入侵植物紫莖澤蘭葉內(nèi)生真菌多樣性研究

潘田揚(yáng)， 殷照青， 李仙杰， 韋 然， 管清瑩， 蔣 歡， 張漢波*

(1.云南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650091；2. 云南白藥集團(tuán)股份有限公司， 云南 昆明 650500)

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入侵植物紫莖澤蘭葉內(nèi)生真菌多樣性研究

潘田揚(yáng)1， 殷照青1， 李仙杰1， 韋 然1， 管清瑩1， 蔣 歡2， 張漢波1*

(1.云南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650091；2. 云南白藥集團(tuán)股份有限公司， 云南 昆明 650500)

外來入侵植物通常要和當(dāng)?shù)氐纳锇l(fā)生相互關(guān)系并對當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響。為表明葉內(nèi)生真菌是否有利于紫莖澤蘭(Eupatoriumadenophorum)的入侵力，首次調(diào)查了其葉內(nèi)生真菌多樣性。利用過夜冰凍組織法和常規(guī)的麥芽汁瓊脂平板培養(yǎng)法，分別于3、6月份從昆明西山、金殿種群分離得到312個(gè)菌株，根據(jù)其ITS基因差異，分為77個(gè)可操作分類單元(OTUs)，系統(tǒng)發(fā)育地位分布在Agaricomycetes、Dothideomycetes、Sordariomycetes和 Pezizomycetes 4個(gè)綱。在低階分類上這些真菌可分為19個(gè)屬，優(yōu)勢屬為鏈格孢屬(Alternaria)(25.09%)和炭疽菌屬(Colletotrichum)(10.80%)。有2.09%的菌株屬于未知真菌。相比較，6月份的紫莖澤蘭種群比3月份具有較高的內(nèi)生真菌多樣性。結(jié)果表明，入侵植物紫莖澤蘭葉內(nèi)生真菌非常豐富，這些真菌是否對紫莖澤蘭的入侵力具有影響值得今后深入研究。

紫莖澤蘭；入侵植物；內(nèi)生真菌多樣性；過夜冰凍組織法(ONFIT)；麥芽汁瓊脂平板培養(yǎng)法(MEA)

紫莖澤蘭(Eupatoriumadenophorum)是我國危害最為嚴(yán)重的外來入侵植物之一。其原產(chǎn)中美洲，大約于20世紀(jì)40年代從中緬邊境傳入云南省，現(xiàn)已在云南、貴州、四川、廣西、西藏等省區(qū)廣泛分布，并不斷向華中及華東方向蔓延。紫莖澤蘭入侵的地區(qū)，物種多樣性和生態(tài)穩(wěn)定性明顯降低，給我國的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境造成了巨大的損失，防治形勢極其嚴(yán)峻，因此了解其入侵機(jī)理對防治措施具有重要指導(dǎo)意義。目前有多個(gè)假說來解釋生物入侵機(jī)理，比較有說服力的有新武器假說(Novel Weapons)、天敵逃逸假說(Enemy Release Hypothesis，ERH)、積累當(dāng)?shù)夭≡⑸锛僬f(Accumulation of local pathogens)、空生態(tài)位假說(Empty Niche Hypothesis)等。最近有研究者認(rèn)為葉內(nèi)生菌能夠增強(qiáng)植物的生態(tài)競爭能力，從而促進(jìn)其入侵[1]，這一觀點(diǎn)正在成為當(dāng)前生物入侵機(jī)理的研究熱點(diǎn)。葉內(nèi)生真菌是指一大類全部或大部分時(shí)間生活在植物葉細(xì)胞內(nèi)或是細(xì)胞間隙，對植物未造成明顯疾病癥狀的真菌。它們通常能提高宿主抵抗不良環(huán)境的能力，比如抗干旱、抗動(dòng)物啃食、抗病原菌攻擊等[2]。然而，這些結(jié)果主要來自對本土植物的研究。直到最近，人們才認(rèn)識到外來植物垂直傳播(Vertically Transmitted Endophytes, VTEs)內(nèi)生真菌可能協(xié)助宿主入侵并建立種群[3]。比如，有內(nèi)生菌的植株更容易在環(huán)境中建立種群[1]；內(nèi)生真菌Neotyphodiumcoenophialum能夠促進(jìn)外來植物L(fēng)oliumarundinaceum入侵具有較高物種多樣性的生物群落[4]等。相反，水平傳播(Horizontally Transmitted Endophytes，HTEs)的內(nèi)生菌對宿主的作用卻很少引人注意[2]，外來植物水平傳播真菌的研究報(bào)道更是稀少。前期研究工作中我們發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭的葉內(nèi)生真菌主要是通過水平傳播在入侵地獲得[5]。那么，紫莖澤蘭的葉內(nèi)生真菌對其入侵力是否有影響呢？要回答這個(gè)問題，前提是系統(tǒng)探明紫莖澤蘭葉內(nèi)生真菌組成情況。本研究采用兩種分離葉內(nèi)生真菌的方法——過夜冰凍組織法(Overnight Freeze Incubation Technique，ONFIT法)和常規(guī)內(nèi)生真菌分離法(Malt-extract Agar,MEA法)，來探討紫莖澤蘭葉內(nèi)生真菌不同地點(diǎn)、季節(jié)的組成情況，為進(jìn)一步探討內(nèi)生真菌對紫莖澤蘭入侵力的影響研究提供實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)而為探明外來植物與本地微生物的相互作用關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

