液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中35 種四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類抗生素殘留

王 浩， 趙 麗 ， 楊紅梅， 潘紅艷， 史海良， 錢 聰， 張 杉

（國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心，海淀區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，北京100094）

抗生素是由細(xì)菌、放線菌、真菌等微生物經(jīng)過培養(yǎng)而得到的次級代謝產(chǎn)物，它可有效地抑制病原微生物的生長、繁殖或直接殺滅病原微生物。廣義的抗生素還包括一些用化學(xué)方法合成的、有類似作用的人工合成抗菌藥物（如磺胺等）。抗生素的研制、篩選、合成對保障人類健康、促進(jìn)畜牧生產(chǎn)水平提高、滿足人類對動物性食品需求等方面做出了巨大貢獻(xiàn)。但過量使用抗生素會降低畜牧產(chǎn)品的品質(zhì)，影響乳品發(fā)酵；而且殘留有抗生素的動物性產(chǎn)品進(jìn)入人類食物鏈，會使體內(nèi)菌株產(chǎn)生抗生素抗性，擾亂機體內(nèi)環(huán)境平衡，導(dǎo)致菌群失調(diào)；也會使易感人群產(chǎn)生過敏反應(yīng)、激素障礙變態(tài)反應(yīng)。面對抗生素濫用對公眾健康的威脅，美國食品和藥物管理局（FAO）及世界衛(wèi)生組織（WHO）早在1969 年就規(guī)定了各種動物性食品中抗生素的殘留允許標(biāo)準(zhǔn)，WHO 于1979 年規(guī)定原料奶及消毒牛奶中不得有抗生素。美國FDA 調(diào)查表明，泌乳期乳牛用藥不當(dāng)或不注意安全時間是牛乳中抗生素殘留的主要原因。一些不法乳品生產(chǎn)商戶在高溫季節(jié)為防止乳的酸敗，往往向牛乳中摻雜各種抗生素，通過抑制細(xì)菌生長以達(dá)到防止牛奶酸敗的目的，這也是牛乳中抗生素殘留的一個來源。

目前，檢測抗生素的方法有微生物法［1］、酶聯(lián)免疫法［2］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［3］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等［4-8］。微生物法簡單、費用少、速度快，但特異性差，易受其他抗生素影響，且靈敏度不高，檢出限較高。酶聯(lián)免疫法雖有靈敏度高、前處理簡單、測定速度快等優(yōu)點，但檢測結(jié)果存在假陽性；目前，國際上常用的抗生素確證方法為液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，但是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法存在前處理步驟繁瑣、有機試劑消耗量大、測定周期長等缺點。目前，牛奶中四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類等5 類抗生素殘留雖然都有標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，但都存在著操作復(fù)雜、溶劑毒性大、費時，不適于大量樣品的快速篩查等問題。針對上述問題，本研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LCMS／MS）技術(shù)快速測定和確證牛奶中35 種四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類等5 類抗生素殘留，具有操作簡單、靈敏度高、回收率穩(wěn)定、測定周期短等優(yōu)點。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 6410 型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（美國Agilent公司），配Agilent 1200 型液相色譜儀；GL-88b 型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；KQ-5200 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；RE-2000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海市亞榮生化儀器廠）；Milli-Q 去離子水發(fā)生器（美國Millipore 公司）。

乙腈、甲醇、甲酸（色譜純）；乙酸銨（優(yōu)級純）；乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉（分析純）；二甲胺四環(huán)素、四環(huán)素、金霉素、土霉素、強力霉素、甲烯土霉素、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺索嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺甲基異惡唑、磺胺多辛、磺胺地索辛、甲氧芐啶、磺胺甲二唑、磺胺喹沙啉、鄰氯青霉素、雙氯青霉素、乙氧萘胺青霉素、苯唑青霉素、芐青霉素、苯咪青霉素、甲氧苯青霉素、苯氧乙基青霉素、紅霉素、氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素等35 種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品均購自德國Dr. Ehrenstorfer 公司，純度為98% ～99%。

1.2 分析條件

1.2.1 色譜條件

條件一（適用于四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素） Eclipse XDB-C8色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流速：0.25 mL／min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動相：A 為10.0 mmol／L 乙酸銨（含0.35% 甲酸），B 為甲醇；梯度洗脫程序：0 ～3 min，5% B；3 ～20 min，5% B ～25% B；20 ～25 min，25% B ～50% B；25 ～30 min，50% B ～100% B；30 ～35 min，100% B。

條件二（適用于氯霉素類抗生素） Eclipse XDB-C8色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流速：0.25 mL／min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動相：A 為0.05% 氨水溶液，B 為甲醇；梯度洗脫程序：0 ～3 min，5% B；3 ～5 min，5% B ～100% B；5～12 min，100% B。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子（ESI）源；掃描方式：四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為正離子模式，氯霉素類抗生素為負(fù)離子模式；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；干燥氣：N2；霧化氣壓力：275.8 kPa；干燥氣溫度：340 ℃；干燥氣流速：10 L／min。

