4]。1998年,Y .Zhang等[5]首先將重組技術(shù)應(yīng)用于大腸埃希菌。目前，大腸埃希菌基因工程菌是應(yīng)用最廣泛、最成功的表達(dá)體系，常被作為高效表達(dá)的首選載體。但是在應(yīng)用基因工程菌大量培養(yǎng)時(shí)，常常會(huì)被噬菌體感染，一旦被感染，造成的損失將是不可估計(jì)的。目前對(duì)大腸埃希菌工程菌噬菌體的相關(guān)研究較少，通過對(duì)雞糞中噬菌體大量篩選及鑒定，為防御相應(yīng)類型的噬菌體感染提供一定的依據(jù)。本研究選取山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存的1株大腸埃希菌工程菌為宿主菌，從雞糞中篩選相應(yīng)噬菌體，結(jié)果分離到2株噬菌體，對(duì)其進(jìn)行鑒定，得到相關(guān)的實(shí)驗(yàn)資料，以期為有效防御大腸埃希菌工程菌的感染制定合理完善的措施和策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 本實(shí)驗(yàn)室-20 ℃甘油凍存的大腸埃希菌菌株(CICC編號(hào)：10424)，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,為非模式菌株；致病性沙門氏菌菌株(CICC編號(hào)：21510)，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；收集山西省晉中市太谷縣孟家莊雞場(chǎng)糞樣2份，分別記為1號(hào)樣、2號(hào)樣，采樣溫度為27 ℃，pH 7.0。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 ①營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂糖15 g，加蒸餾水至1 000 mL, pH 6.8～7.0；②上層瓊脂培養(yǎng)基：胰蛋白胨17 g，大豆蛋白胨3 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鈉和葡萄糖各2.5 g，瓊脂糖8 g，加蒸餾水至1 000 mL, pH 6.8～7.0；③液體肉湯培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，加蒸餾水至1 000 mL, pH 6.8～7.0；④TSB：胰蛋白胨17 g，大豆蛋白胨3 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鈉2.5 g，葡萄糖2.5 g；⑤2.5%戊二醛溶液用于透射電鏡樣品制備。

1.1.3 主要儀器 DH5000 AB型電熱恒溫培養(yǎng)箱，立式壓力蒸汽滅菌鍋，HZ-9212S型恒溫振蕩器，JEM-2010型透射電鏡，6L-206-II型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 糞樣的初步處理及菌懸液制備 取20 mL糞樣于燒杯中，加入20 mL生理鹽水稀釋，制成懸液，1 000×g離心5 min，取上清液，0.22 μm濾膜過濾制成糞水濾液備用。

1.2.2 宿主菌的準(zhǔn)備 用接種環(huán)挑取凍存的大腸埃希菌，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線分離，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h。將大腸埃希菌復(fù)蘇后，接種于10 mL液體營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)約12 h至對(duì)數(shù)期，制成菌懸液備用。

1.2.3 噬菌體的初步鑒定 采用雙層平板法，取200 μL對(duì)數(shù)期的宿主菌液與100 μL糞水濾液混合于4 mL上層半固培養(yǎng)基中，充分混勻后迅速倒入已準(zhǔn)備好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，傾斜旋轉(zhuǎn)平皿使其分布均勻，待瓊脂凝固后，37 ℃倒置培養(yǎng)4～12 h，觀察結(jié)果。

1.2.4 噬菌體的純化增殖 當(dāng)有噬菌斑出現(xiàn)時(shí)，用10 μL槍頭挑取單個(gè)噬菌斑接種到相應(yīng)的宿主菌培養(yǎng)物中，37 ℃、130 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h，擴(kuò)增噬菌體。然后在290×g下離心5 min，過濾除菌，無菌取上清液后，制作雙層平板，再次得到噬菌斑，根據(jù)所形成的噬菌斑的形態(tài)，依據(jù)上述方法反復(fù)純化5次以上，直至得到形態(tài)、大小均一的噬菌斑，即為同一噬菌體所形成的空斑。

