貫筋藤鮮莖中凝乳酶的提取工藝研究

王紅燕，陶 亮，2，陳 森，李 濤，黃艾祥*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院云南昆明650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院云南昆明650201）

貫筋藤鮮莖中凝乳酶的提取工藝研究

王紅燕1，陶 亮1，2，陳 森1，李 濤1，黃艾祥1*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院云南昆明650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院云南昆明650201）

以云南西北部地區(qū)的野生植物貫筋藤的鮮莖為原料，在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9（33）正交試驗(yàn)方法，以貫筋藤鮮莖中凝乳酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究了不同的預(yù)處理方式、料液比、浸泡時(shí)間、浸泡溫度對(duì)其提取工藝的影響，確定了貫筋藤鮮莖中凝乳酶的最佳提取條件和提取率。結(jié)果表明，貫筋藤鮮莖中凝乳酶的提取最佳條件為料液比1∶20（g∶m L），提取時(shí)間40 m in，提取溫度65℃，在此條件下得到的凝乳酶活力為260.984 SU/m L，提取率為31.35%。

貫筋藤；凝乳酶；提取工藝；酶活力；提取率

貫筋藤（Dregea sinensis Hemsl.var.corrugata（Schneid.）Tsiang et P.T.[1]為蘿藦科（Asclepiadaceae）南山藤屬（Dregea E.Mey.，nom.cons.）植物，攀援木質(zhì)藤本，俗稱“奶漿藤”。貫筋藤生長(zhǎng)于海拔500～3 000 m山地森林中或灌木叢中，主產(chǎn)于云南大理、麗江、昆明等地方[2]。據(jù)調(diào)查，在云南劍川縣、鶴慶縣用“奶漿藤”作為凝乳劑已有多年的歷史，貫筋藤在民間已作為一種天然凝乳劑應(yīng)用羊奶乳餅的生產(chǎn)。長(zhǎng)期以來(lái)在加工乳餅（有人稱之為“中國(guó)式奶酪”）時(shí)，其凝乳劑不是選用通常使用的酸水，而是使用野生植物貫筋藤莖桿水溶液作為凝乳劑，產(chǎn)品較常規(guī)酸凝法生產(chǎn)的乳餅具有更濃郁的清香風(fēng)味和較高的成品率。

隨著乳品行業(yè)的高速發(fā)展，人們對(duì)發(fā)酵乳制品的需求也日益增加。在干酪生產(chǎn)中，凝乳酶因其可以專一地切割乳中k-酪蛋白的苯丙氨酸（Phe）105-蛋氨酸（Met）106之間的肽鍵[3]，破壞酪蛋白膠束使牛奶凝結(jié)，并由蛋白水解作用產(chǎn)生特有風(fēng)味，成為重點(diǎn)研究的酶制劑。但由于小牛凝乳酶無(wú)法滿足現(xiàn)代工業(yè)的需求且成本較高，國(guó)內(nèi)外學(xué)者致力于尋找植物源凝乳酶的替代品，近年來(lái)，關(guān)于凝乳劑的研究較多，菠蘿蛋白酶[4]、刺菜薊[5]、生姜蛋白酶[6]等植物凝乳酶及其他凝乳劑[7-8]相繼被研究。

黃艾祥等[9-10]發(fā)明了貫筋藤天然植物凝乳劑，孫海蛟等[11-12]研究了貫筋藤中的凝乳活性物質(zhì)，都是以貫筋藤干莖為實(shí)驗(yàn)材料。本研究以貫筋藤鮮莖為原料，以其酶活力和提取率為指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化貫筋藤凝乳酶的提取工藝，確定貫筋藤鮮莖中凝乳酶的最佳提取條件和提取量，為尋找一種天然綠色植物凝乳劑及其替代品提供參考和理論依據(jù)，這對(duì)云南地方資源的開(kāi)發(fā)利用具有一定的推動(dòng)作用，同時(shí)對(duì)我國(guó)干酪產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也具有重大而深遠(yuǎn)的理論和現(xiàn)實(shí)意義[13]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貫筋藤鮮莖：采自云南大理州劍川縣，海拔2 000～3 000 m山地森林中或灌木叢中；山羊奶：昆明市易興恒畜牧科技有限公司種羊胚胎基地。

