啤酒花抗性機(jī)制的研究進(jìn)展

李憲臻， 王 偉， 蔣寶航， 楊 超， 孫 珍， 堵國(guó)成

(1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

?

·大家專版·

啤酒花抗性機(jī)制的研究進(jìn)展

李憲臻1,2， 王 偉1,2， 蔣寶航2， 楊 超2， 孫 珍2， 堵國(guó)成1

(1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

酒花苦味酸是構(gòu)成啤酒風(fēng)味的重要組分，也是啤酒生產(chǎn)過(guò)程中的天然抑菌劑，酒花苦味酸通過(guò)降低pH梯度而抑制啤酒花敏感菌生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，啤酒花抗性菌是通過(guò)膜上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將酒花苦味酸泵出細(xì)胞外，以降低膜上的質(zhì)子流速，維持了細(xì)胞內(nèi)的pH梯度。結(jié)合近年來(lái)酒花抗性相關(guān)研究結(jié)果，討論了細(xì)胞膜上酒花抗性相關(guān)組分與酒花抗性間的關(guān)系，提出了酒花抗性機(jī)制的模型。

啤酒；啤酒花；啤酒微生物；污染；苦味酸；酒花抗性

啤酒是一種微生物穩(wěn)定性飲料，但這并不能保證啤酒不被微生物污染，事實(shí)上，啤酒生產(chǎn)過(guò)程中常伴有某些特殊微生物污染，這些微生物的一個(gè)典型特征是具有啤酒花抗性[1]。雖然啤酒花抗性機(jī)制還不是很清楚，但大量研究已經(jīng)開始關(guān)注酒花抗性機(jī)制，本文對(duì)該領(lǐng)域研究的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 啤酒花抑制微生物生長(zhǎng)機(jī)制

啤酒花是一種含有復(fù)雜組分的天然產(chǎn)物，其中的α-酸由3種同系物組成、β-酸含有5種同系物，都是弱酸，較難溶于水[2]。異α-酸是影響啤酒微生物生長(zhǎng)的主要因素，pKa為3.0，是在麥汁煮沸過(guò)程中由 α-酸異構(gòu)化形成的，與α-酸和β-酸合稱為酒花苦味酸[3-4]。

酒花苦味酸是啤酒釀造中的天然殺菌劑，通過(guò)破壞細(xì)胞跨膜pH梯度而抑制微生物生長(zhǎng)[5]。但是，這種pH梯度破壞不是因?yàn)橐种屏薃TP產(chǎn)生或質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)ATPase酶活性，而是由于酒花苦味酸可自由過(guò)膜進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致質(zhì)子跨膜梯度破壞，因此，酒花苦味酸被定義為質(zhì)子載體[6]。酒花苦味酸的殺菌作用是由于其作為質(zhì)子載體，通過(guò)破壞影響質(zhì)子移動(dòng)勢(shì)(Proton motive force, PMF)的跨膜pH梯度，使胞內(nèi)pH降低而影響細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過(guò)程，進(jìn)而抑制啤酒花敏感菌的生長(zhǎng)[7]。

微生物的啤酒花抗性具有種間差異性，即使是同一種菌，也并非全部菌株都具有啤酒花抗性[8]。Schurr等[6]研究了酒花苦味酸抗微生物活性的分子機(jī)理以及質(zhì)子載體活性與錳結(jié)合上調(diào)抑制能力的關(guān)系。啤酒花化合物的關(guān)鍵成分是弱酸，為響應(yīng)細(xì)胞跨膜pH梯度，能以未解離酒花苦味酸Hop-H形式通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞[7,9]，在胞內(nèi)高pH環(huán)境下解離為酒花陰離子Hop-和質(zhì)子H+，Hop-在細(xì)胞內(nèi)捕捉到二價(jià)陽(yáng)離子如Mn2+，并與之結(jié)合形成Hop-Mn-Hop復(fù)合物后，擴(kuò)散出細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜上的H+/Mn2+交換產(chǎn)生質(zhì)子流。所釋放的質(zhì)子H+降低了胞內(nèi)pH并導(dǎo)致跨膜pH梯度散失和質(zhì)子移動(dòng)勢(shì)PMF降低[7,9]，結(jié)果妨礙了細(xì)胞內(nèi)必需的生理代謝，阻礙了PMF-驅(qū)動(dòng)的營(yíng)養(yǎng)吸收，使細(xì)胞死亡[9]。所以，啤酒花抑制是由于酒花苦味酸作為質(zhì)子載體，將質(zhì)子H+與胞內(nèi)二價(jià)陽(yáng)離子(如Mn2+)交換，驅(qū)散了跨膜pH梯度，降低了質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力PMF，導(dǎo)致啤酒花敏感菌株細(xì)胞死亡[7]，為此，可以將啤酒花抑制微生物生長(zhǎng)的機(jī)制總結(jié)如圖1所示。

