華中五味子中五味子酚的制備方法

華中五味子中五味子酚的制備方法

沈曉華1，2，謝旭東3，王青遙3，穆淑珍2，鄧璐璐2*

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州貴陽 550002；2.貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550002；3.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽 550025)

摘要[目的]從華中五味子中獲得高純度五味子酚的制備方法。[方法]采用95%乙醇熱回流對(duì)華中五味子中的化學(xué)成分進(jìn)行提取，通過高效液相色譜檢測(cè)不同產(chǎn)地華中五味子中五味子酚的含量，選擇高含量產(chǎn)地的樣品提取物通過正、反相硅膠柱層析法進(jìn)行純化，從中制備出高純度的五味子酚。[結(jié)果]四川產(chǎn)華中五味子中的五味子酚相對(duì)含量較高，從中可制備較多量的高純度五味子酚。[結(jié)論]用正、反相硅膠柱層析法能夠簡(jiǎn)單快速地從華中五味子中獲得高純度五味子酚，豐富了獲得五味子酚的資源和制備方法，為五味子酚化學(xué)和生物學(xué)的可持續(xù)研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞華中五味子；五味子酚；提取分離；制備方法

中圖分類號(hào)S567

基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)

作者簡(jiǎn)介沈曉華(1990-)，女，福建漳州人，碩士研究生，研究方向：中藥化學(xué)。*

收稿日期2015-06-03

Preparation Method of Schisanhenol fromSchisandrasphenanthera

SHEN Xiao-hua1, 2, XIE Xu-dong3, WANG Qing-yao3, DENG Lu-lu2*et al (1. College of Pharmacy, Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang, Guizhou 550022; 2. Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province, Chinese Academy of Sciences, Guiyang, Guizhou 550002; 3. School of Pharmaceutical Science, Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025)

Abstract[Objective] To prepare the high purity schisanhenol from Schisandra sphenanthera. [Method] After the chemical constituents of Schisandra sphenanthera with 95% ethanol were extracted, the schisanhenol content in them was detected by HPLC. And schisanhenol with the high purity was prepared from the sample with the high content by positive and reverse phase silica gel column chromatography. [Result] The relative content of schisanhenol in Schisandra sphenanthera collected from Sichuan Province was the most highest. [Conclusion] By positive and reverse phase silica gel column chromatography, high purity schisanhenol could be quickly and easily obtained from Schisandra sphenanthera, which will enrich the resource and preparation method of schisanhenol, and provide the material base for sustainable research on chemistry and biology of schisanhenol.

Key wordsSchisandrasphenanthera; Schisanhenol; Extraction and separation; Preparation method

五味子酚是紅花五味子(SchisandrarubrifloraRehd. et Wils.)中含量較高的一種活性聯(lián)苯環(huán)辛二烯類木脂素，具有顯著的抗氧化活性并可保護(hù)氧自由基引起的心臟、肝臟線粒體損傷和神經(jīng)細(xì)胞損傷[1-4]。近幾年來的藥理學(xué)研究表明五味子酚或其衍生物是十分具有開發(fā)價(jià)值的抗氧化劑[5-7]。但因?yàn)榧t花五味子資源分布有限，果實(shí)采集困難，很難獲得大量的五味子酚進(jìn)行進(jìn)一步的科學(xué)研究。因此，擴(kuò)大獲得五味子酚的資源，研究其中獲得五味子酚的制備方法對(duì)創(chuàng)新藥物的可持續(xù)性研發(fā)具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