研究樣地為云南省昆明西山和金殿。西山樣地位于經(jīng)度(E)102°37.751，緯度(N)24°58.292，海拔1 953 m；金殿樣地位于經(jīng)度(E)102°47.253，緯度(N)25°05.145，海拔2 006 m。兩樣地受人為干擾少，紫莖澤蘭長勢旺盛，蓋度在90%～100%。在樣地內(nèi)選取長勢健康的紫莖澤蘭植株，剪取由上而下的第4對健康無病斑的葉片，分裝于紙質(zhì)信封中，帶回實(shí)驗(yàn)室24 h內(nèi)處理。每個(gè)季節(jié)每個(gè)樣地9個(gè)植株重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 分離方法 ①過夜冰凍組織法(ONFIT法): 將紫莖澤蘭葉片浸于70%酒精15 s，再浸入5% NaClO 3 min進(jìn)行表面消毒，置于無菌吸水紙上通風(fēng)干燥15 min，平鋪于裝有無菌水的滅菌塑料盒上，-20 ℃冰凍24 h后取出，用自封袋罩袋室溫放置6～7 d，觀察統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)的菌落形態(tài)和數(shù)量。每個(gè)樣地每個(gè)季節(jié)共研究9對葉片。②常規(guī)內(nèi)生真菌分離法(MEA法):將健康紫莖澤蘭葉片靠中部葉脈組織剪成2 mm2小片，浸于0.5% NaClO 2 min，再浸入70%酒精2 min，用無菌鑷子取出小葉片，將其平貼于2% MEA平板上。每葉片挑16小片放置，用封口膜封口，室溫下放置3 d后連續(xù)觀察統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)的菌落形態(tài)和數(shù)量。每個(gè)樣地每個(gè)季節(jié)共研究9對葉片。

1.2.2 菌株分子鑒定 采用CTAB真菌DNA提取法對分離得到的葉內(nèi)生真菌提取DNA，然后使用引物ITS4和ITS5對其ITS rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。使用3種限制性內(nèi)切酶(BsuRI/HaeIII酶、HinfI酶和RsaI酶)對ITS基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，3種酶切分型相同的歸為一個(gè)“可操作分類單元 (Operational Taxonomic Unit，OTU)”，每個(gè)OTU中選擇1個(gè)克隆為代表進(jìn)行ITS rRNA基因擴(kuò)增后，用小量膠回收試劑盒回收，送生物公司測序(深圳華大基因)。測序結(jié)果通過DNAStar、Chromas軟件校對，并在NCBI中BLAST比對下載已發(fā)表的最高相似序列，相關(guān)序列用MEGA 4軟件經(jīng)CLUSTALW比對，采用Jukes-Cantor模型構(gòu)建N-J樹。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 利用Shannon-Wiener(H)指數(shù)反映內(nèi)生真菌的多樣性。H=-∑PilnPi，其中，H表示Shannon多樣性指數(shù)，Pi表示第i個(gè)物種的比例，ln表示Pi的自然對數(shù)。為了比較不同群落的物種結(jié)構(gòu)差異，將每個(gè)OTU包含的菌株編輯成與代表菌株相同的序列，使用SONS軟件對不同地點(diǎn)、季節(jié)以及方法進(jìn)行種群結(jié)構(gòu)相似度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 物種多樣性分析

