南充地區(qū)無償獻(xiàn)血者D變異體血清學(xué)鑒定

楊松，熊依軍，鄒韜，楊興明，黃文岳

（南充市紅十字中心血站，四川637000）

·調(diào)查報告·

南充地區(qū)無償獻(xiàn)血者D變異體血清學(xué)鑒定

楊松，熊依軍，鄒韜，楊興明，黃文岳

（南充市紅十字中心血站，四川637000）

目的研究四川省南充地區(qū)初檢為Rh陰性無償獻(xiàn)血者中D變異體血清學(xué)表型。方法對433份初檢為Rh陰性的血樣（來自于2010年4月至2014年9月四川省南充地區(qū)無親緣關(guān)系的154 392名漢族無償獻(xiàn)血者）用間接抗球蛋白試驗(yàn)鑒定D變異體，再用吸收放散試驗(yàn)從間接抗球蛋白試驗(yàn)陰性的血樣檢出DEL型，對所有血樣進(jìn)行不規(guī)則抗體篩選鑒定。結(jié)果433份送檢標(biāo)本中共確認(rèn)Rh陰性402例（92.8%，402/433），檢出23例D變異體（5.3%，23/433），其中DvccEe 8例（34.8%，8/23），DvCcee和DvCcEe各6例（分別為26.1%，6/23），DvCCee 3例（13.0%，3/23）；檢出DEL型3種表型105例，其中DelCcee 87例（82.9%，87/105），DelCCee 16例（15.2%，16/105），DelCcEe 2例（1.9%，2/105），均與C抗原相關(guān)；在D變異體和DEL型獻(xiàn)血者血漿標(biāo)本中未檢出不規(guī)則抗體。結(jié)論通過該次調(diào)查，掌握了四川省南充地區(qū)初檢為Rh陰性獻(xiàn)血者D變異體血清學(xué)表型，對于指導(dǎo)臨床輸血及預(yù)防新生兒溶血病等具有重要意義。

供血者；血清學(xué)；四川；D變異體；DEL型；不規(guī)則抗體

Rh血型系統(tǒng)是人類最具多態(tài)性的血型系統(tǒng)，其臨床意義僅次于ABO血型系統(tǒng)，可引起溶血性輸血反應(yīng)、新生兒溶血病及自身免疫性溶血性貧血等[1]。Rh血型系統(tǒng)中與臨床輸血關(guān)系密切者主要為D、C、c、E、e 5種抗原，其中D抗原的免疫原性最強(qiáng)，其次為E抗原。紅細(xì)胞表面有D抗原者稱為Rh陽性，缺乏D抗原者稱為Rh陰性。但有研究發(fā)現(xiàn)，D抗原存在多種變異體（D variant，Dv），包括弱D、部分D和DEL型。DEL型是一種特殊的D變異體，紅細(xì)胞上表達(dá)非常低的D抗原不能用常規(guī)血清學(xué)方法檢出，只能用吸收放散試驗(yàn)進(jìn)行篩選。近年來，相關(guān)文獻(xiàn)陸續(xù)報道了輸注D變異體紅細(xì)胞可使Rh陰性患者產(chǎn)生抗-D抗體，甚至D抗原數(shù)量極少的DEL型紅細(xì)胞也會引起免疫反應(yīng)[2-3]。作者采用血型血清學(xué)方法在四川省南充地區(qū)初檢Rh陰性無償獻(xiàn)血者中篩查D變異體，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源初檢Rh陰性標(biāo)本433例來自于2010年4月至2014年9月四川省南充地區(qū)無親緣關(guān)系的154 392名漢族無償獻(xiàn)血者，重復(fù)獻(xiàn)血者只計為1例。待確認(rèn)的標(biāo)本為同源血袋導(dǎo)管內(nèi)血液，全血枸櫞酸鹽抗凝。將血袋導(dǎo)管內(nèi)血液放入干凈試管，離心分離紅細(xì)胞和血漿，血漿用于不規(guī)則抗體篩選鑒定，而紅細(xì)胞經(jīng)生理鹽水洗滌3次后制成3%～5%紅細(xì)胞生理鹽水懸液，用于Rh陰性確認(rèn)試驗(yàn)、Rh血清學(xué)表型檢測和DEL型鑒定。