徐丹等首次在華中五味子中分離得到過五味子酚[8]，華中五味子為五味子科五味子屬植物華中五味子SchisandrasphenantheraRehd.et Wils. 的干燥成熟果實(shí)[9]，商品名為南五味子。南五味子味酸、甘，溫，歸肺、心、腎經(jīng)，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心之功效，用于久嗽虛喘、夢(mèng)遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗、盜汗、津傷口渴、短氣脈虛、內(nèi)熱消渴、心悸失眠等病癥，其主要有效成分為聯(lián)苯環(huán)辛二烯類木脂素，有降低血清轉(zhuǎn)氨酶作用。目前華中五味子的果實(shí)已在臨床上被應(yīng)用于治療急慢性肝炎[10-12]。華中五味子在我國(guó)主要分布于山西、陜西、甘肅、山東、江蘇、安徽、浙江、江西、福建、河南、湖北、湖南、四川、貴州、云南東北部，資源很豐富。筆者在此利用HPLC方法對(duì)不同產(chǎn)地的華中五味子中五味子酚進(jìn)行含量測(cè)定，選出含量最高產(chǎn)地的華中五味子，對(duì)其中的五味子酚進(jìn)行提取和制備，豐富了獲得五味子酚的資源和制備方法，為五味子酚化學(xué)和生物學(xué)的可持續(xù)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 儀器。美國(guó)Agilent 1100型高校液相色譜儀，OSB-21000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海愛朗儀器有限公司)，NOVA 400 MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀(以TMS為內(nèi)標(biāo)，美國(guó)瓦里安公司)，GC-MS 5973型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)惠普公司)，ME203E型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，ZF-2型三用紫外儀(上海市安亭電子儀器廠)，98-Ⅰ-B型電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)，DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.1.2 試劑。五味子酚對(duì)照品為實(shí)驗(yàn)室自制(純度>99.0%)。反相C-18(Rp-18，粒度 40～63 μm)薄層色譜板及反相C-18(Rp-18)柱色譜用硅膠(德國(guó)Merck公司)，柱層析硅膠G(青島海洋化工廠分廠)，薄層層析硅膠板GF254(青島普科分離材料有限公司)；石油醚、乙酸乙酯、乙醇均為工業(yè)級(jí)，使用前重蒸；無水乙醇(分析純，重慶川東化工集團(tuán)有限公司)；色譜用乙腈(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；水為市售娃哈哈純凈水。

1.1.3 研究對(duì)象。華中五味子藥材購(gòu)于貴陽三橋藥材市場(chǎng)，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院董立莎教授鑒定為華中五味子(SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.)的干燥成熟果實(shí)。

1.2方法

1.2.1 不同產(chǎn)地藥材中五味子酚的提取。分別稱取不同華中五味子干燥果實(shí)500 g，粉粹成粗粉(過40目篩)，95%乙醇(1 L/次)加熱回流提取3次，提取時(shí)間分別為4、3和2 h，減壓過濾，合并提取液，真空減壓濃縮后得浸膏。

1.2.2 對(duì)照品和供試品溶液的制備。精密稱取五味子酚對(duì)照品10 mg，置10 ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得五味子酚對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密稱取各產(chǎn)地五味子酚粗提取物100 mg，置10 ml容量瓶中，加乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。微孔濾膜(0.45 μm)過濾，即得供試品溶液。

1.2.3 色譜條件。Kromasil C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，以乙腈(A)-水(B)(80∶20)為流動(dòng)相，流速1.0 ml/min， 柱溫30 ℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量1 μl。

1.2.4 樣品含量測(cè)定。取供試品溶液，按照“1.2.3”項(xiàng)的色譜條件，測(cè)定不同產(chǎn)地五味子藥材中五味子酚的含量。

1.2.5 五味子酚提取物的制備。選取五味子酚含量最高的五味子藥材為原料，按照“1.2.1”方法制備五味子酚提取物浸膏。

1.2.6 五味子酚的制備。

1.2.6.1 正相硅膠柱層析法分離。柱層析用玻璃柱(內(nèi)徑×長(zhǎng)度，600 mm×1 300 mm)洗凈烘干備用。采用濕法裝柱、干法上樣的柱層析技術(shù)。柱層析用硅膠(200～300目，3 kg)分批加入裝有石油醚的燒杯中，攪拌，除去硅膠表面附著的氣泡。玻璃柱內(nèi)先加入少量棉花墊在底部，隨后注入工業(yè)重蒸石油醚(1 L)，再將處理過的硅膠勻漿緩緩連續(xù)地加入色譜柱，裝填時(shí)微開色譜柱底部活塞，輕輕敲打柱身，使之裝填均勻，整個(gè)過程始終保持色譜柱內(nèi)的液面高于硅膠面。裝柱后平衡色譜柱4～5 h，最后保持色譜柱中液面高于硅膠面約2～3 cm。同時(shí)將上述五味子酚提取浸膏用少量無水乙醇溶解，加2倍樣品量硅膠(40～80 目)拌樣，待吸附樣品的硅膠完全干燥后，加至平衡好的玻璃色譜柱上端，始終保持液面高于硅膠面。用洗脫溶劑石油醚-乙酸乙酯(3∶1)混合系統(tǒng)洗脫，至4倍柱體積(約17 L)時(shí)，通過薄層層析(TLC)檢測(cè)到五味子酚開始被洗脫下來；繼續(xù)洗脫至7.5 倍柱體積后，TLC法檢測(cè)不到五味子酚，濃縮洗脫液，得五味子酚粗品。

