低共熔溶劑——新型親水作用色譜流動(dòng)相改性劑

譚 婷， 喬 鑫， 萬益群， 邱洪燈*

（1. 中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所，甘肅 蘭州730000；2. 南昌大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌330047）

親水作用色譜（HILIC）在1990 年由Alpert 提出并命名，所采用的為強(qiáng)極性固定相，通常以水和高含量的有機(jī)溶劑（通常是乙腈）為流動(dòng)相。由于強(qiáng)極性化合物在高含量有機(jī)溶劑的流動(dòng)相體系中有合適的保留和分離性能，HILIC 也因此成為反相液相色譜（RPLC）的補(bǔ)充，因此HILIC 近年來受到了廣泛的關(guān)注和重視［1，2］。有機(jī)相的比例是影響樣品在固定相上保留行為的最主要因素，例如乙腈含量的增加會(huì)顯著增加組分的保留因子。一般采用乙腈-水體系作為流動(dòng)相，其中水相的比例為5% ～40%，以保證其顯著的親水作用。在HILIC 分離模式中，流動(dòng)相中的水是強(qiáng)洗脫溶劑。

低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DESs）是一類具有比單個(gè)純組分更低熔點(diǎn)的離子型溶劑，與離子液體有很多相似的性質(zhì)，具有更為綠色環(huán)保、不易揮發(fā)、可降解、價(jià)格低廉、材料易于制備等特點(diǎn)［3］。低共熔溶劑作為具有良好溶解性能的溶劑被廣泛應(yīng)用于有機(jī)合成、電化學(xué)、色譜分離分析以及復(fù)雜樣品前處理等方面，并展現(xiàn)了很好的應(yīng)用前景［3-5］。Abbott 等［6-8］最早開始并深入系統(tǒng)地研究了一系列膽堿類低共熔溶劑的性質(zhì)及應(yīng)用。Xu等［9］將DESs 用于雙水相體系中的蛋白質(zhì)萃取。我們課題組建立了基于DESs 的超聲輔助單滴微萃取方法并應(yīng)用于模擬油中酚類化合物的萃?。?0］。Tang 等［11，12］對(duì)DESs 在化學(xué)學(xué)科及萃取分離的應(yīng)用方面做了詳細(xì)的綜述。Zhao 等［13，14］就DES 在生物柴油的制備和應(yīng)用方面有詳細(xì)的闡述。DESs 還可以用作色譜固定相制備新方法中的反應(yīng)媒介［15］。

目前我們未見DESs 在HILIC 中的應(yīng)用研究報(bào)道?；贒ESs 優(yōu)異的物理化學(xué)性質(zhì)，本文將其用作HILIC 流動(dòng)相的改性劑，建立了一個(gè)新型的無水條件下的HILIC 模式，并考察了不同比例的DES-乙腈條件下，幾種堿基與核苷的色譜行為。與傳統(tǒng)水相流動(dòng)相條件相比，將DESs 用作HILIC 的流動(dòng)相改性劑，可顯著提高目標(biāo)分析物的色譜分離效果，為DESs 應(yīng)用領(lǐng)域的拓展提供新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

儀器：Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），配備G1311C 型四元梯度泵、G1315D 型二極管陣列檢測器、帶有20 μL 定量環(huán)的手動(dòng)進(jìn)樣器和Revision B.04.03 色譜工作站；Direct-Q 3UV純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）。

試劑：氯化膽堿（純度98%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙二醇（分析純，天津醫(yī)藥化學(xué)有限公司）；乙酸銨（純度98%，西隴化工有限公司）；甲醇、乙腈（ACN）（色譜純，美國MREDA 公司）；配制流動(dòng)相及溶液均采用Millipore 純水系統(tǒng)制備的超純水。尿嘧啶、6-氯脲嘧啶、腺苷、次黃嘌呤、胞嘧啶和胞苷均為生化試劑（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），結(jié)構(gòu)式見表1。

表1 堿基與核苷的結(jié)構(gòu)式Table 1 Structural formulae of nucleobases and nucleosides

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DES 的制備

稱取適量的氯化膽堿和乙二醇（摩爾比為1 ∶3），置于250 mL 圓底燒瓶中，在80 ℃油浴中磁力攪拌0.5 h，直至形成均一、澄清、透明的溶液，即得到由氯化膽堿和乙二醇組成的DES，在室溫下為無色透明液體。

