香菇C91-3轉(zhuǎn)錄本Unigene 24277基因克隆表達(dá)及其生物學(xué)活性的研究

田 麗， 鐘民濤， 劉 奔， 張 偉， 王曉麗， 李星云， 曹 婧， 寧安紅， 黃 敏

(大連醫(yī)科大學(xué) 微生物教研室，遼寧 大連 116044)

?

香菇C91-3轉(zhuǎn)錄本Unigene 24277基因克隆表達(dá)及其生物學(xué)活性的研究

田 麗， 鐘民濤， 劉 奔， 張 偉， 王曉麗， 李星云， 曹 婧， 寧安紅， 黃 敏*

(大連醫(yī)科大學(xué) 微生物教研室，遼寧 大連 116044)

通過(guò)對(duì)香菇C91-3轉(zhuǎn)錄本Unigene 24277基因的生物信息學(xué)分析，克隆表達(dá)含RCC1結(jié)構(gòu)域的Unigene 24277基因，并研究其抗腫瘤活性。從香菇C91-3菌絲體中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并利用Rapid Amplification of cDNA Ends(RACE)技術(shù)獲得基因全長(zhǎng)。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分析提示其含有RCC1結(jié)構(gòu)域。PCR擴(kuò)增RCC1結(jié)構(gòu)域，將其克隆產(chǎn)物與pET-32a(+)載體連接，熱轉(zhuǎn)化至E.coilRosetta-gami(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，純化、復(fù)性后，通過(guò)MTT法研究其抗腫瘤活性。結(jié)果顯示原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，重組蛋白成功誘導(dǎo)表達(dá)，并初步證明了重組蛋白具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性的功能，為后續(xù)抗腫瘤機(jī)制的探究奠定了基礎(chǔ)。

香菇C91-3；克隆；生物信息學(xué)；RCC1

香菇芳香獨(dú)特，具有健脾益氣，扶正祛邪，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，防治癌癥等功效[1]。目前，香菇多糖已作為臨床藥物應(yīng)用于惡性腫瘤的輔助治療。本課題組經(jīng)多年研究從擔(dān)子菌綱傘側(cè)耳科真菌香菇中分離得到了1株食用真菌香菇，命名為香菇菌C91-3，并通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其發(fā)酵液具有良好的抗腫瘤作用[2]。本課題組曾對(duì)發(fā)酵液中的多糖進(jìn)行提取研究,發(fā)現(xiàn)此多糖是通過(guò)免疫調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)其體內(nèi)抗腫瘤作用的，并無(wú)體外直接抗腫瘤作用。因此，本課題組希望能夠開發(fā)香菇C91-3菌株中的有效抗腫瘤蛋白成分。利用基因功能組學(xué)對(duì)香菇C91-3轉(zhuǎn)錄組基因進(jìn)行研究，通過(guò)solexa高通量轉(zhuǎn)錄組從頭組裝測(cè)序技術(shù)，對(duì)香菇菌C91-3的轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行檢測(cè)，成功獲得轉(zhuǎn)錄組Unigene序列，再利用生物信息學(xué)分析軟件獲取轉(zhuǎn)錄組中大量的Unigene對(duì)應(yīng)的功能注釋信息。目前，課題組已成功研究出來(lái)自香菇C91-3轉(zhuǎn)錄組的相關(guān)蛋白Unigene 24414具有促進(jìn)腫瘤凋亡的作用[3]。本研究采用相同方法篩選出Unigene 24277基因，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)3′-Full RACE、5′-Full RACE方法獲得基因全長(zhǎng)，繼而進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將其產(chǎn)物與載體連接、轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌E.coliRosetta-gami(DE3)中。然后利用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，鎳柱親和層析得到純化的單一蛋白，尿素梯度透析復(fù)性，3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyl-tetrazolium Bromide(MTT)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有一定的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性，為后續(xù)深入研究誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡活性及作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 克隆載體pMD-19-T Simple Vector購(gòu)自TaKaRa(大連)公司，表達(dá)載體pET-32a(+)為本實(shí)驗(yàn)室保存，宿主大腸埃希菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存，宿主表達(dá)菌Rosetta-gami(DE3)購(gòu)自TaKaRa(大連)公司。