1.2.6.2 反相硅膠柱層析法純化。用反相硅膠柱層析法純化上述五味子酚粗品，將Rp-18柱色譜用硅膠用甲醇浸泡過夜后，除去氣泡，裝入玻璃色譜柱(內(nèi)徑×長(zhǎng)度，46 mm × 457 mm)。裝柱平衡后，置換成50%甲醇-水溶劑體系。同時(shí)將五味子酚粗品溶于甲醇中，用干燥Rp-18柱色譜用硅膠進(jìn)行拌樣。待色譜柱完全平衡后，當(dāng)反相柱的液面與Rp-18柱色譜用硅膠面相平時(shí)，將吸附五味子酚粗品的Rp-18硅膠加至上述已平衡好的玻璃柱頂端。用甲醇-水溶液梯度洗脫，依次用不同比例的甲醇-水溶液(50∶50和60∶40)分別沖洗約200 ml，洗脫液真空減壓濃縮至干，TLC法檢測(cè)濃縮物中均無五味子酚；繼續(xù)用甲醇-水(70∶30)混合溶液沖洗約360 ml，洗脫液濃縮物TLC法檢測(cè)，純的五味子酚開始被洗脫出來，用甲醇-水(70∶30)混合溶液約2 000 ml繼續(xù)洗脫，得到高純度的五味子酚。

1.2.7 五味子酚的純度檢測(cè)。將制備得到的五味子酚純品與五味子酚對(duì)照品通過2種互不交叉溶劑展開體系的薄層層析、質(zhì)譜和NMR等方法進(jìn)行檢測(cè)，并按照“1.2.3”色譜條件通過高效液相色譜進(jìn)一步檢測(cè)其純度。

2 結(jié)果與分析

2.1樣品含量測(cè)定 取不同產(chǎn)地的五味子藥材，進(jìn)行了藥材中五味子酚含量的測(cè)定，結(jié)果表明(表1)，樣品6中五味子酚的相對(duì)含量最高，選用產(chǎn)地6的華中五味子進(jìn)行五味子酚的制備試驗(yàn)可獲取得率相對(duì)高的純品。

表1　 不同產(chǎn)地華中五味子中五味子酚的含量

2.2五味子酚的純度檢測(cè) 制備的五味子酚純品經(jīng)與五味子酚對(duì)照品進(jìn)行2種互不交叉溶劑展開體系(石油醚-乙酸乙酯體系和環(huán)己烷-丙酮體系)的薄層層析檢測(cè)、質(zhì)譜和NMR對(duì)比分析，結(jié)果顯示其Rf值一致、譜圖數(shù)據(jù)均與對(duì)照品一致，故鑒定為五味子酚[13]。分析HPLC圖(圖1)可知，通過上述方法制備得到的五味子酚純度可達(dá)99.5%以上。

3 討論

五味子酚具有很好的抗氧化生物活性，文獻(xiàn)報(bào)道中多以紅花五味子和北五味子作為原料藥材，其中又以紅花五味子中五味子酚的含量較高，但紅花五味子的資源有限。該研究利用HPLC方法對(duì)不同產(chǎn)地的華中五味子中五味子酚進(jìn)行含量測(cè)定，選出含量最高產(chǎn)地的華中五味子，對(duì)其中的五味子酚進(jìn)行提取和制備，豐富了獲得五味子酚的資源和制備方法，該研究的技術(shù)方法能較好地為五味子酚化學(xué)和生物學(xué)的可持續(xù)研究提供原料需求，具有重要的實(shí)用價(jià)值。

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