ATO聯(lián)合TRAIL對肺癌裸鼠移植瘤抑制作用及機制研究

趙雪強，蔣碧佳，銀建華，唐碧蕓，黃秀蘭，李文翠

（桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院臨桂分院/臨桂縣人民醫(yī)院，廣西桂林541199）

ATO聯(lián)合TRAIL對肺癌裸鼠移植瘤抑制作用及機制研究

趙雪強，蔣碧佳，銀建華，唐碧蕓，黃秀蘭，李文翠

（桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院臨桂分院/臨桂縣人民醫(yī)院，廣西桂林541199）

目的探討腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）聯(lián)合三氧化二砷（ATO）對裸鼠肺癌移植瘤的抑制作用及其可能機制。方法將裸鼠肺癌移植瘤模型隨機分為陰性對照組、TRAIL組、ATO低劑量組（ATO1組）、ATO高劑量組（ATO2組）、TRAIL聯(lián)合ATO組，稱取瘤質量并計算抑瘤率，采用免疫組化法檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）的表達。結果與陰性對照組比較，ATO1組、ATO2組對裸鼠肺癌移植瘤均具有抑制作用，TRAIL聯(lián)合ATO組具有協(xié)同增效作用，并且上調Caspase-3的表達，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論ATO能增強TRAIL對裸鼠肺癌移植瘤的抑制作用，其機制可能與促進Caspase-3表達有關。

肺腫瘤；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；三氧化二砷；腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（tumor necrosis factorrelated apoptosis inducing ligand，TRAIL）是近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族新成員，具有特異性殺傷腫瘤細胞而對機體正常組織不具有明顯的不良反應[1]。但最近研究表明，大部分肺癌細胞對TRAIL耐藥，TRAIL的耐藥機制目前仍不十分清楚[2]。在體外發(fā)現(xiàn)三氧化二砷（arsenic trioxdio，ATO）不但可誘導肺癌細胞凋亡，還可增強肺癌細胞對TRAIL的敏感性[3]。但鑒于體外肺癌細胞培養(yǎng)環(huán)境與體內肺癌微環(huán)境的差異，本研究通過建立肺癌裸鼠移植瘤模型，采用TRAIL、ATO單藥及聯(lián)合用藥對肺癌移植瘤的生物作用及可能機制進行研究，旨在為肺癌的臨床治療提供新的方法，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料人肺腺癌A549細胞為實驗室自存。BALB/ c-nu裸鼠25只，雄性，6～8周，體質量16～24 g，購自桂林醫(yī)學院科學實驗中心動物室。杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）購自GIBICO公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，ATO購自哈爾濱伊達藥業(yè)有限公司，TRAIL購自以色列PROSPEC公司，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）一抗、二抗購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)將A549細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，在恒溫37℃、5%二氧化碳飽和濕度下培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化，2～3 d傳代1次。對數(shù)生長期的細胞用0.25%胰蛋白酶消化后用培養(yǎng)基終止消化，然后，用磷酸鹽緩沖液洗滌、離心、去上清液，收集細胞，調整細胞濃度為1×108mL-1的細胞懸液備用（臺盼藍染色確定所用細胞活力在95%以上）。

1.2.2 裸鼠移植瘤模型建立及實驗分組在恒溫（26～28℃）、恒濕（40%～60%）的無特定病源的（specificpathogen free，SPF）層流環(huán)境中飼養(yǎng)實驗裸鼠。裸鼠食用的飼料及飲用水均經(jīng)高壓、高溫滅菌。取上述細胞懸液接種于裸鼠右前腋窩部皮下，每只注射0.2 mL，接種后每天觀察皮下移植瘤生長情況及接種點有無紅腫、出血，接種后5 d開始成瘤，21 d左右明顯成瘤，移植瘤模型建立。隨機選擇其中荷瘤成功的裸鼠20只，隨機分為五組，每組4只。（1）陰性對照組：僅給予0.9%氯化鈉溶液腹腔注射，每次0.2 mL，每2天注射1次，共注射8次。（2）TRAIL組：以50 μg/kg劑量腹腔注射給藥，每次0.2 mL，每2天注射1次，共注射8次。（3）ATO低劑量組（ATO1組）：以1.5 mg/kg劑量腹腔注射給藥，每次0.2 mL，每2天注射1次，共注射8次。（4）ATO高劑量組（ATO2組）：以3.0 mg/kg劑量腹腔注射給藥，每次0.2 mL，每2天注射1次，共注射8次。（5）ATO聯(lián)合TRAIL組：ATO以1.5 mg/kg劑量、TRAIL以50 μg/kg劑量腹腔注射給藥，各取0.2mL，每2天注射1次，共注射8次。

1.2.3 測量藥物作用后移植瘤質量及抑瘤率首次用藥后第15天斷頸處死全部裸鼠，手術完整取出腫瘤組織，剔除其他組織，稱移植瘤質量。按公式計算腫瘤抑制率（%）=（1-干預組平均瘤質量/陰性對照組平均瘤質量）×100%。