1.1.2 試劑 總RNA提取Trizol試劑盒，3′-Full RACE Core Set Ver 2.0、5′-Full RACE Kit、BigDye Terminater V3.1購(gòu)自invitrogen公司；Cycle Sequencing Kit、Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒及實(shí)驗(yàn)所需各種引物、酶類均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)購(gòu)自TIANGEN公司；酵母提取物、胰蛋白胨購(gòu)自O(shè)XOID公司；Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)；BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 低溫離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))，PCR擴(kuò)增儀(Takara Thermal Cycler TP600，Takara BIO INC．)，核酸電泳儀(Mupid，ADVANCE-BIO Co．，Ltd)，凝膠成像分析系統(tǒng)(北京六一實(shí)驗(yàn)儀器廠)，紫外分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 篩選Unigene 24277基因 將香菇C91-3轉(zhuǎn)錄組中的大量Unigene基因進(jìn)行功能注釋，成功篩選出Unigene 24277基因。

1.2.2 香菇C91-3菌株總RNA提取及引物設(shè)計(jì) 取綜合馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)18 d的香菇C91-3菌株的菌絲體，在研缽中加入液氮充分研磨，利用Trizol試劑盒，按照說(shuō)明進(jìn)行一步法提取總RNA，將所得總RNA溶于50 μL DEPC水中。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，采用Oligo 6.0軟件，設(shè)計(jì)合成3′-RACE、5′-RACE實(shí)驗(yàn)所需特異性引物。引物序列見表1。使用3′-Full RACE Core Set Ver 2.0、5′-Full RACE Kit試劑盒。將3′-Full RACE反應(yīng)和5′-Full RACE反應(yīng)獲得的基因片段拼接，將所得基因全長(zhǎng)測(cè)序。

表1 引物序列

1.2.3 Unigene 24277基因全長(zhǎng)的生物信息學(xué)分析 應(yīng)用DNAstar軟件對(duì)Unigene 24277基因編碼產(chǎn)物進(jìn)行分析，再利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Unigene 24277蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，分析其同源性及可能包含的功能域。

1.2.4 亞克隆目的基因Unigene 24277中的RCC1結(jié)構(gòu)域 ①引物設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)Unigene24277基因中染色體濃縮調(diào)控蛋白(Regulator of chromosome condensation,RCC1)結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR特異性引物，引物序列見表1。②RNA反轉(zhuǎn)錄：使用TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0(Code No. D314)合成cDNA。反應(yīng)體系：香菇菌絲體Total RNA 1 μg，3′ RACE Adaptor(5 μmol/L) 1 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L each) 1 μL，RNase Free dH2O 7.5 μL。反應(yīng)條件：70 ℃，10 min，立即冰上放置2 min。然后加入下列組分：5×M-MLV Buffer 2 μL； RNase Inhibitor(40 U/μL) 0.25 μL，Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(200 U/μL) 0.25 μL。反應(yīng)條件：42 ℃，60 min，最后70 ℃，15 min。③PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因：使用PrimeSTAR?HS DNA Polymerase(Code No.DR010S)，以所得到的cDNA為模板，以具有EcoRⅠ和XhoⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)的PCR反應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：98 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。并利用凝膠回收試劑盒將PCR產(chǎn)物純化回收。

1.2.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 純化的PCR產(chǎn)物與pET-32a(+)載體分別利用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切處理，然后將Unigene 24277基因與pET-32a(+)載體相連并轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌Rosetta-gami(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，同時(shí)將單獨(dú)的質(zhì)粒pET-32a(+)也轉(zhuǎn)入Rosetta-gami(DE3)中作為空載體陰性對(duì)照，分別涂布于含4種抗生素(羧芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素)的LB平板上。篩選陽(yáng)性克隆，接種于含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定，并將含RCC1的重組質(zhì)粒命名為pET-32a(+)-RCC1，將不含RCC1的空載體質(zhì)粒命名為pET-32a(+)。同時(shí)將Rosetta-gami(DE3)單純菌種接種于三抗(四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素)培養(yǎng)基中相同條件下培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用于輔助重組質(zhì)粒鑒定。