1.2.5 噬菌體的形態(tài)觀察 取樣品懸液20 μL滴于微孔銅片上，15 min左右待樣品進(jìn)入微孔中，用濾紙吸去多余液體，再滴加2%磷鎢酸(PTA)負(fù)染10 min后，用濾紙吸去多余染液，干燥后在透射電鏡下觀察其形態(tài)。

1.2.6 噬菌體效價(jià)(滴度)測(cè)定 用TSB作稀釋液，將純化后的噬菌體原液作連續(xù)10倍稀釋，分別取100 μL加入200 μL相應(yīng)宿主菌，再加入4 mL已溶化的60 ℃左右的半固體培養(yǎng)基，振蕩使其充分混勻，采用雙層瓊脂平板法，觀察噬菌斑的生長(zhǎng)情況。上述每個(gè)稀釋度分別做3個(gè)重復(fù)。計(jì)數(shù)時(shí)，選取噬菌斑數(shù)為30～300個(gè)的稀釋度平板，然后取適當(dāng)稀釋度3個(gè)重復(fù)的平均數(shù)，以計(jì)算噬菌體的滴度。

噬菌體的效價(jià)(PFU/mL)=稀釋倍數(shù)×平均噬菌斑數(shù)×10

1.2.7 噬菌體宿主范圍的測(cè)定 細(xì)菌菌株有大腸埃希菌菌株及沙門氏菌菌株。取100 μL濃度為1010PFU/mL的噬菌體裂解液分別與200 μL不同的待測(cè)菌懸液混合，按雙層平板法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體分離結(jié)果

采用雙層平板法驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌被侵染，出現(xiàn)大量噬菌斑(圖1)，圓形、邊緣整齊，直徑0.9～2.6 mm，呈蠶蝕狀，推測(cè)糞樣中含有能裂解大腸埃希菌的噬菌體。

圖1 初次分離到的噬菌斑Fig.1 First isolated purified bacteriophage plaque

2.2 噬菌體的純化

采用雙層平板法反復(fù)純化，直至得到的噬菌斑形態(tài)、大小均一。根據(jù)噬菌斑的形狀和大小可分為兩類，CX是直徑約2.4 mm，圓形清晰透亮、邊緣整齊、無暈環(huán)，呈現(xiàn)出典型的烈性噬菌體的噬菌斑特征(圖2A)；B1X是直徑約1.6～2.6 mm，噬菌斑呈雙層環(huán)狀，中心澄清透明直徑約0.8～1.3 mm，外環(huán)呈半透明云霧狀區(qū)域(寬約0.8～1.3 mm)，邊緣不清晰(圖2B、2C)。

2.3 噬菌體效價(jià)(滴度)測(cè)定

通過雙層瓊脂平板法測(cè)定可知，分離出的1株噬菌體的效價(jià)為5.04×109PFU/mL，噬菌斑為圓形透明。另一株噬菌體的效價(jià)為4.48×1010PFU/mL，噬菌斑呈雙層環(huán)狀。

2.4 噬菌體形態(tài)、大小

經(jīng)透射電鏡觀察，根據(jù)大小、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，可將所得到的噬菌體分為兩類，CX是蝌蚪狀非收縮尾的噬菌體，平面觀察頭部大致呈長(zhǎng)六角形，頭長(zhǎng)徑(L)約37 nm，頭橫徑(W)約26 nm，L/W=1.4，非收縮性尾部，尾長(zhǎng)約15 nm，尾寬約7 nm，

圖2 純化后的噬菌斑Fig.2 Purified bacteriophage plaqueA(CX)中用方形標(biāo)出的為圓形透明的噬菌斑，B和C(B1X)中用圓形標(biāo)出的為雙層環(huán)狀的噬菌斑A(CX) indicated by a circular transparent square plaques,B and C(B1X) indicated by a double ring plaques

