超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法快速篩查水產(chǎn)品中15 種堿性合成色素

黃 鸝， 戴意飛， 王萍亞， 周 勇， 趙巧靈 ， 蔣玲波， 羅海軍

（舟山市食品藥品檢驗檢測研究院，舟山市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測研究院，浙江 舟山316021）

近年來，違法使用堿性橙、羅丹明B、孔雀石綠等工業(yè)堿性合成色素的食品安全問題尤為突出。這些工業(yè)堿性色素具有較強的致毒、致癌作用，由于色彩豐富、價格低廉、著色穩(wěn)定，被某些不法分子非法添加在食品中，對人民健康和社會穩(wěn)定造成危害，成為食品安全領(lǐng)域內(nèi)的高危風(fēng)險因子。因此，目前關(guān)于食品中堿性橙、羅丹明B、孔雀石綠等堿性色素的檢測方法越來越受關(guān)注，已有較多報道［1-7］。

近幾年有關(guān)色素的檢測方法層出不窮，主要有分光光度法［8］、薄層色譜法［9］、毛細(xì)管電泳法［10］、示波極譜法［11］、酶聯(lián)免疫吸附分析法［12］、高效液相色譜法［13-16］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［17，18］等，由于不同色素的極性不同，導(dǎo)致現(xiàn)有的檢測方法在高靈敏度和高效方面具有一定的局限性。

四極桿飛行時間質(zhì)譜（Q-TOF MS）能提供精確質(zhì)量數(shù)，可通過分子質(zhì)量數(shù)的匹配對化合物進(jìn)行鑒定和確證，現(xiàn)在已開展了部分研究，如奶酪中色素的分析［19］、飲料中色素的快速檢測［20］。但是目前使用Q-TOF MS 對于食品中未知添加物的篩查研究總體上比較少，尤其是對水產(chǎn)品中的色素篩查未查到相關(guān)報道。因此，本文以水產(chǎn)品為研究對象，對其中15 種禁用的堿性合成色素進(jìn)行分析，并對樣品前處理方法、液相色譜條件、質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，以期建立水產(chǎn)品中多種色素的UPLC-Q-TOF MS 快速高效的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent UHPLC 和Agilent 6540-QTOF（Agilent公司，美國）；Avanti?J-E 高速冷凍離心機、Talboys 渦旋混合器、N-EVAPTM-112 氮吹儀、樣品萃取管；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸為色譜純，均購自上海安譜實驗科技股份有限公司；無水硫酸鎂、乙酸銨為分析純；C18填料（40～63 μm）、硅膠粉（40～63 μm）均購自上海安譜實驗科技股份有限公司；陽離子交換小柱（Oasis MCX）、弱陽離子交換小柱（Oasis WCX）均購自Waters 公司；C18小柱購自上海安譜實驗科技股份有限公司；實驗用水為Milli-Q 超純水。

標(biāo)準(zhǔn)品：金胺（Auramine O，純度89%）、隱性孔雀石綠（Leucomalachite Green，純度90%）、孔雀石綠（Malachite Green，純度89%）、蘇丹紅III（Sudan III，純度91%）、蘇丹紅IV （Sudan IV，純度91%）、蘇丹黃（Butter Yellow，純度89%）、蘇丹黑B（Sudan Black B，純度91%）、堿性橙II（Chrysoidine G，純度89%）、羅丹明B（Rhodamine B，純度91%）、蘇丹橙（Sudan Orange G，純度89%）、蘇丹紅7B （Sudan Red 7B，純度91%）、蘇丹紅G（Sudan Red G，純度91%）、蘇丹紅I（Sudan I，純度91%）、蘇丹紅II（Sudan II，純度91%）、橘紅2 號（Citrus Red 2，純度91%），均購于上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取15 種堿性合成色素標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg 于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，配制成1 g／L的單標(biāo)準(zhǔn)儲備液（-20 ℃保存），再分別吸取1 g／L的15 種單標(biāo)準(zhǔn)儲備液各1 mL 于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容得10 mg／L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。實驗中使用初始流動相溶液將其稀釋成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4 ℃保存。

