萬古霉素及其雜質(zhì)的親水作用色譜分析

閆競宇 ， 郭志謀， 丁俊杰， 沈愛金， 王紀(jì)霞， 金高娃， 梁鑫淼

（中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點實驗室，遼寧 大連116023）

萬古霉素（vancomycin，VAN）是由東方鏈酶菌（Streptomyces orientalis）產(chǎn)生的一種糖肽類抗生素，目前臨床上主要用來治療嚴(yán)重的革蘭氏陽性菌感染，是治療由金葡菌引起的嚴(yán)重感染的首選藥物［1］。由于萬古霉素具有較好的抗菌作用，除作為藥物使用外，其還常被作為飼料添加劑使用，為防止抗生素濫用引起耐藥性問題，各個國家都制定了相應(yīng)的食品殘留限量標(biāo)準(zhǔn)［2］。因此，無論對萬古霉素類藥物的質(zhì)量控制［3，4］、藥代動力學(xué)研究［5，6］，還是對食品、飼料中萬古霉素類抗生素的非法添加的檢測［7］，都需要發(fā)展合適的色譜分析方法。

萬古霉素分子由兩個結(jié)構(gòu)單元組成（見圖1），即親水的糖基部分（氨基糖、葡萄糖）和疏水的肽基部分（7 個氨基酸交聯(lián)而成的三環(huán)剛性骨架），同時，分子既含有堿性的伯氨基團(tuán)，又含有酸性的羧基。萬古霉素的結(jié)構(gòu)特征對色譜分離效率和峰形帶來了較大的挑戰(zhàn)。此外，萬古霉素由發(fā)酵產(chǎn)生，發(fā)酵過程會產(chǎn)生較多的結(jié)構(gòu)類似物，萬古霉素本身也可產(chǎn)生降解雜質(zhì)，其降解雜質(zhì)如CDP-1 可引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)［8］，對這些雜質(zhì)的分離需要較高的分離選擇性。當(dāng)前，對萬古霉素色譜分析主要采用反相色譜法，以C18 柱為色譜固定相，采用磷酸三乙胺-乙腈-四氫呋喃為流動相體系可獲得較好的萬古霉素峰形和對部分雜質(zhì)的分離選擇性?？紤]到上述方法的質(zhì)譜兼容性和分離選擇性問題，Hoogmartens 等［9，10］對萬古霉素分析方法進(jìn)行了改進(jìn)，通過優(yōu)化不同種類的緩沖鹽、有機(jī)溶劑及改變?nèi)軇w系的pH 值來改善分離選擇性，分別采用二氧六環(huán)-甲酸銨流動相體系和甲醇-乙酸銨體系實現(xiàn)對萬古霉素及主要雜質(zhì)的分離和質(zhì)譜鑒定，改進(jìn)后的體系可與質(zhì)譜兼容，但仍存在分離選擇性不足的問題。Adams 等［11］針對萬古霉素雜質(zhì)分離問題，篩選了69 種不同廠家的C18 色譜柱，通過色譜柱參數(shù)比對，給出了分離萬古霉素樣品時色譜柱選擇的參考因素。由此可見，由于萬古霉素分子結(jié)構(gòu)較為特殊，結(jié)構(gòu)類似物多，優(yōu)化后的反相方法仍不能夠提供足夠的分離選擇性，推測其原因是反相固定相不能提供足夠的極性選擇性。

近年來得到巨大發(fā)展的親水作用色譜方法［12-16］為極性化合物的分離提供了新的途徑，其具有極性選擇性好，質(zhì)譜兼容性高的特點。萬古霉素類化合物本身帶有較強(qiáng)的極性基團(tuán)，在親水作用色譜上應(yīng)該可以實現(xiàn)較好的保留，但目前對萬古霉素類化合物親水作用色譜保留行為的研究尚未見報道。本文以萬古霉素及主要雜質(zhì)為研究對象，通過篩選親水固定相、考察不同流動相條件對保留性質(zhì)的影響，開展該類物質(zhì)親水保留特性研究，為萬古霉素及其結(jié)構(gòu)類似物的親水分離方法的發(fā)展提供了依據(jù)和指導(dǎo)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters Alliance 高效液相色譜儀（Waters，Milford，MA，USA），包括2695 分離單元、自動進(jìn)樣器、柱恒溫系統(tǒng)和2489 紫外檢測器。乙腈為Merck 公司（Darmstadt，Germany）產(chǎn)品，實驗室用水來自Milli Q 純水凈化系統(tǒng)（Billerica，MA，USA），甲酸、甲酸銨為Acros 公司（Fair Law，NJ，USA）產(chǎn)品。萬古霉素（vancomycin B）、desvancosaminyl vancomycin（DESV）、雙去氯萬古霉素（dedichloro vancomycin，DDCV）、crystalline degradation product （CDP-1）標(biāo)準(zhǔn)品均購自Toronto Research Chemicals Inc. （Brisbane，Toronto，Canada），去甲萬古霉素（norvancomycin，NORV）購自中國食品藥品檢定研究院（北京）。