圖1 啤酒花敏感菌的酒花抑制模型Fig.1 Hop inhibiting mechanism in hop-sensitive bacteria

錳等二價(jià)陽(yáng)離子在啤酒花的抑制機(jī)制中具有非常重要的作用，在啤酒花脅迫環(huán)境中，胞內(nèi)的二價(jià)陽(yáng)離子Mn2+等與解離的酒花陰離子Hop-結(jié)合后滲出細(xì)胞，導(dǎo)致胞內(nèi)二價(jià)陽(yáng)離子濃度下降，從而使細(xì)胞代謝速度逐漸降低[10]。事實(shí)上，啤酒花脅迫抗性機(jī)制就是處理胞內(nèi)酸化和能量產(chǎn)生的機(jī)制，在酒花苦味酸脅迫條件下，除了ATP能量降低和PMF消散，胞內(nèi)二價(jià)陽(yáng)離子庫(kù)的耗盡也是酒花脅迫的一個(gè)開關(guān)因子，使調(diào)控潛力消失，但啤酒花抗性細(xì)胞則能夠通過(guò)代謝變化和細(xì)胞壁成分改變等繞過(guò)或補(bǔ)償調(diào)控潛力的不足[10]。所以，影響酒花苦味酸抑菌活性的主要因素是pH值和酒花結(jié)合到陽(yáng)離子上的能力，低pH值能夠提高未解離酒花苦味酸在細(xì)胞質(zhì)膜上的容量，作為弱酸調(diào)節(jié)質(zhì)子流，而錳的作用是使解離的酒花苦味酸從膜內(nèi)返回到膜外，釋放二價(jià)離子并將另一個(gè)質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)[11]。

2 影響啤酒花抗性機(jī)制的膜組分

啤酒花抗性是多因子性狀，但迄今僅有少數(shù)膜組分被發(fā)現(xiàn)與酒花抗性有關(guān)，如horA、horB、horC和hitA等基因編碼的膜蛋白[12]。由于啤酒花是通過(guò)質(zhì)子載體功能破壞細(xì)胞跨膜pH梯度和降低質(zhì)子移動(dòng)勢(shì)PMF，所以這些基因編碼的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將酒花苦味酸泵出胞外以防止其在胞內(nèi)空間積累，賦予微生物細(xì)胞啤酒花抗性。但是，這些啤酒花抗性相關(guān)基因并非存在于所有啤酒花抗性微生物細(xì)胞中，且其表達(dá)水平也因抗性菌株和啤酒花濃度等不同而有所差異[12]，表達(dá)雙基因的細(xì)菌明顯快于表達(dá)單基因細(xì)菌的生長(zhǎng)速度[13]。

2.1 ATP-/PMF-依賴多藥抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HorA和HorC

Sami等[14]首先在Lactobacillusbrevis啤酒花抗性突變株中發(fā)現(xiàn)有3個(gè)與啤酒花抗性相關(guān)的基因horA、horB和horC，幾乎存在于所有啤酒腐敗乳酸菌中，并賦予乳酸菌啤酒花抗性。

基因horA編碼膜上ATP-依賴多藥抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于ATP結(jié)合盒超級(jí)家族，含有1個(gè)ATP-結(jié)合結(jié)構(gòu)域、6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、1個(gè)位于細(xì)胞質(zhì)中的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白保守序列，起多藥抗性泵的作用，在啤酒花苦味酸存在時(shí)，HorA能將胞內(nèi)積累的酒花苦味酸或其他毒性分子由胞內(nèi)排出細(xì)胞外[15]。

另外一個(gè)基因horC屬于抗瘤細(xì)胞分裂超級(jí)家族，也編碼一個(gè)多藥抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[15]，但與HorA相反，HorC不是ATP-依賴型的，它能利用質(zhì)子移動(dòng)勢(shì)PMF驅(qū)動(dòng)，將酒花苦味酸外排，其表達(dá)水平受轉(zhuǎn)錄調(diào)控子HorB控制[16]。與horA基因一樣，也含有1個(gè)ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，因?yàn)榈湫偷腁TP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有2個(gè)ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和2套跨膜結(jié)構(gòu)域，因此HorA和HorC也叫半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

基因horA和horC不是缺乏酒花苦味酸時(shí)生長(zhǎng)所必需的，因此不是啤酒腐敗菌的天生遺傳因素。當(dāng)在漸降啤酒花濃度的培養(yǎng)基中亞培養(yǎng)啤酒腐敗菌時(shí)，很多啤酒腐敗乳酸菌會(huì)自發(fā)丟失啤酒腐敗能力，并與horA和horC基因的丟失相伴隨[15]。因此，HorA和HorC的功能是降低未解離酒花苦味酸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)膜的流速。