1.2.4 病理組織學觀察及免疫組化檢測Caspase-3的表達用4%多聚甲醛固定取出的移植瘤標本，石蠟包埋連續(xù)切片，切片用蘇木精-伊紅染色（hematoxylin eosin，HE），顯微鏡下觀察腫瘤組織形態(tài)學改變并拍照。將石蠟切片進行免疫組化檢測，觀察腫瘤細胞Caspase-3蛋白的表達情況。嚴格按照試劑盒提供的檢測步驟進行操作，結果判定：以細胞質染為棕色至棕褐色為陽性細胞標記。每組隨機選3個切片標本，顯微鏡下觀察每張切片，隨機選取5個高倍鏡視野，分析陽性細胞光密度（optical density，OD）值，并計算各組Caspase-3蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析；抑瘤率以百分比表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 裸鼠生長狀況腫瘤細胞接種后裸鼠皮下移植瘤生長良好，21 d左右移植瘤直徑平均達5 mm，成瘤率為100.00%。藥物干預前裸鼠一般狀態(tài)好；實驗結束時20只裸鼠無一例死亡。經(jīng)過每天密切觀察發(fā)現(xiàn)，陰性對照組和TRAIL組裸鼠活動、進食明顯減少，對外界反應遲緩；ATO1組、ATO2組、TRAIL聯(lián)合ATO組祼鼠無明顯驚恐、不安及拒食，均未發(fā)現(xiàn)排便異常、接種部位皮膚壞死等。

2.2 裸鼠體質量變化各組藥物干預前裸鼠體質量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。藥物干預后ATO1組、ATO2組、TRAIL聯(lián)合ATO組裸鼠體質量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。陰性對照組及TRAIL組較ATO1組、ATO2組、TRAIL聯(lián)合ATO組裸鼠體質量明顯減輕，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

2.3 裸鼠移植瘤質量及抑瘤率觀察藥物干預后ATO1組、ATO2組、TRAIL聯(lián)合ATO組裸鼠皮下移植瘤質量較陰性對照組、TRAIL組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），TRAIL聯(lián)合ATO組更為明顯，抑瘤率為80.60%，見表2。

表1 各組裸鼠藥物干預前后體質量比較（±s，g）

表1 各組裸鼠藥物干預前后體質量比較（±s，g）

注：與陰性對照組、TRAIL組干預后比較，aP＜0.05。

組別陰性對照組TRAIL組ATO1組ATO2組TRAIL聯(lián)合ATO組n干預前干預后44444 17.72±1.15 19.39±2.13 18.92±1.77 18.47±1.52 18.98±2.42 16.00±1.66 17.61±1.44 20.02±2.17a19.18±2.21a20.09±2.56a

表2 各組裸鼠腫瘤質量及抑瘤率比較

2.4 移植瘤HE染色光鏡觀察TRAIL組移植瘤內腫瘤組織形態(tài)學無顯著變化，隨著ATO藥物劑量的增加，肺癌組織減少，肺癌細胞數(shù)量也隨之減少，并失去肺腺癌細胞的腺腔樣結構的典型特征，且腫瘤組織出血、壞死增多，形狀不規(guī)則，細胞核固縮變小，甚至核溶解，細胞結構消失，呈現(xiàn)空泡化改變；而ATO聯(lián)合TRAIL組較ATO1組、ATO2組更為明顯，見圖1。

圖1 腫瘤組織學檢查（HE染色，400×）

2.5 移植瘤組織內Caspase-3蛋白表達情況與陰性對照組比較，TRAIL組Caspase-3表達無明顯改變，隨著ATO藥物劑量的增加，Caspase-3表達陽性率增加，ATO聯(lián)合TRAIL組明顯上調Caspase-3的表達，與其他組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 Caspase-3蛋白的表達（免疫組化，400×）

2.6 Caspase-3蛋白陽性細胞OD值陰性對照組、TRAIL組、ATO1組、ATO2組，TRAIL聯(lián)合ATO組Caspase-3蛋白陽性細胞OD值分別為0.204±0.014、0.225± 0.008、0.415±0.014、0.666±0.014和0.705±0.013。

3 討論

TRAIL是近年來發(fā)現(xiàn)的TNF超家族成員，通過與其細胞表面受體[死亡受體4（death receptor 4，DR4）、死亡受體5（death receptor 5，DR5）]特異性結合從而誘導腫瘤細胞凋亡并且對機體正常組織無明顯不良反應[1]。但最近研究發(fā)現(xiàn)，大部分肺癌細胞對TRAIL耐藥，限制了TRAIL的臨床應用[2，4-5]。TRAIL與ATO聯(lián)用在體外克服肺癌耐藥方面有效[3]。