1.3 樣品前處理

稱取2.0 g 樣品于50 mL 帶蓋聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL 乙腈（含有1%（v／v）乙酸）溶液，渦旋1 min，超聲5 min，以10 000 r／min 冷凍離心10 min，取5 mL 上清液轉(zhuǎn)移至基質(zhì)分散管中，管內(nèi)裝有C18復(fù)合硅膠吸附劑（500 mg 無水硫酸鎂、100 mg C18粉末、40 mg 硅膠粉末），振蕩基質(zhì)分散管5 min，以10 000 r／min 冷凍離心10 min，取離心后的上清液3 mL，經(jīng)氮氣吹干，用甲醇-水（50 ∶50，v／v）溶解并定容到1 mL，過0.22 μm 有機濾膜后供UPLC-Q-TOF MS 分析測定。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

Agilent Eclipse Plus-C18（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）作為分析柱，柱溫為30 ℃；流動相：A 相為5 mmol／L 乙酸銨-0.1%（v／v）甲酸水溶液，B 相為乙腈；梯度洗脫程序：0～1 min，5%B～20%B；1～10 min，20%B ～100%B；10 ～15 min，100%B。進(jìn)樣體積為3 μL，流速為0.2 mL／min。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子（ESI）源；掃描方式：正離子全掃描；全掃描范圍：m／z 50 ～1 100；毛細(xì)管電壓：4 000 V；離子源噴霧電壓：250 V；離子化電壓：130 V；鞘氣溫度：350 ℃；干燥氣溫度：325 ℃；鞘氣流速：11 L／min；干燥氣流速：8 L／min；數(shù)據(jù)采集模式：全息離子掃描（All ions MS／MS）。參比溶液中含三氟乙酸（C2HF3O2，其精確相對離子質(zhì)量為112.985 5）和六（1H，1H，3H-全氟丙氧基）磷氮的加氫離子（C18H19F24N3O6P＋3，其精確相對離子質(zhì)量為922.009 8）。

數(shù)據(jù)采集與處理通過Agilent Mass Hunter Workstation Software （Version B.05.00）軟件完成，碎片離子數(shù)據(jù)庫建立通過Agilent Mass Hunter PCDL Manager （B.04.00）軟件完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜分析

本文以隱性孔雀石綠、蘇丹紅III 等為代表的15 種在水產(chǎn)品中禁用的堿性合成色素為研究目標(biāo)物進(jìn)行檢測，依據(jù)它們的相對分子質(zhì)量和理化性質(zhì)的差異，結(jié)合應(yīng)用UPLC 技術(shù)進(jìn)行色譜分離，Q-TOF MS 進(jìn)行質(zhì)譜信息采集。圖1 是15 種堿性合成色素的分子特征提取色譜圖，并由All ions MS／MS 模式收集15 種目標(biāo)物的母離子及保留時間等信息（見表1）。通過實驗獲得的質(zhì)譜信息并結(jié)合Agilent Mass Hunter 軟件對目標(biāo)物進(jìn)行質(zhì)譜庫對比，以保留時間、母離子和碎片離子精確質(zhì)量數(shù)、同位素豐度模型進(jìn)行比對確證，以母離子用于定量分析。由于方法中的碎片匹配采用了二級全離子圖譜匹配，所以匹配度比一般用特征子離子的方式有更高的可靠性和準(zhǔn)確度，效果更好，使得篩查的準(zhǔn)確度更高。

圖1 15 種堿性合成色素的UPLC-Q-TOF MS 提取離子色譜圖Fig.1 Extracted chromatograms of the 15 basic artificial dyes by UPLC-Q-TOF MS

表1 水產(chǎn)品中15 種堿性合成色素的保留時間和質(zhì)譜信息Table 1 Retention times and MS information for the 15 basic artificial dyes in fishery products