2.2 二價(jià)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HitA

Hayashi等[11]首次提出基因hitA編碼蛋白是酒花抗性的調(diào)節(jié)因子，在啤酒花抗性中的作用是作為二價(jià)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，將胞內(nèi)二價(jià)陽(yáng)離子Mn2+等泵出細(xì)胞外，通過(guò)與胞內(nèi)二價(jià)陽(yáng)離子如Mn2+交換酒花苦味酸的質(zhì)子，實(shí)現(xiàn)質(zhì)子H+和Mn2+在膜上的交換，從而降低了跨膜二價(jià)陽(yáng)離子梯度。

2.3 質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)H+-ATPase酶

由于較高的胞內(nèi)pH值，當(dāng)酒花苦味酸進(jìn)入細(xì)胞后發(fā)生解離而釋放質(zhì)子H+，驅(qū)散了跨膜pH梯度，因此，當(dāng)遭遇高質(zhì)子流時(shí)，微生物會(huì)增加其在細(xì)胞質(zhì)膜中的質(zhì)子移動(dòng)勢(shì)PMF，提高將質(zhì)子排出胞外的速度[7]。事實(shí)上，啤酒花抗性微生物確實(shí)保有比啤酒花敏感菌更高的跨膜pH梯度，而且一旦適應(yīng)酒花苦味酸，啤酒花抗性菌中的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)H+-ATPase酶活性就會(huì)增加[6]，因此，膜上質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)H+-ATPase酶的功能是通過(guò)排出質(zhì)子以抵消酒花苦味酸的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)作用，協(xié)助啤酒花抗性菌維持跨膜pH梯度。實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，當(dāng)啤酒花抗性突變株適應(yīng)酒花苦味酸后，質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)H+-ATPase酶的表達(dá)量增加[6]。而當(dāng)適應(yīng)啤酒花脅迫的細(xì)胞在沒(méi)有酒花苦味酸存在時(shí)進(jìn)一步培養(yǎng)后，則H+-ATPase酶活性和表達(dá)水平又下降到適應(yīng)前水平[6]，因此由H+-ATPase驅(qū)動(dòng)的質(zhì)子泵是抗酒花苦味酸的重要因子。

2.4 ATP生成系統(tǒng)

無(wú)論是HorA與HorC多藥抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，還是質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)H+-ATPase酶，都需要通過(guò)消耗能量以破壞pH梯度的方式增加啤酒花抗性。但是啤酒是一種營(yíng)養(yǎng)貧乏培養(yǎng)基，難以支持細(xì)胞生理代謝，而酒花苦味酸的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)反應(yīng)又抑制了細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)吸收，說(shuō)明啤酒花抗性菌還有其他ATP產(chǎn)生途徑[17]。事實(shí)上，啤酒花抗性菌能夠通過(guò)消耗啤酒中的檸檬酸、丙酮酸、蘋果酸和精氨酸等進(jìn)行生長(zhǎng)，并產(chǎn)生大量ATP[17]，其中，蘋果酸進(jìn)入細(xì)胞經(jīng)脫羧反應(yīng)產(chǎn)生乳酸和CO2后，排出胞外而形成質(zhì)子移動(dòng)勢(shì)PMF，導(dǎo)致ATP合成；在檸檬酸代謝過(guò)程中，通過(guò)檸檬酸陰離子單相運(yùn)輸和質(zhì)子消耗形成質(zhì)子移動(dòng)勢(shì)PMF，產(chǎn)生ATP；丙酮酸在糖代謝途徑中通過(guò)形成乙酰磷酸高能化合物產(chǎn)生ATP；精氨酸脫亞胺酶途徑廣泛存在于乳酸菌，當(dāng)精氨酸被代謝為鳥氨酸、CO2和氨時(shí)產(chǎn)生ATP。雖然酒花苦味酸抑制營(yíng)養(yǎng)吸收，但卻未發(fā)現(xiàn)大幅抑制上述物質(zhì)的吸收，因?yàn)樗鼈儾⒉灰揽靠缒H梯度進(jìn)行運(yùn)輸。

2.5 磷壁酸

酒花苦味酸的靶點(diǎn)是細(xì)胞膜，在酒花苦味酸脅迫下，由于膜脂組分的變化，降低了酒花苦味酸的膜滲透能力[18]。磷壁酸是存在于細(xì)胞壁S-層蛋白下的一種與酒花抗性相關(guān)的表面特征結(jié)構(gòu)，半乳糖苷基甘油磷壁酸能增加細(xì)胞壁對(duì)酒花苦味酸的過(guò)膜障礙，抑制酒花苦味酸進(jìn)出細(xì)胞[6,18]。研究發(fā)現(xiàn)，在啤酒花抗性菌細(xì)胞壁中有半乳糖基甘油磷壁酸存在，而酒花適應(yīng)啤酒腐敗菌細(xì)胞壁中磷壁酸的含量也有明顯增加，且酒花抗性突變株細(xì)胞膜上的ATP能量池和ATPase酶活性也是增加的[19]。