1.2.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 從陽(yáng)性克隆平板及陰性對(duì)照平板上分別挑取單個(gè)菌落，接種于含4種抗生素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按10%接種量接入含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入1 mmol/L的IPTG，于37 ℃誘導(dǎo)2、4、6 h，4 ℃離心收集細(xì)菌，并利用12% SDS PAGE電泳及Western Blot檢測(cè)重組蛋白誘導(dǎo)情況。

1.2.7 重組蛋白純化及復(fù)性 利用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(包涵體蛋白)純化。因?qū)游鲋鶎?duì)重組蛋白末端的His-tag標(biāo)簽具有親和性，使得重組蛋白與雜蛋白得到分離。依照試劑盒說(shuō)明操作：首先利用細(xì)菌裂解液破菌，然后將沉淀重懸于Binding buffer中，使包涵體充分溶解，收集上清液，加入層析柱，配制Binding buffer洗去雜蛋白，Elution buffer洗脫目的蛋白，最終得到純化的單一蛋白。將無(wú)活性的包涵體蛋白利用尿素梯度透析的方法復(fù)性，冷凍干燥濃縮。

1.2.8 重組蛋白活性的初步鑒定 利用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)目的蛋白濃度。MTT法檢測(cè)重組蛋白對(duì)子宮頸癌Hela細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5×104個(gè)/mL，加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。待細(xì)胞單層鋪滿孔底，以RPMI-1640作為陰性對(duì)照，用RPMI-1640調(diào)整蛋白濃度分別為12.5、25、50、100、200 μg/mL作為實(shí)驗(yàn)組。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2孵箱中分別孵育24和48 h，然后每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5% MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩器振蕩10 min后在酶標(biāo)儀589 nm處測(cè)量各孔的吸光值。按照下面公式計(jì)算抑瘤率：IR(inhibited rate)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。利用spss13.0軟件分析其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 Unigene 24277基因全長(zhǎng)的獲得

按照1.2.2方法獲得3′-Full RACE和5′-Full RACE基因片段，再進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳(如圖1)進(jìn)行驗(yàn)證。將3′-Full RACE和5′-Full RACE獲得的基因片段拼接，經(jīng)測(cè)序Unigene 24277基因全長(zhǎng)為1 215 bp。

圖1 RACE結(jié)果Fig.1 The result of RACEA：M：DL2 000 DNA Marker；1：3′-Full RACE PCR 產(chǎn)物(M-MLV-)；2：3′-Full RACE PCR 產(chǎn)物(M-MLV+)。B：M：DL2 000 DNA Marker；1：5′-Full RACE PCR 產(chǎn)物(M-MLV-)；2：5′-Full RACE PCR 產(chǎn)物(M-MLV+)A：M：DL2 000 DNA Marker；1：The PCR product of 3′-Full RACE(M-MLV-)；2：The PCR product of 3′-Full RACE(M-MLV+).B：M：DL2 000 DNA Marker；1：The PCR product of 5′-Full RACE(M-MLV-)；2：The PCR product of 5′-Full RACE(M-MLV+)

2.2 序列全長(zhǎng)及亞克隆目的基因的生物信息學(xué)分析

使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索序列全長(zhǎng)核苷酸相似性，結(jié)果顯示并無(wú)相似性的基因序列，表明此基因是一新型基因。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)功能結(jié)構(gòu)域(如圖2)，結(jié)果顯示Unigene 24277蛋白具有RCC1結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有殺傷腫瘤細(xì)胞、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及抗腫瘤等多種生物學(xué)功能。亞克隆目的基因Unigene 24277中的RCC1結(jié)構(gòu)域所對(duì)應(yīng)的核酸序列大小為720 bp，翻譯成240個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)大小約為26 kDa。