1.1.2 試劑與儀器抗-D（IgM）、抗-D（IgG）、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e、多特異性抗IgG+C3d、篩選細(xì)胞、譜細(xì)胞均為上海血液生物醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品，凝聚胺介質(zhì)試劑為珠海貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，抗-D（IgM、IgG）為英國Millipore公司產(chǎn)品，人源抗-D血清為江陰力博醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，乙醚為常熟市楊園化工有限公司生產(chǎn)，血型血清學(xué)專用離心機(jī)KA-2200為日本久保田公司生產(chǎn)，血庫標(biāo)準(zhǔn)化離心機(jī)2005-1為珠海Baso生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 Rh陰性確認(rèn)試驗(yàn)用抗-D試劑（IgM）采用試管鹽水法對送檢標(biāo)本進(jìn)行復(fù)查，明確在鹽水介質(zhì)下有無凝集和凝集強(qiáng)度。隨后采用3種不同廠家抗-D（IgG）試劑進(jìn)行間接抗人球蛋白試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)，具體方法：3支做好標(biāo)記的試管分別滴入不同廠家抗-D（IgG）試劑1滴，再滴入被檢紅細(xì)胞懸液1滴，混勻后置于37℃水浴箱孵育30 min，用生理鹽水洗滌3次，瀝干后再滴加1滴抗人球蛋白試劑，混勻后3 400 r/min離心15 s，最后輕輕搖動試管，觀察有無凝集及凝集強(qiáng)度。同時，做陰、陽性對照試驗(yàn)，確保試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

1.2.2 Rh血清學(xué)表型鑒定分別用抗-C、抗-c、抗-E、抗-e單克隆試劑采用試管鹽水法對送檢標(biāo)本進(jìn)行Rh系統(tǒng)重要抗原分型，同時做陰、陽性對照試驗(yàn)，確保試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

1.2.3 乙醚吸收放散試驗(yàn)鑒定DEL型先將間接抗人球蛋白試驗(yàn)陰性者紅細(xì)胞和等量人源抗-D（IgG）血清37℃水浴箱孵育60 min。取經(jīng)徹底洗滌的受檢壓積紅細(xì)胞1份，加1份生理鹽水、2份乙醚，用木塞蓋緊，顛倒搖勻10 min，然后以1 500×g離心5 min。離心后即分為3層，最上層為乙醚，中層為紅細(xì)胞基質(zhì)，下層為具有抗體的放散液。將放散液置37℃水浴30 min，除盡乙醚，然后加入O型Rh陽性紅細(xì)胞懸液1滴，再進(jìn)行間接抗人球蛋白試驗(yàn)，觀察有無凝集，有凝集者判定為DEL型。

1.2.4 不規(guī)則抗體篩選和鑒定使用篩選細(xì)胞，采用試管鹽水法和凝聚胺法對所有送檢標(biāo)本血漿進(jìn)行不規(guī)則抗體篩選，如檢出不規(guī)則抗體再用譜細(xì)胞通過抗人球蛋白試驗(yàn)進(jìn)行抗體鑒定。Rh陰性確認(rèn)試驗(yàn)、紅細(xì)胞血型抗原檢測、吸收放散法和不規(guī)則抗體篩選鑒定均嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第3版和相關(guān)試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 Rh陰性確認(rèn)情況433例初檢Rh陰性標(biāo)本中共確認(rèn)Rh陰性402例（92.8%，402/433），檢出23例D變異體（5.3%，23/433），RhD初檢錯誤8例（1.8%，8/433）。Rh陰性者在四川省南充地區(qū)無償獻(xiàn)血人群中的比例為0.3%（402/154 392）。

2.2 Rh陰性獻(xiàn)血者D變異體和DEL型Rh重要抗原分型Rh陰性獻(xiàn)血者共檢出5種表型，其中dccee 201例（50.0%，201/402），dCcee 150例（37.3%，150/402）。通過間接抗人球蛋白試驗(yàn)，檢出D變異體4種表型，其中DvccEe 8例（34.8%，8/23），DvCcee和DvCcEe各6例（分別為26.1%，6/23），DvCCee 3例（13.0%，3/23）。通過吸收放散試驗(yàn)，檢出DEL型3種表型，其中DelCcee87例（82.9%，87/105），DelCCee 16例（15.2%，16/105），DelC-cEe 2例（1.9%，2/105），見表1。