3 多藥抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

微生物抵抗毒性化合物反應(yīng)和快速適應(yīng)周圍環(huán)境變化的能力，很大程度上是由于藥物抗性系統(tǒng)的強(qiáng)化表達(dá)，專一性使一種或一組密切相關(guān)藥物失活[20]。預(yù)防藥物進(jìn)入細(xì)胞的通用策略，是通過(guò)多藥抗性膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白消耗代謝能量，逆濃度梯度將藥物跨膜排出。根據(jù)跨膜運(yùn)輸所偶聯(lián)的能量模式，可將多藥抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為兩類[21]：屬于ATP結(jié)合盒超級(jí)家族的ATP-驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、質(zhì)子移動(dòng)勢(shì)PMF-驅(qū)動(dòng)的第二轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。后者是作為藥物/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮功能，依據(jù)其氨基酸序列同源性又可進(jìn)一步分為主要促進(jìn)家族MFS、小多藥抗性家族SMR、抗瘤細(xì)胞分裂家族RND、多藥和毒性化合物排泄家族MATE[20]。

ATP結(jié)合盒超級(jí)家族含有參與吸收或分泌的各種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也包括不參與轉(zhuǎn)運(yùn)但在細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮作用的ATPase酶，是一種與廣范圍底物吸收和分泌相關(guān)的膜蛋白，參與營(yíng)養(yǎng)吸收、外源性保護(hù)、細(xì)胞廢棄物排泄、滲透脅迫、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、生物合成過(guò)程中的大分子排出等[21]。

以Lactococcuslactis啤酒腐敗菌為例，膜上有3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。LmrA是ATP結(jié)合盒家族的同型二聚體，LmrCD是ATP結(jié)合盒家族的異型二聚體，LmrP是主要促進(jìn)家族MFS的第二轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。LmrA被稱為乳球菌多藥抗性蛋白[22]，LmrA的表達(dá)能夠賦予E.coli抗多種抗生素能力。LmrC和LmrD是由同一個(gè)小操縱子上的基因編碼的2個(gè)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠被分離為一個(gè)具有較高內(nèi)源ATPase酶活性的化學(xué)復(fù)合物[23]。

4 啤酒花抗性機(jī)制模型

迄今，已經(jīng)有多種啤酒花組分抑制機(jī)理被報(bào)道，包括細(xì)胞壁滲透性改變、細(xì)胞質(zhì)泄露及隨后的DNA、RNA、蛋白質(zhì)合成抑制、亮氨酸吸收和質(zhì)子載體活性變化等[9]，所有這些抑制作用都與胞內(nèi)pH值、二價(jià)陽(yáng)離子如Mn2+等密切相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在Lactococcuslactis菌中表達(dá)外源horA基因時(shí)，可以將酒花抗性提高1倍，說(shuō)明酒花抗性受HorA蛋白調(diào)控，并證實(shí)HorA能夠從膜上分泌親脂性酒花化合物到細(xì)胞外[24]，因此，HorA膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能通過(guò)消耗ATP將酒花苦味酸泵出細(xì)胞，以恢復(fù)跨膜pH梯度。

當(dāng)將缺失HorA的L.brevis菌置于酒花苦味酸環(huán)境中時(shí)，發(fā)現(xiàn)仍具有酒花抗性，這是因?yàn)榫苹辔端嶙鳛橘|(zhì)子載體在進(jìn)入細(xì)胞過(guò)程中，使質(zhì)子移動(dòng)勢(shì)PMF增加，帶動(dòng)PMF-驅(qū)動(dòng)的HorC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在缺失HorA的條件下，將酒花苦味酸泵出細(xì)胞，解除對(duì)跨膜pH梯度驅(qū)散的危害[15]。

但是，HorA和HorC的轉(zhuǎn)運(yùn)活性會(huì)引起酒花苦味酸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)子流降低，從而限制PMF-驅(qū)動(dòng)的酒花苦味酸驅(qū)散作用。然而，L.brevis菌的抗性能夠響應(yīng)很高的啤酒花濃度，因此，功能性表達(dá)HorA和HorC不足以賦予其這種高啤酒花抗性[17]。事實(shí)上，L.brevis菌強(qiáng)烈依賴于膜上的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)H+-ATPase酶，當(dāng)L.brevis菌適應(yīng)酒花苦味酸時(shí)，質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)H+-ATPase酶活性增加，而去除酒花時(shí)的ATPase酶功能性表達(dá)又逐漸下降，這種增加的表達(dá)量能夠允許L.brevis菌保持質(zhì)子移動(dòng)勢(shì)PMF活性和pH梯度[6]。所以，盡管HorA和HorC降低了質(zhì)子流速，但H+-ATPase酶通過(guò)將更多質(zhì)子泵出細(xì)胞而補(bǔ)償了PMF散失和pH降低作用，ATP-驅(qū)動(dòng)HorA和PMF-驅(qū)動(dòng)HorC與H+-ATPase的聯(lián)合反應(yīng)，使L.brevis菌對(duì)啤酒花具有抗性[6]。