1.3 樣品處理

稱取5.00 g 樣品（精確至0.01 g），置于25 mL比色管中，先加入3 mL 0.1 mol／L Na2EDTAMcllvaine 緩沖液，渦旋1 min，再用含1% （v／v）氨水的乙腈溶液定容。超聲波提取20 min，上清液經(jīng)濾紙過濾，吸取10.0 mL 濾液至100 mL 雞心瓶內(nèi)，并將其接至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，于50 ℃水浴中減壓濃縮至近干，加入2.0 mL 含1% （v／v）氨水的30% 甲醇水溶液充分溶解后過0.22 μm 濾膜，濾液用于LCMS／MS 測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

在質(zhì)譜MRM 模式下，樣品基質(zhì)對測定的干擾較小，且色譜柱具備一定的分離凈化功能，確保極性較強的雜質(zhì)在4 min 之前被洗脫在質(zhì)譜儀之外，這樣能大大地減輕對質(zhì)譜儀的污染。故在實驗設(shè)計時考慮采用較為簡單和經(jīng)濟的液-液分配方法進(jìn)行樣品前處理。

2.1.1 提取溶劑的選擇

四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類等5 類抗生素的化學(xué)性質(zhì)差異較大。本實驗分別以乙腈、Mcllvaine 緩沖液-乙腈、Mcllvaine 緩沖液-堿性乙腈和Mcllvaine 緩沖液-酸性乙腈作為提取劑進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)乙腈作提取劑時，多數(shù)目標(biāo)化合物的回收率在50% 與90% 之間，而四環(huán)素類的回收率不足20%。以Mcllvaine 緩沖液-乙腈為提取劑時紅霉素的回收率不足40%。Mcllvaine 緩沖液-酸性乙腈作為提取劑時氯霉素類抗生素回收率下降了15%，同時檢測靈敏度降低1 ～2 倍。Mcllvaine 緩沖液-堿性乙腈作為提取劑時各類化合物的平均回收率為60% ～105%，可以滿足檢測要求。

2.1.2 定容溶劑的選擇

本實驗發(fā)現(xiàn)以流動相作為定容溶劑時，各目標(biāo)化合物的峰形良好，但紅霉素的靈敏度偏低，因此本實驗選擇甲醇-水為定容溶劑并對兩者的比例（9 ∶1、7 ∶3、5 ∶5、3 ∶7、1 ∶9，v／v）進(jìn)行考察。結(jié)果表明，當(dāng)甲醇比例較低時，目標(biāo)物的峰形和靈敏度較好，但對旋蒸濃縮后的樣品提取物進(jìn)行復(fù)溶時，不能完全溶解殘留在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶壁上的目標(biāo)物，導(dǎo)致部分目標(biāo)物回收率偏低；提高甲醇比例，其對目標(biāo)物的溶解性增加但峰形變差，最終本實驗選擇甲醇-水（3 ∶7，v／v）為定容溶劑，同時考慮到紅霉素和氯霉素類抗生素的特性，在其中加入1% （v／v）氨水。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用直接進(jìn)樣方式將35 種質(zhì)量濃度為100 μg／L 的四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類等5 類抗生素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別注入離子源中，在正離子或負(fù)離子檢測方式下進(jìn)行母離子全掃描，得到目標(biāo)化合物的分子離子峰。根據(jù)歐盟2002／657／EC 指令規(guī)定對于質(zhì)譜確證方法必須達(dá)到4 個確證點的要求，低分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測應(yīng)在確定母離子的基礎(chǔ)上選擇兩個以上的子離子。以分子離子為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，最后采集全掃描的二級質(zhì)譜圖，得到碎片離子信息，然后再對得到的二級質(zhì)譜參數(shù)如碎裂電壓、碰撞能量等進(jìn)行優(yōu)化，使定性離子與定量離子產(chǎn)生的離子對強度達(dá)到最大。得到的四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類等5 類35 種抗生素的最佳質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

2.3.1 色譜柱的選擇

為了有利于色譜峰的分離及峰形的改善，本方法分別采用資生堂MGⅢ-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）、XDB C18色譜柱（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）、ZORBAX SB-Aq 色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）、Eclipse XDB-C8色譜柱，（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）進(jìn)行分離試驗，發(fā)現(xiàn)Eclipse XDB-C8色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）對于全部目標(biāo)化合物分離效果較好，其他色譜柱對四環(huán)素類物質(zhì)都存在分離效果不理想的問題。