硫酸銨（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1700紫外可見(jiàn)光譜儀：日本島津公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；CP153電子天平：奧豪斯儀器有限公司；TDL-5-A離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；HI99161 pH計(jì)：意大利哈納儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī)：上海比朗儀器有限公司；78-2型磁力攪拌器：常州國(guó)華電器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 貫筋藤凝乳酶的提取工藝流程

貫筋藤鮮莖→洗滌→敲碎→浸泡→抽濾→離心→濃縮→鹽析→分級(jí)→透析→冷凍干燥→貫筋藤凝乳酶干粉→低溫保藏（-20℃）。

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1）貫筋藤凝乳酶水提液的制備

選取新鮮的粗細(xì)均勻的貫筋藤莖洗凈，均勻敲碎放入一定溫度的超純水中浸泡一段時(shí)間后取出，放置室溫條件下冷卻10 min，將水提貫筋藤后的浸泡液過(guò)120目4層紗布，過(guò)濾兩次，所得上清液即為含有凝乳成分的貫筋藤水提液。

（2）貫筋藤凝乳酶水提液的濃縮

貫筋藤水提液經(jīng)5 000 r/min離心15 min除雜后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)不同料液比提取的貫筋藤蛋白酶原液濃縮，得到10倍原貫筋藤質(zhì)量濃縮酶液，4℃冷藏24 h。

（3）貫筋藤凝乳酶的分級(jí)提取

取出冷藏24 h后的貫筋藤濃縮液，采用硫酸銨分級(jí)沉淀，4 000 r/min離心20 min。

（4）貫筋藤凝乳酶的透析除雜

樣品分別加入截留分子質(zhì)量（molecular weight cut off，MWCO）3 500 u的透析袋中，放置于大燒杯內(nèi)透析20 h，多次更換透析液。塑料燒杯收集透析后溶液放入-80℃冰箱迅速冷凍，然后放入真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，制得貫筋藤凝乳酶干粉。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

分別設(shè)置對(duì)貫筋藤鮮莖的預(yù)處理方式為粉碎、切片、敲斷、料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶m L）、浸泡溫度分別為35℃、45℃、55℃、65℃、75℃，浸泡時(shí)間分別為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 m in，以凝乳酶活力作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察各因素變量對(duì)貫筋藤鮮莖中凝乳酶活力的影響。

1.3.4 貫筋藤鮮莖中凝乳酶提取最佳條件的優(yōu)化

利用單因素試驗(yàn)探究不同的預(yù)處理方式、料液比例、浸泡時(shí)間、浸泡溫度對(duì)提取的貫筋藤鮮莖中凝乳酶活力的影響。在此基礎(chǔ)上選擇料液比、浸泡時(shí)間、浸泡溫度，進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)，以凝乳酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)方差分析優(yōu)化凝乳酶的最佳提取條件，正交試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

1.3.5 貫筋藤凝乳酶活力的測(cè)定

采用修正ARIMA K等[14]法，取50 m L新鮮山羊乳，加熱至85℃后恒溫下水浴，加入為羊奶體積35%（17.5 m L）的貫筋藤溶液，充分混合后繼續(xù)水浴。準(zhǔn)確記錄從加入貫筋藤溶液到羊乳凝固的時(shí)間。凝乳酶活力定義為：40 min凝固1 m L山羊乳的酶量（貫筋藤溶液用量）為1個(gè)索氏單位（Soxhelt unit，SU）。凝乳酶活力計(jì)算公式如下：

X=2 400×50×D/（t×17.5）

式中：X為凝乳酶活力，SU/m L；t為凝乳時(shí)間，m in；D為貫筋

藤溶液或粗酶液的稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 貫筋藤浸泡前預(yù)處理方式對(duì)凝乳酶活力的影響