綜合啤酒花抗性機(jī)制相關(guān)研究成果，可以給出啤酒花抗性機(jī)制模型如圖2所示。在啤酒花抗性細(xì)胞中，當(dāng)未解離的酒花苦味酸Hop-H滲入細(xì)胞質(zhì)膜后，能夠被細(xì)胞膜上的ATP-驅(qū)動(dòng)HorA和PMF-驅(qū)動(dòng)HorC多藥抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從細(xì)胞質(zhì)膜中逐出胞外。但是，也有部分Hop-H避開轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入胞漿，并受胞內(nèi)高pH值影響而解離為陰離子Hop-和質(zhì)子H+，同時(shí)，胞外H+也能通過(guò)HorC反應(yīng)與Hop-H逆向運(yùn)輸進(jìn)入胞內(nèi)，導(dǎo)致跨膜pH梯度的下降。為了防止胞漿酸化并維持跨膜pH梯度，質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)H+-ATPase酶過(guò)表達(dá)而將H+排出胞外。跨膜pH梯度和PMF的維持需要消耗能量，在啤酒花抗性細(xì)胞中，這些啤酒花抗性機(jī)制的能源來(lái)源于檸檬酸、丙酮酸、蘋果酸和精氨酸等代謝產(chǎn)生的ATP，在某些情況下，可發(fā)酵糖如麥芽三糖等也能被用于產(chǎn)生ATP。因此，在啤酒花抗性細(xì)胞中，由ATP/PMF驅(qū)動(dòng)的多藥抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白組成的質(zhì)子分泌系統(tǒng)，將酒花苦味酸分泌到胞外介質(zhì)中以保持胞內(nèi)pH，而檸檬酸代謝等提供的ATP為細(xì)胞生長(zhǎng)提供能量[7]。在啤酒抗性菌細(xì)胞壁中，半乳糖基甘油磷壁酸和細(xì)胞質(zhì)膜中脂成分的變化也增加了酒花苦味酸的過(guò)膜障礙，降低了酒花苦味酸進(jìn)入細(xì)胞的速度[17]。二價(jià)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HitA通過(guò)泵出陽(yáng)離子，使Hop-無(wú)法形成復(fù)合物而停留在細(xì)胞中，從而降低酒花苦味酸進(jìn)入胞內(nèi)的速度，以維持跨膜pH梯度[11]。同時(shí)，質(zhì)子載體反應(yīng)并不嚴(yán)格受控于pH梯度[9]，因?yàn)樵诘唾|(zhì)子梯度時(shí)，細(xì)胞為了存活而改變了所需要的膜上離子梯度，亦即在啤酒花脅迫下從質(zhì)子梯度到作為驅(qū)動(dòng)力的鈉/鉀梯度的改變。

圖2 啤酒花抗性菌的啤酒花抗性機(jī)制模型Fig.2 Hop resistance mechanism modes in beer spoilage bacteria

5 啤酒花抗性的其他機(jī)制

5.1 谷氨酸脫羧酶系GAD酒花抗性機(jī)制

多因素響應(yīng)對(duì)處理能夠影響微生物生長(zhǎng)的啤酒復(fù)雜條件是必需的[25]，其中谷氨酸脫羧酶GAD系統(tǒng)的酸脅迫耐受機(jī)制對(duì)于酒花耐受和胞內(nèi)pH維持具有重要貢獻(xiàn)，是啤酒花抗性菌中重要的酸脅迫減緩系統(tǒng)[7]。L.brevis菌中的谷氨酸脫羧酶GAD系統(tǒng)是由1個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(Gad-tr)、1個(gè)谷氨酰γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GadC)和2個(gè)谷氨酸脫羧酶(GadB1, GadB2)組成[7]。為了評(píng)估GAD同工酶的特異性作用，Schurr等[7]在代謝和轉(zhuǎn)錄水平上比較了酒花苦味酸對(duì)L.brevis菌中GAD系統(tǒng)的影響。在酒花脅迫條件下，當(dāng)有谷氨酸存在時(shí)啤酒花耐受菌能很好地維持胞內(nèi)pH。啤酒花抗性菌和啤酒花敏感菌中的gad-tr、gadB1和gadC基因表達(dá)分別被上調(diào)和下調(diào)。因?yàn)間adB2基因表達(dá)非常穩(wěn)定，啤酒花敏感菌在酸脅迫下采用2個(gè)GAD同工酶，而啤酒花抗性菌則設(shè)法在只有一個(gè)同工酶(GadB2)時(shí)生存，因此可以通過(guò)誘導(dǎo)gadB1表達(dá)而控制額外的酒花脅迫。

GAD是基于由谷氨酸脫羧酶(GadB)催化的質(zhì)子消耗谷氨酸脫羧反應(yīng)和隨后的通過(guò)膜上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GadC)進(jìn)行胞外谷氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)催化的不依賴能量的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)[7]，這種過(guò)程的凈作用是將質(zhì)子從細(xì)胞質(zhì)中排出，導(dǎo)致胞內(nèi)pH增加和PMF產(chǎn)生。合成的脫羧反應(yīng)產(chǎn)物如GABA的3倍量排出可以證明啤酒花抗性菌細(xì)胞有足夠的PMF用于H+-ATPase介導(dǎo)ATP生成[26]。