2.3.2 色譜分離條件的選擇

選擇流動相時應(yīng)兼顧分離效果及各分離組分的離子化效率，以獲得最佳的分辨率和最高的靈敏度。由于抗生素易溶于甲醇或乙腈，試驗分別選擇甲醇和乙腈作為強洗脫流動相。用乙腈作為流動相時目標(biāo)化合物的分離效果明顯低于甲醇作為流動相時的效果，因此最終選擇甲醇作為強洗脫流動相。在水相中加入乙酸銨后，磺胺類和青霉素類抗生素加氫離子峰強度離子化效率明顯提高。在水相中加入0.35% 的甲酸是為了提高待測物在電噴霧離子源中的正離子化效率，以提高靈敏度，同時四環(huán)素類能形成較好的色譜峰。因此，最終選用10.0 mmoL／L 乙酸銨（含0.35% 甲酸）-甲醇作為流動相。

表1 35 種抗生素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Instrumental parameters for mass spectrometric analysis of the 35 antibiotics

四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類等4類抗生素結(jié)構(gòu)差異較大，本方法在色譜條件一中利用梯度洗脫的方法提高分離及檢測效果，測試開始時，流動相中10.0 mmoL／L 乙酸銨（含0.35% 甲酸）-甲醇的比例為95 ∶5，然后在0 ～3 min 內(nèi)保持此比例，目的是洗脫待測液中極性較強的雜質(zhì)；3 ～20 min 內(nèi)將二者的比例逐步變?yōu)?5 ∶25，目的是分離待測液中極性較強的磺胺類抗生素；20 ～25 min 內(nèi)將二者的比例逐步變?yōu)?0 ∶50，目的是分離待測液中中等極性的磺胺類抗生素；25 ～30 min 內(nèi)將二者的比例逐步變?yōu)? ∶100，30 ～35 min 內(nèi)保持此比例，目的是分離待測液中極性較弱的磺胺類抗生素以及四環(huán)素類、青霉素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。通過上述3 步梯度洗脫，在35 min 內(nèi)，可以較好地分離待測液中四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類和大環(huán)內(nèi)酯類等4 類抗生素。在色譜條件二中也采用梯度洗脫，將3 種氯霉素類抗生素有效分離。

2.3.3 進(jìn)樣量的選擇

進(jìn)樣量大可提高測定的靈敏度，但容易污染色譜柱。實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)進(jìn)樣量達(dá)到10 μL 時，靈敏度能達(dá)到要求，且對色譜柱影響不大。

2.4 線性范圍與檢出限

用空白樣品提取液逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別進(jìn)樣10 μL，測定結(jié)果經(jīng)線性回歸（y 為峰面積；x 為含量，μg／kg）；同時用空白樣品進(jìn)行加標(biāo)實驗，將信噪比為3 條件下對應(yīng)的被測物含量定為檢出限。結(jié)果見表2。

表2 35 種抗生素的線性回歸方程、線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear regression equations，linear ranges，correlation coefficients （r）and limits of detection （LOD）of the 35 antibiotics

2.5 方法的回收率和精密度

每組準(zhǔn)確稱取空白樣品6 份，每份5.00 g，共3組，分別定量加入目標(biāo)對照品，第一組添加水平：四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類抗生素均為10.0 μg／kg，氯霉素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素均為1.0 μg／kg；第二組添加水平：四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類抗生素均為25.0 μg／kg，氯霉素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素均為2.5 μg／kg；第三組添加水平：四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類抗生素均為50.0 μg／kg，氯霉素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素均為5.0 μg／kg。按供試品溶液制備方法制備后進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

從表3 可見，平均加標(biāo)回收率為70.1% ～109.9%，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.89% ～9.99% （n ＝6）。

表3 目標(biāo)物在空白樣品中的加標(biāo)回收率和精密度（n＝6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations （RSDs）of the targets spiked in samples （n＝6）

表3 （續(xù)）Table 3 （Continued）

2.6 實際樣品檢測

為了解我國市場上乳品中抗生素殘留情況，采用本研究建立的檢測方法對市售的50 種不同乳品進(jìn)行了檢測，并對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)分析。50 個樣品中，其中一個樣品檢出氯霉素（如圖1 所示），含量為0.48 μg／kg。1999 年9 月13 日中華人民共和國農(nóng)業(yè)部發(fā)布了《動物性食品中獸藥最高殘留限量》［9］的通知，規(guī)定了氯霉素在所有食品動物的可食用組織中不得檢出，但檢測結(jié)果表明，中國市場上銷售的乳品氯霉素污染的風(fēng)險仍然存在。

圖1 某氯霉素（0.48 μg／kg）陽性樣品的質(zhì)量色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of a positive sample containing chloramphenicol （0.48 μg／kg）

3 結(jié)論

本研究建立的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法實現(xiàn)了牛奶中35 種四環(huán)素類、磺胺類、青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類等5 類抗生素殘留的測定。該方法簡單、快捷、經(jīng)濟，可實現(xiàn)多種抗生素殘留的快速測定，為我國執(zhí)法部門對乳品市場的監(jiān)管和質(zhì)量控制提供了有利的技術(shù)支持，該方法的推廣將為乳品質(zhì)量安全的監(jiān)督檢驗工作節(jié)省大量的人力物力資源和時間。

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