選取粗細(xì)均勻的貫筋藤鮮莖，將其清洗干凈，分別經(jīng)過(guò)粉碎、切片、敲碎預(yù)處理后，測(cè)其水提液的凝乳酶活力，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同的處理方式對(duì)貫筋藤凝乳酶活力的影響Fig.1 Effect of different pretreatments methods on rennet activities

由圖1可知，不同的預(yù)處理方式對(duì)貫筋藤鮮莖的凝乳酶活力的影響不同，粉碎處理制作的貫筋藤水提液的凝乳酶活力為74.696SU/m L，明顯低于切片和敲碎的，其中敲碎處理的貫筋藤水提液凝乳酶活力最高，其活力為198.740SU/m L。由于快速粉碎處理會(huì)破壞貫筋藤鮮莖中的內(nèi)溶物，切片處理封閉、堵塞了貫筋藤植物莖稈的導(dǎo)管和篩管，導(dǎo)致在浸泡時(shí)凝乳酶浸出率低，凝乳酶活力低。為提高凝乳酶的活力，選擇貫筋藤鮮莖的預(yù)處理方式為敲碎。

2.1.2 料液比對(duì)貫筋藤凝乳酶活力的影響

料液比對(duì)貫筋藤凝乳酶活力的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 料液比對(duì)凝乳酶活力的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on rennet activities

由圖2可知，貫筋藤鮮莖中凝乳酶的活力隨料液比的增大而增加，當(dāng)料液比增大至1∶20（g∶m L）時(shí)，凝乳酶的活力達(dá)到220.009 SU/m L，繼續(xù)增大料液比，凝乳酶的活力略有增大，但變化較小，基本趨于穩(wěn)定，這是因?yàn)楫?dāng)料液比達(dá)到1∶20（g∶m L）時(shí)，酶已全部浸提出。因此選擇1∶20（g∶m L）的料液比為宜。

2.1.3 浸泡時(shí)間對(duì)貫筋藤凝乳酶活力的影響

浸泡時(shí)間對(duì)貫筋藤凝乳酶活力的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 浸泡時(shí)間對(duì)凝乳酶活力的影響Fig.3 Effect of extraction time on rennet activities

由圖3可知，貫筋藤鮮莖中凝乳酶的活力隨浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，當(dāng)浸泡時(shí)間達(dá)到40 m in時(shí)凝乳酶的活力最高為285.011 SU/m L，浸泡時(shí)間＞40 min凝乳酶的活力開(kāi)始降低。原因可能是浸泡時(shí)間過(guò)短，凝乳酶沒(méi)有完全溶解，當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)到一定程度時(shí)才全部溶解，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，凝乳酶的活力會(huì)在長(zhǎng)時(shí)間的保溫過(guò)程中逐漸減小，即酶的活力與在一定溫度下保持的時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)[15]，因此浸泡時(shí)間選擇40 min為宜。

2.1.4 浸泡溫度對(duì)貫筋藤凝乳酶活力的影響

浸泡溫度對(duì)貫筋藤凝乳酶活力的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4 浸泡溫度提取凝乳酶活力的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on rennet activities

由圖4可知，在一定溫度范圍內(nèi)，凝乳酶的活力隨著溫度的升高而增加。當(dāng)浸泡溫度達(dá)到65℃時(shí)，凝乳酶的活力最高為289.993 SU/m L，浸泡溫度＞65℃后凝乳酶的活力又隨溫度的升高而降低。這主要是因?yàn)殡S著溫度的升高，分子間的運(yùn)動(dòng)速度加快，凝乳酶易于溶解出來(lái)，但溫度過(guò)高會(huì)使凝乳酶變性，影響凝乳酶的活力[9]。所以65℃為凝乳酶提取的適宜溫度。

2.2 貫筋藤鮮莖中凝乳酶提取最佳條件的確定

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)貫筋藤鮮莖的凝乳酶提取條件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別選取料液比，浸泡時(shí)間和浸泡溫度，進(jìn)行3因素3水平L9（33）正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