采用兩種實(shí)驗(yàn)方法共獲得312個(gè)菌株，其ITS rRNA基因經(jīng)3個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切后分為77個(gè)OTU。計(jì)算的多樣性指數(shù)表明2種方法分離內(nèi)生真菌的效果明顯不同(表1)。3月份樣品中，ONFIT法獲得的內(nèi)生真菌共有50株，其物種數(shù)有18種，而MEA法獲得的共36株內(nèi)生真菌中，其物種數(shù)有20種，多樣性指數(shù)約為ONFIT法的1.1倍；6月份樣品中，ONFIT法和MEA法分別獲得菌株118和108個(gè)，其物種數(shù)分別為23和51種，MEA法分離到的內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)為ONFIT法的近2.2倍。無論3月還是6月份，MEA法分離得到的物種多樣性指數(shù)均較ONFIT法高。

表1 ONFIT法和MEA法分離內(nèi)生真菌的比較

使用SONS軟件對不同地點(diǎn)、季節(jié)以及方法進(jìn)行種群相似度比較(表2)。由表2可見，來自于不同方法的種群差異最大；不同季節(jié)的差異次之；而不同地點(diǎn)的種群差異最小。因此，采用合適的分離方法對研究物種多樣性有明顯影響。

表2 使用SONS軟件對不同內(nèi)生菌種群進(jìn)行非參數(shù)估計(jì)

注：X、J分別表示從西山和金殿分離獲得的菌株；S、L分別表示于3月和6月分離獲得的菌株；O、M分別表示采用ONFIT法和MEA法分離獲得的菌株；字母后面的數(shù)字1、2分別表示菌株從西山、金殿分離獲得；θYC表示種群結(jié)構(gòu)相似指數(shù)，括號內(nèi)的值為標(biāo)準(zhǔn)誤差

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

將每個(gè)OTU選取代表菌株測序，成功59個(gè)(在GenBank上的登錄號為JX624261～JX624319)，代表了287個(gè)菌株。將代表菌株序列和其與NCBI上最近序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)?？梢钥闯?，這些真菌屬于2個(gè)門(Basidiomycota和 Ascomycota)的4個(gè)綱(Agaricomycetes、Dothideomycetes、Sordariomycetes和 Pezizomycetes)。

在低階分類上，這些真菌可分為19個(gè)屬(表3)。其中Alternaria和Colletotrichum為兩類優(yōu)勢菌，其比例分別為25.09%和10.80%。Alternaria由ONFIT法分離得到，在獲得的72個(gè)Alternaria菌株中，僅4株來自于MEA方法。而Colletotrichum多由MEA法得到，在獲得的31個(gè)Colletotrichum菌株中有21株是MEA法分離得到的。此外，Xylaria、Diaporthe、Phoma、Rachicladosporium四個(gè)屬的菌株數(shù)也較多。

MEA法能分離得到一些ONFIT法未能獲得的菌株，如Phanerochaete、Sordria、Nernania、Nodulisporium、Phyllosticta及Preussia，基本都出現(xiàn)于6月份通過MEA法獲得的內(nèi)生真菌中。系統(tǒng)樹上也可看出紫莖澤蘭葉內(nèi)生真菌的組成情況在3月份及6月份有所差異。

使用2種分離方法在3月份分離得到的內(nèi)生菌(屬水平)在6月份均可再分離到，但在6月份出現(xiàn)的Phanerochaete、Coprinopsis、Nemania、Nodulisporium、Lecythophora、Phyllosticta、Pezizomycetes菌株，在3月份均未分離到。

圖1 ITS rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree constructed from ITS rRNA gene sequences

符號△和▲分別表示菌株采用ONFIT法和MEA法在西山分離獲得；符號□和■分別表示菌株采用ONFIT法和MEA法在金殿分離獲得；符號后面的值為獲得的菌株數(shù)；相似序列后為該序列在GenBank的登錄號；樹上的值為bootstrap支持率；比例尺表示2%的序列差異；序列Dicrocoeliumdendriticum(Y11236)為外群

