螺旋藻蛋白酶解劑的篩選與優(yōu)化

螺旋藻蛋白酶解劑的篩選與優(yōu)化

張 軍， 鄒 寧*， 孫東紅， 曲青梅， 李小慧

(魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264000)

摘要[目的]篩選并優(yōu)化螺旋藻蛋白酶解劑。 [方法]采用酶解法初步研究了中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶4種蛋白酶對(duì)螺旋藻蛋白質(zhì)的水解效果，同時(shí)研究了底物濃度和酶的添加量對(duì)水解率的影響。[結(jié)果]結(jié)果表明，蛋白酶按酶解螺旋藻蛋白質(zhì)的水解率，可由高到低依次排列為：堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶。通過對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶的作用效果受pH影響最大，最高水解率為60.5%(底物濃度20 g/L、E/S=4%、pH=8.9、55 ℃、酶解5 h)。同時(shí)得出，堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶的最佳底物濃度均為20 g/L，最佳酶添加量均為4%，而風(fēng)味蛋白酶的最佳底物濃度為20 g/L，最佳酶添加量為2%。[結(jié)論]研究可為后續(xù)功能性多肽的提取利用提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞螺旋藻；蛋白質(zhì)；酶解；水解率；優(yōu)化

中圖分類號(hào)S917；Q7

作者簡介張軍(1991- )，男，山東棗莊人，碩士研究生，研究方向：藻類活性物質(zhì)提取利用。*

收稿日期2015-06-01

Screening and Optimization of Hydrolysis of Spirulina Proteins by Enzymes

ZHANG Jun, ZOU Ning*, SUN Dong-hong et al (School of Life Science, Ludong University, Yantai, Shandong 264000)

Abstract[Objective] To screen and optimize Spirulina proteinase solution.[Method] Hydrolysis efficiency of four kinds of enzymes(neutral protease, complex protease, flavor protease, alkaline protease) on Spirulina proteins were preliminarily studied in this work. The effects of substrate concentration and enzyme adding amount on hydrolysis rate were studied. [Result] The results showed that the hydrolysis of alkali protease had the maximal HE which was followed by the efficiency of flavor enzyme, compound proteinase, neutral protease, sequentially. The efficiency of the alkali protease was apparently affected by pH compared with the others. Its maximal HE was 60.5%(substrate 20 g/L, E/S=4%, pH=8.9, 55 ℃, hydrolysis 5 h). The ratios of enzyme to substrate (E/S) and the substrate concentrations were optimized as well. The optimal substrate concentrations for the three kinds of enzymes was 20 g/L. The optimal enzyme concentrations was 4% for them. Whileoptimal flavor enzyme concentration was 2%, and its optimal substrate concentration was 20 g/L. [Conclusion] The study can provide reference basis for extraction and utilization of follow-up functional peptide.

Key wordsSpirulina; Proteins; Hydrolysis; HE; Optimization

螺旋藻中蛋白質(zhì)含量可達(dá)60%～70%，含有豐富的維生素、葉酸和植物中罕見的γ-亞麻酸。試驗(yàn)表明，螺旋藻的攝入能提高機(jī)體免疫力[1-2]，抗氧化功能也得到了證實(shí)[3]。螺旋藻含有具有防癌、抗癌功能的多糖[4]。不飽和脂肪酸及γ-亞麻酸，可以作為具有多種生理調(diào)節(jié)活性的前列腺素的前體，這些前體的衍生物具有使血管平滑肌舒張、降低血壓的作用[5]。除各種用于常見防御、治療用途外，螺旋藻在食品添加、污水處理等方面也有應(yīng)用[6-8]。

酶法水解具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)進(jìn)程容易控制、無毒害反應(yīng)等特點(diǎn)，可有效去除螺旋藻腥味[9]，且酶解后的蛋白有更高的優(yōu)越性和更廣泛的應(yīng)用范圍。螺旋藻蛋白酶解后的產(chǎn)物中，具有保健效果的寡肽和具有鮮味的氨基酸的含量均較豐富，酶解提取出的物質(zhì)具有比水提和有機(jī)溶劑提取的物質(zhì)更高的活性[10]。筆者對(duì)螺旋藻蛋白酶解進(jìn)行初步探究，為后續(xù)功能性多肽的提取利用作準(zhǔn)備。

1材料與方法

1.1材料該試驗(yàn)所用的鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)由煙臺(tái)華融生物科技有限公司生產(chǎn)提供。主要試劑：復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶均為諾維信品牌蛋白酶。主要儀器：分析天平(FC204)，上海精科電子天平；水浴鍋(HH-S)，金壇市恒豐儀器廠；自動(dòng)電位滴定儀(ZD-3A)、離心機(jī)(AK-1000)、恒溫干燥箱(KA-1000)，上海安亭科學(xué)儀器廠；凱氏定氮儀等。