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

提取溶劑的優(yōu)化需同時考察目標(biāo)化合物和樣品基質(zhì)的特性，合適的提取劑可有效分離目標(biāo)物與基質(zhì)雜質(zhì)，從而增加對樣品中目標(biāo)物的檢測靈敏度。本實驗比較了4 種有機溶劑——乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷和丙酮，研究分析表明，乙腈最適合作為水產(chǎn)品中堿性合成色素的提取劑，回收率最高，達(dá)到90%。乙腈適用范圍廣，它不僅減少了對基質(zhì)中油脂的溶解，且可有效沉淀蛋白質(zhì)，減少雜質(zhì)對色素的干擾。二氯甲烷因溶劑密度大，提取液分布于底層，增加操作難度，回收率為82%；此外，以丙酮和乙酸乙酯提取色素時，回收率偏低，均在60% 以下。在確定了最優(yōu)提取劑的基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步分析了加入1%（v／v）乙酸的乙腈溶液對色素的提取效率，結(jié)果顯示加入乙酸后提取劑不僅保持了較好的回收率（達(dá)到96%），且能使目標(biāo)物離子化，為下一步提取液的分離凈化處理奠定了良好基礎(chǔ)。因此，本文確定最優(yōu)提取溶劑是含1%（v／v）乙酸的乙腈溶液。

2.2.2 凈化方法的優(yōu)化

本實驗選用3 種常用的固相萃取柱（C18柱、Oasis WCX 柱、Oasis MCX 柱）和C18復(fù)合硅膠基質(zhì)萃取管對水產(chǎn)品中色素的提取分離效率進(jìn)行比較分析，樣品中色素的回收率結(jié)果見表2。由表2 可知，以C18復(fù)合硅膠基質(zhì)萃取管為凈化載體時，樣品中色素的回收率最高，分析原因可能有以下幾個方面：①C18固相萃取小柱具有強疏水性，但吸附性較弱，導(dǎo)致15 種堿性合成色素回收率較低（在60%～75%之間）；②弱陽離子交換柱和陽離子固相萃取小柱平均色素回收率為85.13%和74.09%，但對個別目標(biāo)物如堿性橙II、蘇丹紅II 等的吸附能力較弱，達(dá)不到檢測方法要求的高通量檢測要求；③從表2 可以看出，自制C18復(fù)合硅膠混合基質(zhì)萃取管對15 種堿性合成色素的平均回收率高達(dá)96.58%，它通過不同吸附劑對目標(biāo)物進(jìn)行針對性的保留，有效地去除雜質(zhì)干擾，提高了堿性合成色素的凈化效率，縮短了檢測周期。同時對于萃取管中吸附劑的量進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：無水硫酸鎂的量在500 mg 及以上時處于過飽和狀態(tài)，達(dá)到良好的鹽析效果；當(dāng)C18和硅膠的配比為100 mg ∶40 mg 及以上時，對于回收率和凈化效果不再有明顯的促進(jìn)效果，因此考慮到成本及效果，最終選擇了吸附劑的使用量為500 mg無水硫酸鎂、100 mg C18粉末、40 mg 硅膠粉末。因此，本文確定使用C18復(fù)合硅膠基質(zhì)萃取管作為凈化載體，從而使15 種堿性合成色素物質(zhì)有較好的回收率，為水產(chǎn)品中色素的檢測方法提供了一個快速有效的凈化手段。

表2 不同萃取柱對水產(chǎn)品中15 種堿性合成色素的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的影響（n＝6）Table 2 Influence on the spiked recoveries and RSDs of the 15 target compounds in fishery products by different SPE cartridges （n＝6）

2.3 方法學(xué)確證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與精密度

配制0.1 ～500 μg／L（0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500 μg／L）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以分子離子峰面積（Y）對相應(yīng)的質(zhì)量濃度（X，μg／L）分別繪制15 種堿性合成色素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將10 μg／L 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測定6 次，計算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表3。從表3 可知，15 種堿性合成色素在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）≥0.993；RSD≤6.49%，說明儀器精密度良好。

表3 15 種堿性色素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)（r）和10 μg／L 時峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）Table 3 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients （r）and relative standard deviations （RSDs）of the 15 basic artificial dyes at 10 μg／L