△ and ▲ represent strains isolated by ONFIT and MEA method from Xishan mountain, respectively; □ and ■ represent strains isolated by ONFIT and MEA method from Golden Temple, respetively; The values following the symbol represent strain number corresponding to the isolating method and location. GenBank accession numbers of reference sequences are shown in parentheses. Bootstrap values (1 000 replications) of >50% are indicated at branch nodes. The scale bar represents 2% estimated sequence divergence.Dicrocoeliumdendriticum(Y11236) is used as the outgroup

表3 兩種方法分離昆明西山、金殿樣地紫莖澤蘭葉內(nèi)生真菌在屬水平上的分布

3 討 論

前期工作發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭葉內(nèi)生真菌多樣性隨葉片年齡增加而遞增，第3、4、5對葉片物種數(shù)較高[5]；加上3月份有的紫莖澤蘭植株僅有4對健康葉片存在，因此，本次研究僅調(diào)查了植株第4對葉的內(nèi)生真菌組成情況。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫莖澤蘭葉內(nèi)生真菌在系統(tǒng)發(fā)育上屬于擔(dān)子菌門和子囊菌門的4個(gè)綱(圖1)，至少分為了19個(gè)屬(表2)。目前有關(guān)入侵植物水平傳播內(nèi)生真菌的研究工作很少，僅見Shipunov等對入侵北美的黑矢車菊(Centaureastoebe)的報(bào)道。他們從美國西北部至東部及加拿大境內(nèi)矢車菊中共分離得到的2 291株內(nèi)生真菌，來自8個(gè)綱，最為常見的屬為Alternaria。與矢車菊相比較，紫莖澤蘭的內(nèi)生菌組成范圍相對較窄。然而，未來擴(kuò)大地理范圍的研究工作應(yīng)當(dāng)能夠觀察到更加多樣的內(nèi)生真菌物種存在。有44.3%的紫莖澤蘭內(nèi)生真菌屬于Sordariomycetes綱，44.9%屬于Dothideomycetes綱，但83.8%的矢車菊菌株屬于Dothideomycetes綱。在屬水平，盡管兩種入侵植物的優(yōu)勢真菌都是Alternaria，但矢車菊其他常見的Botrytis及Fusarium在紫莖澤蘭中卻未分離得到，而紫莖澤蘭常見內(nèi)生菌如Colletotrichum、Xylaria、Rachicladosporium在矢車菊中也未出現(xiàn)(圖1、表3)。因此，同樣是菊科植物，其葉內(nèi)生真菌的物種組成有較大的差異。

內(nèi)生真菌通常能夠產(chǎn)生一些植物生長激素、蛋白因子等來促進(jìn)宿主植物的生長[6]。不過，Newcombe等[7]發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌對入侵植物黑矢車菊的生長一般呈負(fù)反饋?zhàn)饔?，只有?dāng)黑矢車菊與其他植物競爭時(shí)，內(nèi)生菌才通過產(chǎn)生化感物質(zhì)來抑制其他植物生長來增加宿主的競爭優(yōu)勢。這些結(jié)果表明植物內(nèi)生菌對宿主的生理功能比較復(fù)雜，受多種外界因素的影響。我們也發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌Colletotrichum對紫莖澤蘭的生長無明顯促進(jìn)作用，但對其逃逸天敵(抗昆蟲啃食)表現(xiàn)為一定程度的有利作用[8]。因此，這些優(yōu)勢內(nèi)生真菌對紫莖澤蘭入侵力的影響值得進(jìn)一步深入研究。

有報(bào)道表明入侵植物內(nèi)生真菌多數(shù)是一些非宿主專一性菌株，如Colletotrichum、Phoma等既有植物內(nèi)生菌也有植物泛病原菌?？梢钥吹剑瑥淖锨o澤蘭葉內(nèi)分離到的很多屬也是植物本身常見病原菌，如兩種優(yōu)勢菌鏈格孢菌Alternaria以及炭疽菌Colletotrichum。早期有報(bào)道表明從紫莖澤蘭葉病斑分離到的真菌很多屬于Alternaria[9]。這些結(jié)果暗示紫莖澤蘭葉內(nèi)生真菌與植物病原菌可能有很廣泛的聯(lián)系，未來值得深入研究這些從病斑與健康葉組織分離得到的內(nèi)生菌的遺傳關(guān)系。