圖2 Unigene 24277氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast結(jié)果Fig.2 The result of Unigene 24277 amino acid sequence blast in NCBI database

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定結(jié)果

按照1.2.5方法培養(yǎng)連接并轉(zhuǎn)化好的E.coliRosetta-gami(DE3)菌株及未轉(zhuǎn)化的E.coliRosetta-gami(DE3)菌株。提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(如圖3)。由于E.coliRosetta-gami(DE3)菌株自身含有一個(gè)質(zhì)粒，且具有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，因此電泳顯示雙酶切后的重組質(zhì)粒有4條條帶，與圖4中的第4泳道對(duì)比，可知其中第2、3條帶為菌株自身酶切后條帶，第1、4條帶為重組質(zhì)粒酶切后條帶，第4條帶處于720 bp左右位置，與目的條帶大小一致，證明重組原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.4 重組蛋白表達(dá)及鑒定

重組蛋白陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌及空載體陰性對(duì)照菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，產(chǎn)物經(jīng)12% SDS PAGE檢測(cè)(如圖4)，與陰性對(duì)照比較，在相對(duì)分子質(zhì)量46 kDa左右有明顯的重組蛋白表達(dá)條帶，比RCC1結(jié)構(gòu)域片段大20 kDa左右，為連接的載體pET-32a(+)大小。通過(guò)Western Blot進(jìn)一步證明該蛋白條帶為所要目的條帶(如圖5)，說(shuō)明重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功。

2.5 重組蛋白純化

重組蛋白經(jīng)鎳柱親和層析純化后產(chǎn)物用12% SDS PAGE鑒定，結(jié)果(如圖6)顯示在洗脫液第3、4、5管得到單一的目的蛋白，表明蛋白純化成功。

圖3 重組質(zhì)粒雙酶切Fig.3 Recombinant plasmid digested with EcoRⅠ和XhoⅠM：DL8 000 DNA Marker；1： 未酶切的重組質(zhì)粒；2：雙酶切的重組質(zhì)粒；3：未酶切的E.coli Rosetta-gami(DE3)質(zhì)粒；4：雙酶切的E.coli Rosetta-gami(DE3)質(zhì)粒M：DL8 000 DNA Marker；1：Not be digested of Recombinant plasmid；2：Double digested of recombinant plasmid；3：Not be digested of E.coli Rosetta-gami(DE3)plasmid；4：Double digested of E.coli Rosetta-gami(DE3) plasmid

圖4 SDS PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物Fig.4 SDS PAGE identification of expression productsM：Protein molecular wight maker(low)；1：誘導(dǎo)6 h的空載體-陰性對(duì)照；2：未誘導(dǎo)的重組蛋白；3：誘導(dǎo)2 h的重組蛋白；4：誘導(dǎo)4 h的重組蛋白；5：誘導(dǎo)6 h重組蛋白M：Protein molecular wight maker(low)；1：Empty vector after induced 6 h-negative control；2：Not be induced of the recombinant proteins；3：The recombinant proteins after induced 2 h；4：The recombinant proteins after induced 4 h；5：The recombinant proteins after induced 6 h

圖5 Western Blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物Fig.5 Western Blot identification of expression products1：誘導(dǎo)2 h重組蛋白；2：誘導(dǎo)4 h重組蛋白；3：誘導(dǎo)6 h重組蛋白；4：誘導(dǎo)6 h空載體-陰性對(duì)照1：The recombinant proteins after induced 2 h；2：The recombinant proteins after induced 4 h；3：The recombinant proteins after induced 6 h；4：Empty vector after induced 6 h-negative control