表1 Rh陰性者D變異體和DEL型獻(xiàn)血者Rh重要抗原表型分布[n（%）]

2.3 抗體篩選和鑒定在D變異體和DEL型獻(xiàn)血者血漿中均未檢出不規(guī)則抗體。

3 討論

Rh血型有著復(fù)雜而豐富的遺傳多態(tài)性，不僅RhD陰性分子遺傳機(jī)制呈現(xiàn)多態(tài)性，而且D抗原也存在多種變異體，包括部分D、弱D和DEL型等[4]。弱D型具有正常D抗原所有表位，只是表達(dá)減弱，需要借助間接抗人球蛋白試驗(yàn)才能檢出D抗原，且接受Rh陽性紅細(xì)胞一般不產(chǎn)生抗-D抗體，但有研究發(fā)現(xiàn)，中國人常見的弱D15型能引起同種免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗-D抗體。部分D缺失，一部分D抗原表位，如經(jīng)Rh陽性紅細(xì)胞免疫后可針對缺失表位產(chǎn)生抗-D抗體[5-6]。正常Rh陽性個體單個紅細(xì)胞膜表面D抗原分子數(shù)大于10 000個，一般D變異體分子數(shù)為70～4 000個，而DEL型紅細(xì)胞表面的D抗原分子數(shù)小于30個，如果Rh陰性患者接受DEL型紅細(xì)胞輸注，在極罕見的情況下亦會免疫產(chǎn)生抗-D抗體[7]。雖有DEL型患者接受輸血可產(chǎn)生抗-D抗體的個案報道[8]，但大量研究表明，DEL型患者輸注Rh陽性血液產(chǎn)生同種免疫反應(yīng)的可能性很小[9-10]；DEL型孕婦妊娠Rh陽性胎兒發(fā)生抗-D抗體同種免疫反應(yīng)的可能很小，建議可免去定期的產(chǎn)前抗-D抗體檢測和預(yù)防性Rh免疫球蛋白的使用。

D變異體形成的分子遺傳機(jī)制決定了D抗原表達(dá)質(zhì)和量的差異。弱D型個體攜帶正常RhD基因，但RhD mRNA的表達(dá)卻大大降低，提示在轉(zhuǎn)錄水平或前體mRNA加工過程中有一定的缺陷。有研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致其抗原量減少的原因在于單個位點(diǎn)基因點(diǎn)突變發(fā)生在胞內(nèi)區(qū)或跨膜區(qū)，導(dǎo)致D抗原數(shù)量減少，但一般對膜外抗原蛋白的空間構(gòu)象不產(chǎn)生影響。部分D型形成的主要機(jī)制有2種：（1）RhD與RhCE基因重組，形成D-CE-D雜交基因，編碼產(chǎn)物只獲得D表位中的一部分，大多數(shù)部分D型由這種機(jī)制產(chǎn)生；（2）堿基突變，即在RhD基因中發(fā)生堿基突變。而DEL型形成有多種機(jī)制，包括錯義突變、剪切位點(diǎn)突變、RhD基因缺失等。中國DEL型人群主要攜帶RhD1227A等位基因，該基因突變影響mRNA的拼接效率，極少mRNA能夠加工成熟，致使RhD基因表達(dá)效率降低[7]。

本次調(diào)查從433份送檢標(biāo)本中共確認(rèn)Rh陰性402例（92.8%，402/433），Rh陰性者在本地?zé)o償獻(xiàn)血人群中的比例為0.3%（402/154 392）；同時發(fā)現(xiàn)了23例D變異體（5.3%，23/433）和8例初檢錯誤（1.9%，8/433）。在23例D變異體獻(xiàn)血者中，與抗-D試劑（IgM）在鹽水介質(zhì)中完全無反應(yīng)8例，在鹽水介質(zhì)中有凝集15例，但強(qiáng)度明顯低于正常RhD陽性紅細(xì)胞。