從分離方法上看，普遍適用的MEA法確實(shí)能夠分離出更多樣的內(nèi)生真菌類群。 ONFIT法最初是用來分離鏈格孢菌(Alternaria)的有效方法，我們的研究發(fā)現(xiàn)其確實(shí)能夠分離出較多的鏈格孢菌。其分離出的內(nèi)生真菌種類明顯較少的原因之一可能在于，各種內(nèi)生真菌在冰凍葉片上蔓延生長，由于菌株間存在相互競爭關(guān)系，生長快的菌抑制了同區(qū)域內(nèi)其他菌的生長，后者不能形成可見菌落從而不能被分離出來[5]。此外，紫莖澤蘭6月份的內(nèi)生菌物種多樣性要比3月份高。這種差異可能與不同季節(jié)的環(huán)境因素有關(guān)，比如濕度[10]。因?yàn)槔ッ?月份較3月份潮濕，而很多水平傳播的真菌是通過孢子進(jìn)行傳播[2]，降水的增多有利于其孢子感染。此外，本次研究只對ITS基因進(jìn)行擴(kuò)增也限制了對其物種組成的準(zhǔn)確鑒定，未來采用多基因分析方法并結(jié)合形態(tài)學(xué)分類將能更準(zhǔn)確全面闡明紫莖澤蘭葉內(nèi)生真菌的多樣性。

由于本次研究的紫莖澤蘭種群僅來自昆明地區(qū)的2個(gè)樣點(diǎn)，取樣位置較接近，內(nèi)生真菌的物種組成差異是否隨地理環(huán)境改變而改變需要擴(kuò)大樣地進(jìn)行研究。其次，真菌生長受溫度影響較大，但昆明季節(jié)溫度差異不顯著，因此本次研究的結(jié)果尚不能很好地體現(xiàn)溫度差異對紫莖澤蘭內(nèi)生真菌的多樣性影響。

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Diversity of Foliar Endophytic Fungi of Invasive Plant Purpurstem Eupatorium (Eupatorium adenophorum)

PAN Tian-yang1, YIN Zhao-qing1, LI Xian-jie1, WEI Ran1, GUAN Qing-ying1, JIANG Huan2, ZHANG Han-bo1

(1.Coll.ofLfeSci.,YunnanUni.,Kunming650091; 2.YunnanBaiyaoGroupLtd.,Kunming650500)

An exotic invasive plant usually has mutual relation with local organisms and they will affect local eco-system. In order to show whether the foliar endophytic fungi (FEF) of purpurstem Eupatorium (PE) conduce to the invasion, the diversity of FEF of PE was investigated for the first time in this study. Fresh and healthy leaves of PE populations from Mt. Xishan and Golden Temple were collected in March and June, and a total of 312 fungal strains were isolated using routine MEA (malt-extract agar) and ONFIT (overnight freeze incubation technique). Based on the differences of ITS gene, these fungi were divided into 77 operational taxonomic units (OTUs), phylogenetically belonging to the Class of Agaricomycetes, Dothideomycetes, Sordariomycetes, and Pezizomycetes. At lower taxonomy level, they were divided into 19 genera, and the dominant fungi includeAlternariasp. (25.09%) andColletotrichumsp. (10.80%). There were 2.09% strains belonging to unknown fungi. Relatively, higher diversity of endophytes from PE was found in June than those in March. The results showed that FEF in invasive PE was rich, whether these fungi has any influences on the invasion of PE is worth to study deeper in the future.

Eupatoriumadenophorum; invasive plant; diversity of endophytic fungi; overnight freeze incubation technique (ONFIT); MEA method

云南大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(121067306)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30960077，31360153)

潘田揚(yáng) 女，大學(xué)本科。主要從事古生物學(xué)研究。E-mail: panty9@163.com

* 通訊作者。男，博士，教授，博士生導(dǎo)師。主要從事微生物生態(tài)學(xué)研究。Tel：0871-65031412， E-mail: zhhb@ynu.edu.cn

2014-03-14；

2015-03-19

Q93

A

1005-7021(2015)05-0073-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.05.013