有研究已發(fā)現(xiàn)，ATO具有抗腫瘤作用，但其作用是多途徑、多靶點的復雜過程[6]。很多學者認為，ATO的主要抗腫瘤機制與誘導腫瘤細胞凋亡有關[7-8]。ATO是通過降解融合蛋白、改變線粒體跨膜電位、通過轉錄因子影響細胞周期的轉換、影響凋亡相關基因（如Caspase因子）等方法，從而誘導腫瘤細胞凋亡[9-10]。近年來，有文獻報道，增加ATO劑量可逆轉肺癌細胞耐藥性[11]，但隨著ATO劑量的增加，對正常細胞的不良反應也增大，從而影響了ATO在治療肺癌方面的臨床應用。目前，以ATO為基礎的化療組合成為研究熱點。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，ATO具有抗肺癌移植瘤的作用，并使肺癌細胞發(fā)生凋亡，甚至使肺癌組織發(fā)生壞死，增加ATO劑量可上調細胞質中Caspase-3的表達。TRAIL組瘤質量及抑瘤率與陰性對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明肺癌細胞對TRAIL耐藥。TRAIL聯(lián)合ATO組明顯抑制裸鼠肺癌移植瘤生長，通過HE染色鏡下觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，ATO可增強TRAIL誘導肺癌細胞凋亡。

細胞凋亡主要是通過細胞內的線粒體通路和細胞外的DR通路啟動細胞凋亡。線粒體通路主要是通過細胞內的促凋亡因子和抗凋亡因子相互作用調控誘導細胞凋亡，促凋亡因子（如B細胞淋巴瘤-白血病2蛋白家族成員）可使線粒體膜通透性發(fā)生改變，導致線粒體釋放細胞色素C（cytocrhome C，Cyt-C）[12]，Cyt-C與凋亡蛋白酶活化因子（apoptotic proteaseactivating factor，Apaf-1）結合形成復合體并激活Caspase-9，解除凋亡抑制因子對Caspase-3的阻礙作用，激活Caspase-3發(fā)生生物效應，最終引起腫瘤細胞凋亡[13]；DR通路主要是當DR與死亡配體結合后傳遞凋亡信號，引起胞內Caspase-8的前體Procaspase在其末端的局部募集和串聯(lián)結合，從而形成凋亡酶體（apoptosome），凋亡酶體形成后，其分子中的Procaspase通過自身水解而成為有活性的Caspase-8，活化的Caspase-8可引發(fā)下游的Caspase蛋白酶裂解多種蛋白質，如Caspase-3，然后激活下游效應酶，最終誘導大量腫瘤細胞凋亡[14]。而作為這2條凋亡通路上的下游共同基因——Caspase-3在細胞凋亡過程中具有至關重要的作用。所以，增加Caspase-3的表達就意味著可啟動細胞內凋亡程序。本研究發(fā)現(xiàn)，增加ATO藥物劑量Caspase-3的表達也相應增加，TRAIL聯(lián)合ATO組明顯上調Caspase-3的表達。因此，ATO可增強TRAIL對裸鼠肺癌移植瘤的抗腫瘤作用，其機制可能是通過促進Caspase-3的表達來實現(xiàn)的。

綜上所述，TRAIL聯(lián)合ATO可通過上調Caspase-3表達，提高肺癌細胞對TRAIL誘導凋亡的敏感性，從而具有促進肺癌細胞凋亡和抑制腫瘤生長的作用，為TRAIL和ATO二者配伍應用于臨床提供了進一步的理論基礎。

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Study on inhibitory action and mechanism of arsenic trioxide combined with TRAIL on transplanted human lung cancer in nude mice

Zhao Xueqiang，Jiang Bijia，Yin Jianhua，Tang Biyun，Huang Xiulan，Li Wencui
（The Lingui Branch of Affiliated Hospital of Guilin Medical College/Lingui County People′s Hospital，Guilin，Guangxi 541199，China）

ObjectiveTo approach the inhibitory action and proposed mechanism of TRAIL combined with ATO on transplanted human lung cancer in nude mice.MethodsThe nude mice bearing A549 lung cancer samples were randomly divided into the negative control group，group TRAIL，group ATO1，group ATO2 and TRAIL+ATO group.Tumor tissues were weighted and the inhibitory rate was observed.Immunohistochemistry was applied to detect the expression of Caspase-3 after treatments.ResultsCompared with the negative control group，it had a strong the obviously action inhibition on transplanted human lung cancer of nude mice in group ATO1 and group ATO2 while a synergistic effect in group TRAIL+ATO，and increased the expression of Caspase-3，whose difference had statistical significance（P＜0.05）.ConclusionATO may inhibit the growth of transplanted human lung cancer in nude mice through strengthening TRAIL，whose possible mechanism is potentially related to the expression of Caspase-3.

Lung Neoplasms；Caspase 3；Arsenic trioxide；Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.04.002

：A

：1009-5519（2015）04-0485-03

2014-08-14

2014-09-25）

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳立項課題（Z2013490）。

趙雪強（1981-），男，廣西桂林人，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事肺癌基礎與臨床研究；E-mail：myzhaoxueqiang@126.com。