圖6 重組蛋白的純化Fig.6 Purification of recombinant proteins1：Protein molecular wight maker(low)；2：binding重懸上清液；3：流穿液；4：洗脫第1管；5：洗脫第2管；6：洗脫第3管；7：洗脫第4管；8：洗脫第5管1：Protein molecular wight maker(low)；2：The binding supernatant after resuspended；4：The first tube eluent；5：The second tube eluent；6：The third tube eluent；7：The fourth tube eluent；8：The fifth tube eluent

2.6 重組蛋白抗腫瘤活性初步鑒定

按照1.2.8，利用MTT法檢測(cè)重組蛋白對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制活性。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果(圖7)顯示，重組蛋白對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，且其抑制作用隨著質(zhì)量濃度和時(shí)間的加大而增大，存在一定的濃度和時(shí)間依賴性，當(dāng)質(zhì)量濃度為200 μg/mL，培養(yǎng)48 h后，抑瘤率可達(dá)62.6%，與對(duì)照組比較，各質(zhì)量濃度差異均具有顯著性。

圖7 不同質(zhì)量濃度重組蛋白作用Hela細(xì)胞后的MTT結(jié)果Fig.7 The MTT result of Hela cells after treated with different concentrations of recombinant proteins

3 討 論

目前，惡性腫瘤發(fā)病率逐年升高，控制及治療腫瘤是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的一個(gè)重要問題。最近研究發(fā)現(xiàn)，香菇能提高機(jī)體的免疫力，阻止癌細(xì)胞發(fā)生，對(duì)已誘發(fā)的癌細(xì)胞亦有抑制作用[4]。本研究主要是為了開發(fā)香菇C91-3轉(zhuǎn)錄組中的一條與抗腫瘤相關(guān)的基因。通過(guò)提取香菇C91-3菌絲體總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用RACE方法獲得基因全長(zhǎng)，生物學(xué)信息分析后，預(yù)測(cè)其具有RCC1結(jié)構(gòu)域，PCR擴(kuò)增獲得較純且濃度較高的RCC1結(jié)構(gòu)域序列片段。本研究利用PET-32a(+)構(gòu)建了原核表達(dá)載體，該表達(dá)載體具有生長(zhǎng)速度快、表達(dá)能力強(qiáng)、操作方便、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，是目前比較成熟的表達(dá)系統(tǒng)[5-6]，同時(shí)使用E.coliRosetta-gami(DE3)表達(dá)宿主菌，加強(qiáng)了原核表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性[7]。本研究成功將重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)并對(duì)其活性進(jìn)行了初步鑒定，其結(jié)果顯示Unigene 24277蛋白對(duì)Hela細(xì)胞具有明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，同時(shí)也證明了包涵體蛋白Unigene 24277復(fù)性成功，具有一定抗腫瘤活性。

RCC1是目前唯一已知的Ran鳥嘌呤核苷酸交換因子。RCC1是位于間期細(xì)胞核內(nèi)與染色體結(jié)合的蛋白，能夠調(diào)節(jié)RanGDP到RanGTP的轉(zhuǎn)換，在細(xì)胞核內(nèi)輸、外運(yùn)，有絲分裂期紡錘體的形成及核膜的重組，防止S期DNA多重復(fù)制等過(guò)程中發(fā)揮作用。RCC1作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子在許多機(jī)體的細(xì)胞中發(fā)揮作用[8-9]，但目前仍未發(fā)現(xiàn)有關(guān)RCC1與腫瘤細(xì)胞關(guān)系的明確報(bào)道。細(xì)胞周期的改變可能導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，如癌癥。本研究發(fā)現(xiàn)含有RCC1結(jié)構(gòu)域的Unigene 24277蛋白具有明顯的抗腫瘤細(xì)胞作用，該蛋白是否是通過(guò)RCC1結(jié)構(gòu)域功能影響腫瘤細(xì)胞周期，從而引起細(xì)胞凋亡或壞死達(dá)到抑制腫瘤的目的，其詳細(xì)機(jī)制有待今后進(jìn)一步研究。