5.2 氧脅迫誘導(dǎo)的酒花抗性機(jī)制

低pH環(huán)境與Mn2+存在時(shí)，會(huì)引發(fā)酒花苦味酸的跨膜氧化還原反應(yīng)，導(dǎo)致胞內(nèi)氧化損傷，因此，氧化劑抗性是酒花脅迫下細(xì)胞存活所必需的[18]。錳依賴跨膜氧化還原反應(yīng)在啤酒花抑制中起決定性作用[6]，因?yàn)殄i和酒花苦味酸都是高氧化還原活性底物，Mn2+-酒花苦味酸復(fù)合物與酒花苦味酸自身一樣，能夠參與跨膜氧化還原反應(yīng)，錳在抗菌機(jī)制中的作用是強(qiáng)烈加強(qiáng)電荷過(guò)膜滲透性[9]。

錳的氧化還原屬性因pH環(huán)境而改變[18]，堿性pH時(shí)Mn(II)是還原劑，酸性pH時(shí)Mn(III)是氧化劑[18]，同樣，酒花苦味酸的氧化還原屬性也因pH而改變。MnCl2的存在能夠提高酒花苦味酸的氧化和還原能力，說(shuō)明膜上的pH和MnCl2梯度能驅(qū)動(dòng)酒花苦味酸介導(dǎo)的跨膜氧化還原反應(yīng)[18]。代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，酒花脅迫條件下的氧脅迫相關(guān)蛋白包括環(huán)丙烷脂肪?；字铣擅窩FA、HitA和幾種氧化還原酶，說(shuō)明跨膜氧化還原反應(yīng)是由酒花苦味酸介導(dǎo)，所形成的錳復(fù)合物會(huì)引起胞內(nèi)氧脅迫性[10]。事實(shí)上，在細(xì)菌中，因較高的胞內(nèi)pH和高濃度Mn2+，酒花苦味酸滲入細(xì)胞質(zhì)膜后與Mn2+在膜-液內(nèi)界面形成Mn2+-酒花苦味酸復(fù)合物電子供體(還原態(tài))，并過(guò)膜轉(zhuǎn)移給膜-液外界面的電子受體酒花苦味酸(氧化態(tài))，因?yàn)檠趸€原反應(yīng)是可逆的，被氧化的錳-酒花苦味酸復(fù)合物留在胞內(nèi)作為電子受體，產(chǎn)生氧化脅迫[18]。因此，作為一個(gè)多因素動(dòng)態(tài)特性，啤酒花抗性至少對(duì)兩種不同的啤酒花抑制機(jī)制(質(zhì)子載體誘導(dǎo)和氧化應(yīng)激機(jī)制)具有不同的抗性水平[10]。

5.3 酵母酒花抗性機(jī)制

酒花苦味酸的反應(yīng)模型研究迄今幾乎只限于乳酸菌，Hazelwood等[27]則研究了Saccharomycescerevisiae抗酒花苦味酸的分子機(jī)制，其細(xì)胞生長(zhǎng)的酒花苦味酸濃度高于啤酒花抗性的原核細(xì)胞。酵母抗酒花苦味酸反應(yīng)一般包括3個(gè)主要過(guò)程：液泡型ATPase酶驅(qū)動(dòng)的質(zhì)子主動(dòng)運(yùn)輸將酒花苦味酸泵入并封存在液泡中、改變細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、將酒花苦味酸轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)質(zhì)膜。而且，酒花苦味酸作為強(qiáng)的鋅和鐵螯合劑能夠影響胞內(nèi)金屬離子平衡，由液泡-ATPase酶引起的液泡酸化為酒花苦味酸積累提供了驅(qū)動(dòng)力[27]。

S.cerevisiae采用互補(bǔ)細(xì)胞機(jī)制保護(hù)自身免受酒花苦味酸的干擾，消耗細(xì)胞質(zhì)中的酒花苦味酸是酒花抗性所必需的。首先，酵母菌為響應(yīng)酒花苦味酸而改變細(xì)胞壁組分，減少酒花苦味酸的接觸；然后將酒花苦味酸轉(zhuǎn)出細(xì)胞質(zhì)到胞外介質(zhì)、甚至是液泡中；最后，Zn2+和Fe2+水平的胞內(nèi)平衡上調(diào)Aft1p-和Zap1p-調(diào)劑基因，抵消了酒花苦味酸對(duì)金屬離子的螯合[28]。