為短尾噬菌體，噬菌斑為圓形清晰透亮(圖3A)；B1X是蝌蚪狀非收縮尾的噬菌體，其頭部平面輪廓為六角形,頭長(zhǎng)徑(L)約55 nm，頭橫徑(W)約65 nm，L/W=1.2，無囊膜，有尾鞘，尾長(zhǎng)約127 nm，寬約11 nm，噬菌斑呈雙層環(huán)狀(圖3B)。

按照Bradley和Ackermann形態(tài)分類法分類，噬菌體CX屬于C形態(tài)群，根據(jù)ICTV病毒分類第九次報(bào)告，屬于有尾病毒目(Caudovirales)，短尾病毒科(Podoviridae)；噬菌體B1X屬于B1形態(tài)群，根據(jù)ICTV病毒分類第九次報(bào)告，屬于有尾病毒目(Caudovirales)，長(zhǎng)尾病毒科(Siphoviridae)。

圖3 電鏡下的噬菌體CX(A)和B1X(B)Fig.3 Bacteriophage2CX (A) and B1X(B) under electron microscope

2.5 噬菌體的宿主范圍

利用雙層平板法測(cè)定了噬菌體對(duì)不同腸道菌的敏感性，以1株致病性沙門氏菌(CICC編號(hào)：21510)作為宿主菌，結(jié)果沙門氏菌未被裂解。表明該噬菌體的宿主菌范圍相對(duì)較窄。

3 討 論

從雞糞樣中初次通過雙層平板法分離到2種噬菌斑，再進(jìn)一步做雙層平板試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這兩種噬菌體的生長(zhǎng)時(shí)間、形成噬菌斑的大小、形態(tài)以及裂解的程度都不相同，可以判定其為兩種不同的噬菌體。

根據(jù)噬菌體與宿主的關(guān)系，噬菌體分為烈性和溫和噬菌體兩類[6]。烈性噬菌體(Virulent phage)侵入宿主菌后，可在其體內(nèi)快速增殖，并使之裂解，在固體培養(yǎng)基上形成清晰透亮的溶菌空斑，即透明噬斑。溫和噬菌體則是當(dāng)它侵入宿主菌后，不裂解宿主菌，而是將其基因整合到宿主菌的基因組中或以質(zhì)粒的形式存在，和宿主核酸同步復(fù)制，在固體培養(yǎng)基上形成混濁的半透明斑[7]。

如果在雙層平板上形成的噬菌斑直徑大于2 mm、而且噬菌斑的邊緣比較清晰，則可以認(rèn)為是噬菌體具有較強(qiáng)裂解性[8]。2014年李冰等[9]分離出的1株大腸埃希菌O18雞源噬菌體，因形成的噬菌斑大多數(shù)為完全裂解，結(jié)果推測(cè)出該噬菌體為烈性噬菌體。觀察本研究分離出的2株噬菌體，其中1株噬菌體CX的噬菌斑清晰透亮、邊緣整齊，直徑約2.4 mm，噬菌體效價(jià)為5.04×109PFU/mL，為短尾噬菌體。因其噬菌斑直徑大于2 mm，噬菌斑又具有典型烈性噬菌斑的特征，故可認(rèn)為該噬菌體有較強(qiáng)的裂解性。2008年郭秋菊等[10]從生活污水中分離的3株大腸埃希菌噬菌體，其中1株為短尾噬菌體，頭部為二十面體，大小為20 nm，尾部長(zhǎng)約2～3 nm。2009年馬翔宇等[3]分離出的新型多價(jià)大腸埃希菌噬菌體，經(jīng)透射電鏡觀察呈微球型，屬短尾病毒科。本研究分離出的1株噬菌體CX也為短尾噬菌體。