由表2可知，3個(gè)因素中影響貫筋藤鮮莖中凝乳酶活力最主要的因素是浸泡溫度，其次是浸泡時(shí)間和料液比，即影響貫筋藤凝乳酶活力的因素次序?yàn)镃＞B＞A，提取凝乳酶的較優(yōu)水平組合是A2B2C3，即提取貫筋藤鮮莖中凝乳酶的最佳條件為料液比1∶20（g∶m L），浸泡時(shí)間40 min，浸泡溫度65℃，在此條件下，進(jìn)行3次重復(fù)的驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得貫筋藤凝乳酶活力為260.984 SU/m L。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3可知，方差分析結(jié)果表明，在進(jìn)行貫筋藤鮮莖中凝乳酶的提取試驗(yàn)過(guò)程中，料液比、浸泡時(shí)間、浸泡溫度對(duì)貫筋藤鮮莖中凝乳酶活力的影響均不顯著。

2.3 貫筋藤鮮莖中凝乳酶提取率與酶活力相關(guān)性

貫筋藤鮮莖中的凝乳酶活力與對(duì)應(yīng)組別的凝乳酶提取率關(guān)系結(jié)果如圖5所示。

圖5 凝乳活力與提取率的關(guān)系Fig.5 Correlation of milk clotting activity and extraction rate

由圖5可知，貫筋藤鮮莖中凝乳酶的提取率隨著凝乳酶活力的增大而升高，對(duì)這兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，兩者的Person相關(guān)系數(shù)為0.932，顯著水平P＜0.01，兩者存在極顯著的正線性相關(guān)，即凝乳酶活力最高時(shí)，相應(yīng)的提取率也最高[10]，因此在最佳提取條件下，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，取其平均值，測(cè)得貫筋藤鮮莖中凝乳酶的提取率為31.35%。

3 結(jié)論

結(jié)果表明，貫筋藤的鮮莖中也含有凝乳酶?？疾觳煌念A(yù)處理方式、料液比、浸泡時(shí)間、浸泡溫度對(duì)凝乳酶活力的影響，最終對(duì)貫筋藤鮮莖采用敲碎的預(yù)處理方式，以此為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn)，分析得出凝乳酶提取的最佳條件為料液比1∶20（g∶m L），浸泡時(shí)間40 min，浸泡溫度65℃。在此條件下，測(cè)得的凝乳酶活力為260.984 SU/m L，提取率為31.35%。

相關(guān)性試驗(yàn)結(jié)果表明，凝乳酶活力與提取率呈正線性相關(guān)。

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Extraction process of rennet from fresh stalk of Dregea sinensis Hemsl

WANG Hongyan1,TAO Liang1,2,CHEN Sen1,LI Tao1,HUANG Aixiang1*
(1.College of Food Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunm ing 650201,China; 2.College of Plant Protection,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China)

The fresh stalk of wild Dregea Sinensis Hemsl from the northwest of Yunnan province was researched.On the basis of single factor test,using rennet activity as evaluation index,the effects of different pretreatments,solid-liquid ratio,extraction time and temperature on enzyme activity of D.sinensis Hemsl fresh stalk was studied.Optimal extraction conditions were determined by three factors and three levels orthogonal experiment. The results showed that the optimal extraction process of rennet from D.sinensis Hem sl was solid-liquid ratio 1∶20(g∶m l),extraction time 40 m in,extraction temperature 65℃.Under this condition,the rennet activity was 260.984 SU/m l,the rennet extraction rate was 31.35%.

Dregea sinensis Hemsl;rennet;extraction process;enzyme activity;extraction rate

TS202.3

A

0254-5071（2015）03-0034-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.008

2015-01-18

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31160331）；云南省高校食品加工與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（云教科（2014）16號(hào)）

王紅燕（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿橹破芳庸づc質(zhì)量安全。

*通訊作者：黃艾祥（1963-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槿橹破芳庸ぁ?/p>