6 展 望

由于啤酒工廠的長(zhǎng)期生產(chǎn)和大氣環(huán)境的惡化，不僅已發(fā)現(xiàn)的乳酸菌污染啤酒的頻率在增加，其他各種非乳酸菌污染也時(shí)有發(fā)生。酒花苦味酸的抑菌機(jī)制與膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及細(xì)胞膜組分改變密切相關(guān)，但為什么酒花抗性存在種間差異，為什么同一種菌中并非所有的菌株都具有酒花抗性，酒花苦味酸如何啟動(dòng)膜上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過(guò)表達(dá)，很多問(wèn)題尚待揭示。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)手段逐漸引入酒花抗性機(jī)制研究，并將為酒花抗性機(jī)制研究提供重要的研究手段，為啤酒安全生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

[1] Sakamoto K, Konings W N. Beer spoilage bacteria and hop resistance[J]. Int J Food Microbiol, 2003, 89(2-3): 105-124.

[2] Moir M. Hops: A millennium review[J]. J Am Soc Brew Chem, 2000, 58(4): 131-146.

[3] Intelmann D, Hofmann T. On the autoxidation of bitter-tasting iso-alpha-acids in beer[J]. J Agric Food Chem, 2010, 58 (8): 5059-5067.

[4] Intelmann D, Haseleu G, Dunkel A, et al. Comprehensive sensomics analysis of hop-derived bitter compounds during storage of beer[J]. J Agric Food Chem, 2011, 59 (5): 1939-1953.

[5] Leite IR, Faria JR, Marquez L D S, et al. Evaluation of hop extract as a natural antibacterial agent in contaminated fuel ethanol fermentations[J]. Fuel Process Technol, 2013, 106(2): 611-618.

[6] Schurr B C, Hahne H, Kuster B, et al. Molecular mechanisms behind the antimicrobial activity of hop iso-acids inLactobacillusbrevis[J]. Food Microbiol, 2015, 46(46): 553-563.

[7] Schurr B C, Behr J, Vogel R F. Role of the GAD system in hop tolerance ofLactobacillusbrevis[J]. Eur Food Res Technol, 2013, 237 (2): 199-207.

[8] Preissler P, Behr J, Vogel R F. Detection of beer-spoilageLactobacillusbrevisstrains by reduction of resazurin[J]. J Inst Brew, 2010, 116(4): 399-405.

[9] Behr J, Vogel R F. Mechanisms of hop inhibition: hop ionophores[J]. J Agric Food Chem, 2009, 57 (14): 6074-6081.

[11] Hayashi N, Ito M, Horiike S, et al. Molecular cloning of a putative divalent-cation transporter gene as a new genetic marker for the identification ofLactobacillusbrevisstrains capable of growing in beer[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, 55(5): 596-603.

[12]Bergsveinson J, Pittet V, Ziola B. RT-qPCR analysis of putative beer-spoilage gene expression during growth ofLactobacillusbrevisBSO 464 andPediococcusclausseniiATCC BAA-344T in beer[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 96(2): 461-470.

[13]Haakensen M, Schubert A, Ziola B. Multiplex PCR for putativeLactobacillusandPediococcusbeer-spoilage genes and ability of gene presence to predict growth in beer[J]. J Am Soc Brew Chem, 2008, 66(2): 63-70.

[14]Sami M, Yamashita H, Hirono T, et al. Hop-resistantLactobacilhsbreviscontains a novel plasmid harboring a multidrug resistance-like gene[J]. J Ferment Bioengineer, 1997, 84(1): l-6.

[15]Suzuki K, Iijima K, Ozaki K, et al. Isolation of a hop sensitive variant ofLactobacilluslindneriand identification of genetic markers for beer spoilage ability of lactic acid bacteria[J]. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(9): 5089-5097.

[16]Iijima K, Suzuki K, Ozaki K, et al.horC confers beer spoilage ability on hop-sensitiveLactobacillusbrevisABBC45cc[J]. J Appl Microbiol, 2006, 100(6): 1282-1288.

[17]Suzuki K, Iijima K, Ozaki K. et al. Study on ATP production of lactic acid bacteria in beer and development of a rapid screening method for beer-spoilage bacteria[J]. J Inst Brew, 2005, 111(3): 328-335.

[18]Behr J, Vogel R F. Mechanisms of hop inhibition include the transmembrane redox reaction[J]. Appl Environ Microbiol, 2010, 76 (1): 142-149.

[19]Behr J, Geiβler A J, Preissler P, et al. Identification of ecotype-specific marker genes for categorization of beer-spoilingLactobacillusbrevis[J]. Food Microbiol, 2015, 51: 130-138.

[20]Li X Z, Nikaido H. Efflux-mediated drug resistance in bacteria: an update[J]. Drugs, 2009, 69(12): 1555-1623.

[21]Lubelski J, Konings W N, Driessen A J M. Distribution and physiology of ABC-type transporters contributing to multidrug resistance in bacteria[J]. Microbiol Mol Biol Rev, 2007, 71(3): 463-476.

[22]Velamakanni S, Lau C H F, Gutmann D A P, et al. A multidrug ABC transporter with a taste for salt[J]. PLoS One,2009, 4(7): e6137.