TSK gel Amide-80 柱購自日本Tosoh 公司。Atlantis HILIC 柱購自Waters 公司（Milford，MA，USA）。ZIC-HILIC 購自Merck 公司（Darmstadt，Germany）。Click Maltose 柱為實驗室自制。Venusil HILIC 為北京艾杰爾公司產(chǎn)品。Click XIon為北京華譜新創(chuàng)科技有限公司產(chǎn)品。以上色譜柱規(guī)格均為150 mm×4.6 mm，5 μm。

1.2 色譜條件

1.2.1 色譜柱的篩選

色譜柱溫度設(shè)定為30 ℃，流動相流速為1.0 mL／min；流動相A 為乙 腈，B 為 水，C 為100 mmol／L 甲酸銨（pH 3.2）；梯度洗脫程序：保持10% C 不變，0 ～30 min 由10% B 升至40% B；檢測波長設(shè)定為254 nm。

1.2.2 流動相中乙腈含量的影響

使用三元流動相體系，保持C 相緩沖鹽恒定為10%，通過調(diào)節(jié)A 和B 的比例改變乙腈含量。

1.2.3 流動相中pH 的影響

配制100 mmol／L 甲酸銨，通過調(diào)節(jié)甲酸加入量使pH 分別為3.2、4.2、5.0，使用三元流動相體系，等度洗脫，保持65% A 和25% B 不變，更換C 相溶液。

1.2.4 流動相中鹽濃度的影響

使用三元流動相體系，保持65% A 不變，通過調(diào)節(jié)B 和C 的比例改變緩沖鹽濃度。

1.2.5 萬古霉素及其雜質(zhì)的親水分離

使用三元流動相體系，梯度洗脫程序：保持10% C 不變，0 ～40 min 由18% B 升至23% B，40 ～50 min 由23% B 升至25% B。

2 結(jié)果與討論

2.1 雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的選擇

萬古霉素為發(fā)酵生產(chǎn)得到，同時還會產(chǎn)生大量的結(jié)構(gòu)類似物，本文選取了萬古霉素產(chǎn)品中較為常見的幾個雜質(zhì)，結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。NORV 相較于萬古霉素丟失一個甲基結(jié)構(gòu)，DESV 為萬古霉素失去一個氨基糖單元，DDCV 是萬古霉素失去兩個氯原子。CDP-1 是萬古霉素降解重排之后產(chǎn)生的雜質(zhì)，其含有兩個同分異構(gòu)體，分別為CDP-1-M 和CDP-1-m，該雜質(zhì)會引發(fā)毒副作用，在萬古霉素質(zhì)量分析中需要嚴(yán)格控制。所選的雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品極性都與萬古霉素相近，以此考察親水作用色譜法對結(jié)構(gòu)類似物的選擇性。

2.2 色譜柱的篩選

本文篩選了6 種常見的親水作用色譜柱，包括TSKgel Amide-80、Atlantis HILIC、ZIC-HILIC、Click Maltose、Venusil HILIC、Click XIon 色譜柱，這些固定相包含了硅醇基、兩性離子、酰胺、麥芽糖等不同鍵合相，能夠提供不同的分離選擇性。通過考察相同實驗條件下對萬古霉素及其雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的分離，獲得保留特性，進(jìn)而選擇分離選擇性好，親水性強(qiáng)的色譜固定相。表1 列舉了不同色譜柱對萬古霉素及主要雜質(zhì)的色譜保留時間。從萬古霉素及其雜質(zhì)的保留看，所選擇的6 種色譜柱選擇性類似，出峰順序遵從極性從小到大的順序。DESV 比萬古霉素少一個糖基，故極性減小，先出峰，而CDP-1 重排后，相較于萬古霉素多生成一個羧基，故極性增大，去甲萬古霉素和去氯萬古霉素均因為去掉非極性基團(tuán)（如甲基、氯原子）而使整個分子極性增強(qiáng)。不同色譜柱的親水性有所差別，從保留時間看，Atlantis HILIC 保留最弱，Click XIon 柱保留最強(qiáng)。CDP-1 為一對同分異構(gòu)體，只有ZIC-HILIC 色譜柱在此條件下能將兩個異構(gòu)體完全分離，但其對萬古霉素、去甲萬古霉素和CDP-1 的分離度明顯不夠。為使萬古霉素和雜質(zhì)能夠有更充分的調(diào)節(jié)空間和最大的分離度，最后選擇保留最強(qiáng)的Click XIon 柱進(jìn)行流動相條件的考察和優(yōu)化。