2.3.2 檢出限、定量限與回收率

本文中的檢出限與定量限是根據(jù)3 倍和10 倍信噪比的要求進(jìn)行測定和計算的。實際操作中，我們根據(jù)10.0 μg／kg 的添加回收試驗（蘇丹紅III 和蘇丹紅IV 的加標(biāo)量分別為100.0 μg／kg 和50.0 μg／kg）中目標(biāo)化合物檢測到的色譜峰進(jìn)行3 倍信噪比的換算，最后確定為檢出限（LOD，S／N ＝3），而該色譜峰經(jīng)10 倍信噪比換算得到的含量為定量限（LOQ，S／N ＝10），最終通過采用初始流動相來稀釋，直到信噪比分別達(dá)到3 和10 時的含量，進(jìn)行最終各目標(biāo)物的檢出限和定量限的驗證。如表4 所示，15 種目標(biāo)物的LOD 在0.05 ～2.0 μg／kg 之間（蘇丹紅III 和蘇丹紅IV 的檢出限分別為50.0 μg／kg 和25.0 μg／kg），同時15 種色素的定量限小于5.0 μg／kg（蘇丹紅III 和蘇丹紅IV 的定量限分別為100.0 μg／kg 和50.0 μg／kg）。

在陰性的鯧魚樣品基質(zhì)中添加10、50 和200 μg／kg 3 種不同濃度水平的15 種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（蘇丹紅III 和蘇丹紅IV 的添加濃度分別為100、500、20 000 μg／kg），按1.3 節(jié)方法進(jìn)行預(yù)處理，采用UPLC-Q-TOF MS 測定提取液中的目標(biāo)化合物，且每個水平重復(fù)測定6 次，計算平均回收率及RSD，結(jié)果見表4。由表4 可知，在不同加標(biāo)濃度范圍內(nèi)，15 種堿性合成色素的回收率為80.60%～107.37%，RSD 為3.33%～6.69%。由15 種堿性合成色素的檢出限、定量限和回收率的實驗結(jié)果，可以看出本方法滿足快速篩查水產(chǎn)品中15 種堿性合成色素的需要。

表4 15 種堿性合成色素的回收率、RSDs、檢出限和定量限Table 4 Recoveries，RSDs，limits of detection （LODs）and limits of quantification （LOQs）of the 15 basic artificial dyes

2.3.3 方法應(yīng)用

選取市售22 份水產(chǎn)品——白蟹、富貴蝦、小黃魚、大黃魚、龍頭魚、黃姑魚、梅童魚、魚免魚、玉禿、鯧魚、帶魚、青占魚、馬鮫魚、鰳魚、鯖魚、魷魚、烏賊、海帶、海蜇、海地瓜、蟶子和文蛤作為方法驗證樣品基質(zhì)，并做了添加回收質(zhì)控樣（鯧魚樣品，模擬水平200 μg／kg），結(jié)果未發(fā)現(xiàn)陽性樣品，質(zhì)控樣回收率均大于80%。下一步將以水產(chǎn)制品為采集對象，擴(kuò)大篩查范圍和樣品種類。

將添加回收質(zhì)控樣以UPLC-Q-TOF MS 技術(shù)檢測分析，得到總離子流圖，對目標(biāo)物進(jìn)行相對分子質(zhì)量及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫檢索，結(jié)果可知15 種堿性合成色素化合物的匹配度均較高，其匹配度在85%以上。結(jié)果表明，經(jīng)過乙腈和乙酸混合液提取和C18復(fù)合硅膠基質(zhì)萃取管凈化，15 種堿性合成色素能夠被UPLC-Q-TOF MS 有效篩查出來。

3 結(jié)論

本文利用C18復(fù)合硅膠基質(zhì)萃取管提取凈化，結(jié)合UPLC-Q-TOF MS 技術(shù)，建立了水產(chǎn)品中15 種堿性合成色素的快速檢測方法。樣品前處理優(yōu)化了提取劑和萃取柱種類的選擇，對水產(chǎn)品中不同性質(zhì)的合成色素進(jìn)行了有效提取分離；并利用了Q-TOF MS 的精確質(zhì)量數(shù)定性功能對不同種類的色素化合物進(jìn)行篩查。與目前已報道的方法相比，前處理簡便、快捷、高效，數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)庫建立采用全息離子掃描的方式進(jìn)行，所有二級碎片的精確質(zhì)量和豐度都能用來匹配，適用于水產(chǎn)品中15 種堿性合成色素的快速篩選。

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