本次調(diào)查結(jié)果表明，Rh陰性獻(xiàn)血者分型主要以dccee和dCcee為主。D變異體獻(xiàn)血者分型以DvccEe最多，DvCcee和DvCcEe次之，DvCCee最少，未檢出Dvccee。通過吸收放散試驗(yàn)，在402例Rh陰性獻(xiàn)血者中檢出DEL型105例（26.1%），與陸松松等[11]報道中國人群中DEL型占Rh陰性的20.0%～30.0%一致。本次共檢出DelCcee、DelCCee和DelCcEe 3種DEL表型，均至少攜帶1個C抗原，符合謝俊杰等[7]提出的C抗原可作為初篩DEL型的1個重要標(biāo)志的說法。但對于未攜帶C抗原的個體不能完全排除DEL型，如李宏等[12]研究發(fā)現(xiàn)了1例Delccee表型個體不攜帶C抗原。

抗-D抗體主要由Rh陰性個體接受輸血或妊娠產(chǎn)生，可致溶血性輸血反應(yīng)和新生兒溶血病，在臨床上有非常重要的意義。本次調(diào)查在23例D變異體和DEL型獻(xiàn)血者血漿中均未檢出不規(guī)則抗體，與周國平等[13]報道一致，他們在66例上海市D變異體獻(xiàn)血者血漿中也未檢出不規(guī)則抗體。本次調(diào)查雖未檢出不規(guī)則抗體，但D變異體獻(xiàn)血者血漿可能含有抗-D抗體，如果將含有抗-D抗體的血漿發(fā)往臨床給Rh陽性患者輸注，將導(dǎo)致嚴(yán)重輸血反應(yīng)。所以，作者建議，對于D變異體獻(xiàn)血者必須進(jìn)行不規(guī)則抗體的篩查。

針對D抗原表達(dá)的差異，不同類型D變異體個體接受輸血的安全策略可能有所不同。大多數(shù)弱D型無D抗原表位的改變，因此，也沒有產(chǎn)生同種抗-D抗體的危險，輸注D抗原陽性的紅細(xì)胞是安全的，弱D型母親懷有D抗原陽性的胎兒時不需應(yīng)用抗-D抗體免疫球蛋白預(yù)防。部分D型個體輸入Rh陽性血或曾經(jīng)生育過擁有正常D抗原的嬰兒時可能產(chǎn)生抗-D抗體，而其可能產(chǎn)生導(dǎo)致嚴(yán)重溶血性輸血反應(yīng)或新生兒溶血病，所以，部分D型個體輸血必須輸注Rh陰性血液以避免產(chǎn)生抗-D抗體。對于DEL型個體輸注Rh陽性血液是否發(fā)生同種免疫反應(yīng)尚無定論，邵超鵬等[10]研究表明，DEL型不被D抗原刺激產(chǎn)生同種免疫反應(yīng)，為開展DEL型個體臨床輸血觀察提供了依據(jù)，如果大樣本量研究和臨床輸血實(shí)踐能夠證實(shí)DEL型個體可以接受Rh陽性獻(xiàn)血者血液，將有力保障Rh陰性血液的供應(yīng)，減少寶貴的Rh陰性血液的浪費(fèi)，避免因等待Rh陰性血液而延誤治療時機(jī)。

目前，臨床常規(guī)的做法是將D變異體獻(xiàn)血者所獻(xiàn)血液視為Rh陽性血液對待，而D變異體受血者須輸注Rh陰性血液。

總之，D變異體的準(zhǔn)確鑒定和分類對指導(dǎo)臨床輸血及預(yù)防新生兒溶血病等具有重要意義，作者接下來將對本地區(qū)無償獻(xiàn)血者群體中D變異體形成的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究。

[1]徐研，洪纓，鄭小芳.成都地區(qū)獻(xiàn)血人群RhD陰性個體RHD基因分子機(jī)制研究[J].中國輸血雜志，2014，27（2）：146-148.