1.2.2 流動(dòng)相的配制

分別量取一定體積的DES 和乙腈，混合均勻后經(jīng)0.22 μm 微孔有機(jī)濾膜過濾，再超聲脫氣，得到分別為2.5%、5.0%、7.5% 和10% （v／v）的DES 乙腈溶液，作為親水作用色譜的新型流動(dòng)相體系。

1.2.3 分離條件

色譜柱：實(shí)驗(yàn)室自制硅膠柱（150 mm×4.6 mm），其中硅膠（粒徑3 μm，比表面積400 m2／g）產(chǎn)自蘭州化學(xué)物理研究所；柱溫：25 ～50 ℃，如沒有特殊說明，則控制在25 ℃；流動(dòng)相為1.2.2 節(jié)配制的不同比例的DES-乙腈混合溶液；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL／min；進(jìn)樣體積：5 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離效果

以4 種堿基和2 種核苷為分析物，考察了DES用作流動(dòng)相改性劑后的色譜分離效果，并與傳統(tǒng)水相流動(dòng)相條件下的分離效果進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果如圖1 所示。當(dāng)采用乙腈-20 mmol／L 乙酸銨水溶液（95 ∶5，v／v）為流動(dòng)相時(shí)，尿嘧啶與6-氯脲嘧啶、胞嘧啶與胞苷均不能有效分離（見圖1b）；當(dāng)乙腈中加入5% （v／v）DES 后，6 種分析物在60 min 內(nèi)分離效果有顯著的提高（見圖1a），尤其是胞嘧啶與胞苷能達(dá)到完全分離，有效解決了傳統(tǒng)水相流動(dòng)相的分離困難。

圖1 （a）DES 改性流動(dòng)相與（b）傳統(tǒng)水相流動(dòng)相條件下色譜分離效果的比較Fig.1 Comparison of the separations between （a）DES based mobile phase and （b）water-based mobile phase

2.2 DES 濃度的影響

在常規(guī)的親水作用色譜中，由于水是強(qiáng)洗脫溶劑，水或水溶液的比例直接影響極性化合物在色譜柱中的分離效果與保留因子。在本研究中，采用DES 代替水相應(yīng)用到親水作用色譜中。改變流動(dòng)相中DES 的比例，考察了6 種堿基和核苷在硅膠柱中的色譜保留能力。如圖2 所示，當(dāng)DES 的體積分?jǐn)?shù)為2.5% 時(shí)，6 種堿基和核苷有較好的分離效果；隨著DES 比例的增加，6 種堿基和核苷的保留都有所降低，其中尿嘧啶的降低幅度最小，胞苷的降低幅度最大。說明在采用DES-乙腈作流動(dòng)相時(shí)，核苷和堿基在硅膠柱中的保留符合親水作用色譜保留模式，而且DES 是該色譜模式中的強(qiáng)洗脫溶劑。

圖2 流動(dòng)相中DES 的體積分?jǐn)?shù)對(duì)分離效果的影響Fig.2 Effect of volume percentage of DES in mobile phase on the separation

2.3 柱溫的影響

DES 的黏度往往比常規(guī)的有機(jī)溶劑和水的黏度要大，柱溫的改變會(huì)對(duì)流動(dòng)相的黏性、分析物的溶解性及保留特性有一定的影響。以5% （v／v）DES乙腈溶液為流動(dòng)相，考察了柱溫的變化對(duì)6 種堿基和核苷保留效果的影響。如圖3 所示，柱溫在25 ～50 ℃范圍內(nèi)，6 種堿基和核苷能在60 min 內(nèi)有較好的保留和分離效果；但隨著柱溫的增加，其保留均有不同程度的減小，其中對(duì)尿嘧啶的保留影響最小，而胞苷保留時(shí)間的減小最為顯著。

圖3 柱溫對(duì)分離效果的影響Fig.3 Effect of column temperature on the separation

3 結(jié)論

本文嘗試了在親水作用色譜模式中，以低共熔溶劑和乙腈體系為流動(dòng)相，考察了6 種堿基和核苷在硅膠柱中的色譜行為，并初步考察了DESs 的濃度和柱溫對(duì)分析物的分離效果和保留因子的影響，證實(shí)低共熔溶劑可作為親水作用色譜流動(dòng)相的改性劑。其保留機(jī)理和詳細(xì)工作還有待進(jìn)一步的研究，但是以低共熔溶劑作為流動(dòng)相改性劑的親水作用色譜有望在未來得到一定的特殊應(yīng)用，可解決某些分離難題。

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