本研究分離出的另一株噬菌體B1X的噬菌斑直徑約1.6～2.6 cm，呈雙層環(huán)狀，效價(jià)為4.48×1010PFU/mL，由圖3B的透射電鏡照片可見，噬菌體由多面體頭部及尾部組成，為蝌蚪狀非收縮尾的噬菌體。尾長(zhǎng)約127 nm，寬約11 nm，呈波浪狀彎曲。毛普加等[11]分離的甲型副傷寒沙門菌噬菌體在電鏡下觀察為典型的噬菌體形態(tài)，也是由一個(gè)頭部和長(zhǎng)尾組成。

噬菌體的分離率有明顯的季節(jié)性，如果從動(dòng)物體外的環(huán)境中分離，則在溫暖的季節(jié)，噬菌體的檢出率相對(duì)較高[12]。Jamalludeen曾報(bào)道[13]，從加拿大安大略省38個(gè)豬場(chǎng)污水分離大腸埃希菌噬菌體時(shí)，6～8月的分離率明顯高于4月和5月。代保英[14]在10月、11月于江蘇省揚(yáng)州市釆集了100多份樣品，只分離出3株噬菌體，其結(jié)果可說明天氣寒冷時(shí)噬菌體檢出率不高。本研究篩選是在7月到次年5月期間，7月份篩選出的噬菌體裂解性較強(qiáng)，而到11月份同樣再篩選時(shí)，裂解性強(qiáng)的那株就沒篩選出，推測(cè)寒冷季節(jié)時(shí)，不容易篩選出裂解性較強(qiáng)的噬菌體。

噬菌體與人類實(shí)踐的關(guān)系極為密切，可用于生物防治、疫菌生產(chǎn)和作為遺傳工程中的外源基因載體等，直接或間接地為人類創(chuàng)造出巨大的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和生態(tài)效應(yīng)。然而噬菌體污染又會(huì)帶來許多不利影響。本研究通過篩選分離到2株噬菌體并對(duì)其進(jìn)行分離鑒定，為進(jìn)一步研究防治大腸埃希菌噬菌體的感染提供參考。

致謝 感謝山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院唐中偉老師提供大腸埃希菌菌株。

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Identification & Analysis of TwoEscherichiacoliInfectable Phage Strains

XING Ying1, ZHU Zi-wei1, ZHANG Li-huan1, HOU Yan-ping2, FAN Hua2, LI Hui-feng1

(1.Coll.ofLifeSci., 2.Experim'lTeach.Ctr.,ShanxiAgric.Uni.,Taigu030801)

Genetic engineering bacteria (GEB) bred fromE.coliis frequently used GEB. However, bacteriophage infection is a common for culturing GEB in large-scale during the process of bio-active preparation. By screening and identifying phages by the gross from chicken manure, so as to carry out some basic studies on relevant phage infection mechanisms for the GEB defense. In this experiment, isolation method of double layer agar plate was used to separate the phages from chicken manure samples and anE.coliengineering bacteria (CICC code: 10424) was used as a host bacterium for phage isolation. As a result two phage strains were isolated and identified their morphologies. The images of transmission electron microscopy revealed that one strain (CX) is a Podoviridae phage that with a hexagonal head and a non-contractile tail. Its plaque was clear and transparent, without halo around, and with strong splitting character. Another strain (B1X) is a Siphoviridae phage that could form plaques (0.8～1.2 mm in diameter) present a double ring with a limpid center surrounded by a translucent loop (0.8～1.3 mm in diameter). It might be a phage with moving capability. The infection mechanism of these two phages can be further studied.

bacteriophage;Escherichiacoli; double-plate; genetic engineering bacteria (GEB)

國(guó)家自然科學(xué)基金(31172203)；山西省青年科技研究基金(2011021028-1)

邢穎 女，碩士研究生。研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。E-mail:xingying819@163.com

* 通訊作者。男，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師。主要從事動(dòng)物遺傳育種的研究。E-mail: lihuifengtom@163.com

2015-02-26；

2015-09-08

Q939.121

A

1005-7021(2015)06-0064-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.06.012