[2]Wanger T，Kormoczi GF，Buchta C，et al.Anti-D immunization by DEL red blood cells[J].Transfusion，2005，45（4）：520-526.

[3]Yasuda H，Ohto H，Sakuma S，et al.Secondary anti-D immunization by DEL red blood cells[J].Transfusion，2005，45（10）：1581-1584.

[4]鄧詩楨，謝敬文，嚴(yán)康峰，等.番禺地區(qū)RhD陰性獻(xiàn)血者部分D頻率調(diào)查[J].臨床輸血與檢驗(yàn)，2014，16（1）：35-36.

[5]Avent ND，Reid ME.The Rh blood group system：a review[J].Blood，2000，95（2）：375-387.

[6]息培紅.Rh血型弱D產(chǎn)生抗-D抗體1例[J].臨床血液學(xué)雜志：輸血與檢驗(yàn)，2012，25（2）：260.

[7]謝俊杰，邵超鵬.Rh血型D放散型（Del）[J].中國輸血雜志，2011，24（1）：3-7.

[8]涂同濤，魏晴，周金安.52例RhD陰性患者D變異型和抗-D抗體檢測分析[J].華中科技大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2008，37（1）：139.

[9]吳凡，莊乃保，邵超鵬，等.45例有生育史Rh陰性婦女抗-D抗體和RHD基因分析[J].廣東醫(yī)學(xué)，2010，31（18）：2359-2362.

[10]邵超鵬，徐群，孫國棟，等.Rh血型抗-D陽性個體中未見DEL型[J].免疫學(xué)雜志，2010，26（10）：876-878.

[11]陸松松，陳靜嫻.Rh（D）變異體的研究進(jìn)展[J].臨床輸血與檢驗(yàn)，2010，2（4）：374-378.

[12]李宏，宋寧，鄧永福，等.四川地區(qū)漢族人群Rh（D）變異體分子機(jī)制研究[J].中國輸血雜志，2010，23（5）：368-372.

[13]周國平，謝云崢，向東，等.上海市Rh陰性獻(xiàn)血者D變異型與不規(guī)則抗體調(diào)查[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2009，27（3）：233-234.

讀者·作者·編者

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本刊編輯部

Serological identification of D variants in volunteer blood donors in Nanchong region

Yang Song，Xiong Yijun，Zou Tao，Yang Xingming，Huang Wenyue
（Nanchong Red Cross Blood Center，Sichuan 637000，China）

ObjectiveTo study the serological phenotype of D variants in volunteer blood donors initially-diagnosed Rh negative in Nanchong region of Sichuan province.MethodsA total of 433 blood samples from 154 392 unrelated volunteer blood donors with Han nationality in Nanchong district of Sichuan province initially diagnosed as Rh negative were identified by indirect antiglobulin test for D variants，and the negative results were subsequently detected by absorption-elution testing for DEL type from indirect antiglobulin testing.In addition，all of the blood samples were screened and identified for irregular antibodies.ResultsAmong 433 samples，402 cases（92.8%，402/433）were confirmed Rh negative and 23 cases（5.3%，23/433）were detected D variants，including DvccEe for 8 cases（34.8%，8/23），DvCcee for 6 cases（26.1%，6/23）and DvCCee for 3 cases（13.0%，3/23）；A total of 3 DEL phenotypes for 105 cases were found，including DelCcee for 87 cases（82.9%，87/105），DelCCee for 16 cases（15.2%，16/105），and DelCcEe for 2 cases（1.9%，2/105），all of which were associated with C antigen；Furthermore，irregular antibodies failed to be detected in plasma samples of donors with D variants and DEL type.ConclusionIn the survey，serological phenotypes of D variant in volunteer blood donors initially-diagnosed Rh negative in Nanchong district of Sichuan province are learned，which has an important significance to guide the clinical blood transfusion and prevent hemolytic diseases of the newborns.

Blood donors；Serology；Sichuan；D variants；DEL type；Irregular antibody

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.04.013

：A

：1009-5519（2015）04-0517-03

2014-11-03）

楊松（1978-），男，四川瀘州人，碩士研究生，主管檢驗(yàn)師，主要從事血型血清學(xué)的研究；E-mail：46159390@qq.com。