[23] Lubelski J, Mazurkiewicz P, van Merkerk R, et al.ydaG andydbA ofLactococcuslactisencode a heterodimeric ATP-binding cassette-type multidrug transporter[J]. J Biol Chem, 2004, 279(33): 34449-34455.

[24]Sakamoto K, Margolles A, van Veen H W, et al. Hop resistance in the beer spoilage bacteriumLactobacillusbrevisis mediated by the ATP-binding cassette multidrug transporter HorA[J]. J Bacteriol, 2001, 183(18): 5371-5375.

[25]Pittet V, Phister T G, Ziola B. Transcriptome sequence and plasmid copy number analysis of the brewery isolatePediococcusclausseniiATCC BAA-344T during growth in beer[J]. Plos One, 2013, 8(9): e73627.

[26]Ma D, Lu P, Yan C, et al. Structure and mechanism of a glutamate-GABA antiporter[J]. Nature, 2012, 483(7391): 632-636.

[27]Hazelwood L A, Walsh M C, Pronk J T, et al. Involvement of vacuolar sequestration and active transport in tolerance ofSaccharomycescerevisiaeto hop iso-acids[J]. Appl Environ Microbiol, 2010, 76(1): 318-328.

[28]Blanco C A, Caballero I, Rojas A, et al. Chelation of aqueous iron(III) by 2-acetyl-1,3-cyclohexanedione and beer ageing[J]. Food Chem, 2003, 81(4): 561-568.

Advance in hop resistance in beer spoilage microbes

LI Xian-zhen1，2， WANG Wei1,2, JIANG Bao-hang2, YANG Chao2, SUN Zhen2, DU Guo-cheng1

(1.SchoolofBiotechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122; 2.SchoolofBiologicalEngineering,DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034)

Hop bitter acid is an important constituent in beer flavor and a natural antibacterial agent for beer brewing. Hop-sensitive bacteria were inhibited by decreasing intracellular pH gradient caused by hop bitter acid. It has been confirmed that hop bitter acid could be bumped out cell via membrane-bound transporters in hop-resistance bacteria, leading to the decrease in proton influx, to keep pH gradient. The advance in hop resistance in beer spoilage bacteria was reviewed in this paper, in which the relationship of membrane components and hop resistance was discussed and the hop resistance mechanisms were proposed.

beer； hop； spoilage microorganism； contamination； bitter acid； hop-resistance

一直從事微生物學(xué)和生物催化方面研究，主持國(guó)家自然科學(xué)基金、公益性行業(yè)專項(xiàng)等研究工作，所帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)為遼寧省高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，發(fā)表論文80余篇，其中SCI收錄論文40篇，被其他SCI論文引用次數(shù)300余篇次，受國(guó)際著名出版社邀請(qǐng)撰寫學(xué)術(shù)專著3部。作為第一完成人，獲大連市科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)1項(xiàng)，遼寧省科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)1項(xiàng)，遼寧省自然科學(xué)二等獎(jiǎng)1項(xiàng)，中國(guó)輕工業(yè)聯(lián)合會(huì)科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)1項(xiàng)。在生物催化領(lǐng)域的研究成果被國(guó)內(nèi)外專家所關(guān)注。近年的主要學(xué)術(shù)成果和貢獻(xiàn)： 發(fā)現(xiàn)國(guó)際上未知的5種具有重要生物活性的微生物新菌；證明天然纖維素的降解過(guò)程是由小分子纖維起始酶啟動(dòng)的；所開發(fā)的高純異麥芽酮糖清潔生產(chǎn)技術(shù)已列入國(guó)家發(fā)改委第五批國(guó)家重點(diǎn)節(jié)能技術(shù)推薦目錄。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371742)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303095)；大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B11NC078)

李憲臻 男，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)槲⑸锱c生物催化。Tel: 0411-86323717，E-mail: xianzhen@dlpu.edu.cn

2015-05-03；

2015-05-16

Q93

A

1005-7021(2015)05-0001-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.05.001

李憲臻，大連工業(yè)大學(xué)二級(jí)教授、博士生導(dǎo)師，國(guó)務(wù)院特殊津貼專家，入選遼寧省百千萬(wàn)人才工程百人層次，大連市首批領(lǐng)軍人才。兼任中國(guó)發(fā)酵工業(yè)協(xié)會(huì)理事、中國(guó)食品科技學(xué)會(huì)酶制劑分會(huì)理事、中國(guó)釀酒協(xié)會(huì)理事、中國(guó)微生物學(xué)會(huì)基礎(chǔ)微生物學(xué)專業(yè)委員會(huì)委員、中國(guó)微生物學(xué)會(huì)工業(yè)微生物學(xué)專業(yè)委員會(huì)委員、遼寧省生物化學(xué)會(huì)常務(wù)理事、遼寧省微生物學(xué)會(huì)常務(wù)理事。