表1 萬古霉素及其雜質(zhì)在不同色譜柱上的保留時間Table 1 Retention times of vancomycin and its related impurities on different columns min

2.3 萬古霉素及其雜質(zhì)在Click XIon 柱上的色譜保留行為研究

2.3.1 流動相中乙腈含量對溶質(zhì)保留值的影響

在親水作用色譜模式下，乙腈／水比例對溶質(zhì)的保留影響最大。研究保留值和乙腈含量的關(guān)系，對于理解萬古霉素及其雜質(zhì)在Click XIon 柱上的色譜保留機(jī)理具有一定的指導(dǎo)意義。如圖2 所示，萬古霉素及其雜質(zhì)的保留均隨乙腈含量的增加而增加，表現(xiàn)出典型的HILIC 模式特征。同時，從圖中各曲線的變化率看，該類物質(zhì)的保留隨乙腈含量變化幅度均較大，即表現(xiàn)出對乙腈含量的變化較為敏感，這可能與該類物質(zhì)的分子較大有關(guān)。

圖2 萬古霉素及其雜質(zhì)的保留因子隨乙腈含量的變化圖Fig.2 Plots of retention factors of vancomycin and its related impurities versus acetonitrile content in the mobile phase

為進(jìn)一步了解其保留機(jī)理，依據(jù)吸附機(jī)理保留值方程（1）［17，18］，考察了ln k（k 為化合物的保留因子）和ln CB（CB為水的體積分?jǐn)?shù)）的關(guān)系。具體的回歸系數(shù)見表2。從線性回歸系數(shù)（R2）上看，除保留最弱的DESV 的線性系數(shù)低于0.999 0，其余4 個物質(zhì)都能很好地用該方程進(jìn)行擬合，就此推測萬古霉素及其雜質(zhì)在Click XIon 色譜柱上的保留除分配作用以外，還存在與固定相之間的直接的相互作用，例如靜電作用、氫鍵作用、偶極作用等。

表2 萬古霉素及其雜質(zhì)基于方程（1）得到的回歸結(jié)果Table 2 Results of regression equations of vancomycin and impurities based on equation （1）

2.3.2 流動相pH 對溶質(zhì)保留值的影響

流動相pH 值對溶質(zhì)的保留具有重要影響，萬古霉素及其雜質(zhì)帶有多個極性官能團(tuán)，流動相pH的改變會影響不同極性官能團(tuán)的電離狀態(tài)，進(jìn)而改變其保留行為。在不同pH 的流動相條件下，兩性離子固定相Click XIon 柱所帶電性也會有所變化［19］。采用65% 乙腈，保持10 mmol／L 緩沖鹽濃度，調(diào)節(jié)甲酸銨-甲酸緩沖鹽體系的pH，分別考察了pH 3.2、4.2、5.0 條件下的分離效果。如圖3 所示，除DESV 外，萬古霉素及其雜質(zhì)的保留均隨流動相pH 的增加而增強(qiáng)。推測這是由于當(dāng)pH 增大時，固定相由正電性轉(zhuǎn)為負(fù)電性，與萬古霉素及其雜質(zhì)的靜電作用增強(qiáng)，故保留增強(qiáng)。DESV 相較于其他化合物沒有產(chǎn)生靜電作用的氨基糖結(jié)構(gòu)，故保留未受pH 影響。這也進(jìn)一步證實了萬古霉素及其雜質(zhì)在親水作用色譜中是多種作用力下的保留機(jī)理。

圖3 萬古霉素及其雜質(zhì)的保留因子隨流動相pH 的變化圖Fig.3 Plots of retention factors of vancomycin and its related impurities versus pH of the mobile phase