[1] Mizuno M，Nishitani Y．Immunomodulating compounds in Basidiomycetes[J]．Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition，2013，52(3)：202-207．

[2] 鐘民濤，王曉麗，李星云，等．香菇C91-3菌絲發(fā)酵蛋白對(duì)H22腫瘤細(xì)胞體內(nèi)外抗腫瘤機(jī)制的初探[J]．中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2011，3(9)： 816-823．

[3] 劉奔，鐘民濤，王曉麗，等．香菇菌C91-3凋亡相關(guān)蛋白24414對(duì)人肺癌細(xì)胞A549凋亡作用及其機(jī)制的研究[J]．中華腫瘤防治雜志，2012，19(6)：428-431．

[4] 楊麗梅．香菇多糖治療惡性腫瘤臨床應(yīng)用[J]．中國(guó)民康醫(yī)學(xué)，2013，20： 97-98．

[5] Bachran C，Abdelazim S，F(xiàn)attah R J，et al．Recombinant expression and purification of a tumor-targeted toxin inBacillusanthracis[J]．Biochemical and Biophysical Research Communications， 2013，430：150-155．

[6] Jeong T H，Son Y J，Ryu H B，et al．Soluble expression and partial purification of recombinant human erythropoietin fromE.coli[J]．Protein Expression and Purification，2014，95： 211-218．

[7] Ruijun Li，Xueming Dan，Anxing Li．Siganus oramin recombinant L-amino acid oxidase is lethal toCryptocaryonirritans[J]．Fish & Shellfish Immunology，2013，35：1867-1873．

[8] Hitakomate E，Hood F E，Sanderson H S，et al．The methylated N-terminal tail of RCC1 is required for stabilisation of its interaction with chromatin by Ran in live cells[J]．BMC Cell Biology，2010，11(43)：1471-2121．

[9] Cushman I，Stenoien D，Moore M S．The Dynamic Association of RCC1 with Chromatin Is Modulated by Ran-dependent Nuclear Transport[J]．Molecular Biology of the Cell，2004，11(15)：245-255．

Cloning, Expression & Bio-Activity Study on Unigene 24277 Gene from Xianggu mushroom (Lentinula edodes) C91-3Transcript

TIAN Li, ZHONG Min-tao, LIU Ben, ZHANG Wei, WANG Xiao-li, LI Xing-yun, CAO Jing, NING An-hong, HUANG Min

(Teach. &Res.Div.ofMed.Microbiol.,DalianMed.Uni.,Dalian116044)

Xanggumushroom (Lentinulaedodes) C91-3gene transcripts Unigene 24277 was cloned and expressed in Unigene 24277 gene of RCC1 structure domain through bioinformatic analysis and studied its anti-tumor activity. Total RNA was extracted fromL.edodesC91-3mycelium, cDNA was synthesized by reverse transcription and obtained the full-length gene by Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) technology. The NCBI database analysis indicated that it contains RCC1 structure domain. Amplified the RCC1 structure domain by PCR and connected the cloned products with pET-32a (+) vector, thermal conversion intoE.coliRosetta-gami (DE3) to induce expression, after purification and refold, its anti-tumor activity was studied by MTT method. The results showed that prokaryotic expression vector was constructed successfully and successfully induced the expression of recombinant proteins. It was preliminary proved that the recombinant protein possessed the function of inhibiting tumor cell proliferation, and laid a foundation for the follow-up study on the exploration of the mechanism of anti-tumor.

xianggumushroom (Lentinulaedodes) C91-3; cloning; bioinformatics; RCC1

國(guó)家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目(81301955)

田麗 女，碩士研究生。主要研究方向?yàn)樯镆蛩乜鼓[瘤。E-mail: tian_li_good@yeah.net

* 通訊作者。男，教授，博士生導(dǎo)師。主要研究方向?yàn)樯镆蛩乜鼓[瘤。Tel：0411-86110007，E-mail: huangminchao@163.com

2014-10-29；

2015-01-12

Q935

A

1005-7021(2015)05-0047-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.05.009