2.3.3 流動相中鹽濃度對溶質(zhì)保留值的影響

在親水作用色譜中，緩沖鹽的濃度會影響溶質(zhì)的保留時間，也可能改變固定相對溶質(zhì)的分離選擇性。為了解緩沖鹽濃度對萬古霉素及其雜質(zhì)保留和選擇性的影響，考察了不同鹽濃度下各物質(zhì)的保留時間。由乙腈含量實驗可知，萬古霉素及其雜質(zhì)在乙腈含量為65% 時，保留時間適宜，且各雜質(zhì)之間可得到較好的分離，故本研究采用65% 乙腈。由于萬古霉素及其雜質(zhì)的保留隨pH 增加而增強(qiáng)，為了更好地反映鹽濃度的影響，在靜電作用力最弱的pH 3.2 條件下開展實驗，通過改變水相和鹽相（100 mmol／L 甲酸銨，pH 3.2）比例，調(diào)節(jié)不同鹽濃度。如圖4 所示，除CDP-1 外，萬古霉素及其雜質(zhì)的保留隨緩沖鹽濃度變化不明顯，這與大多數(shù)小分子樣品在親水作用色譜保留中所展現(xiàn)的保留值隨鹽濃度增大而增加的現(xiàn)象［20］不一致，推測原因為萬古霉素及其雜質(zhì)與固定相的靜電吸引作用隨鹽濃度增加而降低，剛好與由鹽濃度增加導(dǎo)致的保留增強(qiáng)的作用相反，二者共同作用的結(jié)果為保留幾乎沒有發(fā)生明顯變化。而隨鹽濃度的增加，雜質(zhì)CDP-1 的保留有所下降，推測其原因為CDP-1 相較于萬古霉素分子，重排后生成了一個羧基，致使CDP-1 與固定相的靜電吸引作用增加，當(dāng)鹽濃度增加時，削弱了其與固定相的離子交換作用，故保留有所降低。在對比不同鹽濃度下萬古霉素及其雜質(zhì)的分離度和保留后，10 mmol／L 鹽被認(rèn)為是較適宜的鹽濃度。

圖4 萬古霉素及其雜質(zhì)保留因子隨緩沖鹽濃度的變化圖Fig.4 Plots of retention factors versus salt concentration in the mobile phase

2.4 萬古霉素及其雜質(zhì)在親水作用色譜模式下的分離

通過以上對萬古霉素及其雜質(zhì)的親水保留性質(zhì)的研究可知，萬古霉素及其雜質(zhì)在兩性離子色譜柱上的保留較好，其保留隨乙腈含量、pH 值變化較大，隨鹽濃度變化不大。根據(jù)萬古霉素及其雜質(zhì)的保留性質(zhì)，優(yōu)化分離方法，使萬古霉素及其雜質(zhì)能夠在較短的時間內(nèi)實現(xiàn)基線分離。圖5 為采用添加甲酸銨的流動相梯度條件下對萬古霉素及主要雜質(zhì)的分離。從圖5 可以看出，雖然萬古霉素和幾個主要雜質(zhì)的分子差別較小，保留性質(zhì)較為相近，但在當(dāng)前優(yōu)化的條件下仍可實現(xiàn)較好的分離。CDP-1 為兩個同分異構(gòu)體，在該條件下，兩個峰有一定的分離趨勢，保留時間越長，二者的分離度越大；考慮到分析時間不宜過長，未繼續(xù)延長時間改善其分離度。由于購買的雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品純度不高，仍可見其他雜質(zhì)峰存在，均與萬古霉素實現(xiàn)較好的分離，體現(xiàn)了親水作用色譜在萬古霉素與雜質(zhì)的分離中具有一定的優(yōu)勢。同時，該方法采用了質(zhì)譜兼容的乙腈-甲酸銨體系，可以直接用于對未知雜質(zhì)的鑒定。但是，從峰形上看，萬古霉素、去甲萬古霉素和去氯萬古霉素峰均存在一定程度的前伸，對分離效率和分離度造成不利影響。因此，HILIC 固定相和方法仍需要進(jìn)一步篩選和優(yōu)化，以改善峰形和提高分離度。

圖5 萬古霉素及其雜質(zhì)的HILIC 譜圖Fig.5 HILIC chromatogram of vancomycin and its related impurities

3 結(jié)論

本文以萬古霉素及其4 個常見雜質(zhì)為研究對象，探索了萬古霉素類抗生素的親水作用色譜保留行為。通過對比萬古霉素及其雜質(zhì)在不同親水鍵合色譜柱上的保留時間，選取了兩性離子Click XIon色譜柱為固定相。通過考察流動相中有機(jī)相比例、鹽濃度及pH 值對萬古霉素及其雜質(zhì)保留的影響，初步探討了該類物質(zhì)的親水保留機(jī)制及影響因素，并優(yōu)化得到乙腈-甲酸銨（pH 3.2）的流動相體系，實現(xiàn)了萬古霉素及其雜質(zhì)的有效分離。親水作用色譜方法分離萬古霉素及其雜質(zhì)，可以獲得較好的保留和分離，質(zhì)譜兼容性好，可彌補(bǔ)反相色譜極性選擇性差的缺點，為該類化合物分離提供了新的方法和思路。

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