1.2螺旋藻含水量與總蛋白質(zhì)含量的測定水分測定：用已烘干至恒重0.259 0 g稱量紙，精確稱取螺旋藻1.000 2 g , 105 ℃烘至總恒重1.161 4 g，計(jì)算得螺旋藻水分為9.78%。蛋白測定：采用凱氏定氮法測螺旋藻中總蛋白質(zhì)含量[11]。準(zhǔn)確稱取螺旋藻0.500 9 g，測得所用螺旋藻蛋白質(zhì)含量為68.15%。

1.3螺旋藻的細(xì)胞破壁該試驗(yàn)采用反復(fù)凍融法進(jìn)行螺旋藻的細(xì)胞破壁：配置一定體積濃度的螺旋藻溶液，反復(fù)凍融3次[12-13](室溫避光融解，避免色素受到破壞)。

1.4螺旋藻的酶解配制一定濃度的螺旋藻溶液，反復(fù)凍融3次，轉(zhuǎn)移至250 ml錐形瓶，水浴加熱至55 ℃。

pH優(yōu)化試驗(yàn)：用 NaOH溶液(0.05 mol/L)、檸檬酸溶液(5%)調(diào)節(jié)已轉(zhuǎn)移至錐形瓶內(nèi)的溶液的pH。對(duì)于風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶，溶液的pH梯度為6、7、8，對(duì)堿性蛋白酶，溶液的pH梯度為8.0、8.5、8.8、8.9、9.0、9.1、9.5。其他酶解條件：底物濃度40 g/L、E/S=4%、55 ℃、酶解5 h。

酶添加量優(yōu)化試驗(yàn)：設(shè)置酶添加量為2%、4%、6%的梯度，其他試驗(yàn)條件為：底物濃度40 g/L、55 ℃、酶解5 h，中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶作用時(shí)pH為7，堿性蛋白酶作用時(shí)pH為8.9。

底物濃度優(yōu)化試驗(yàn)：設(shè)置底物濃度為20、40、60、80 g/L的梯度，優(yōu)化堿性蛋白酶酶解時(shí)的底物濃度。其他酶解條件為pH 8.9，底物濃度為4%，反應(yīng)溫度為55 ℃。

酶解過程中每1 h測定溶液pH。酶解完成后，90 ℃滅酶20 min，降至室溫后3 000 r/min離心20 min,待測。

1.5酶解液中氨基氮含量的測定該試驗(yàn)采用甲醛滴定法測定酶解液中氨基氮的含量[14]：

式中，X為試樣中氨基酸態(tài)氮的含量(g/L);V1為酶解液稀釋液在加入甲醛后滴定至pH 9.2所用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(ml)；V2為空白滴定在加入甲醛后滴定至pH 9.2所用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(ml)；V3為吸取稀釋液體積20 ml；c為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mol/L)。

1.6螺旋藻蛋白質(zhì)水解率的計(jì)算[15]具體計(jì)算公式如下：

HE(%)=(樣品游離氨基含量/樣品蛋白質(zhì)含量-0.663)/8.2 mmol/g×100

2結(jié)果與分析

2.1pH對(duì)螺旋藻蛋白質(zhì)水解率的影響pH影響酶分子活性部位上有關(guān)基團(tuán)的解離，從而影響與底物的結(jié)合或催化，使酶活性降低,也可能影響到中間絡(luò)合物的解離狀態(tài)，不利于催化生成產(chǎn)物[16]。圖1、2、3為蛋白酶酶解時(shí)pH對(duì)風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶酶解螺旋藻蛋白質(zhì)的水解率的影響(底物濃度40 g/L、E/S=4%、55 ℃、酶解5 h)。酶的活力受環(huán)境pH影響，在一定pH下，蛋白酶表現(xiàn)最大活力，高于或低于此pH，酶活力降低，該pH為最適pH。由圖1、2、3可見，復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶的最適pH為7，堿性蛋白酶的最適pH為8.9。過酸或過堿可以使酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，引起酶構(gòu)象的改變，酶喪失活性。當(dāng)pH改變不很劇烈時(shí)，酶雖未變性，但pH影響了底物的解離狀態(tài)，或使底物不能和酶結(jié)合，或者結(jié)合后不能產(chǎn)生產(chǎn)物。因此在非最適pH條件下水解率降低。

圖1　pH對(duì)風(fēng)味酶水解率的影響

圖2　pH對(duì)復(fù)合蛋白酶水解率的影響

圖3　pH對(duì)堿性蛋白酶水解率的影響

2.2E/S對(duì)螺旋藻蛋白質(zhì)水解率的影響在一定添加量范圍內(nèi)，酶解效果隨蛋白酶的添加量增大而提高。圖4為不同的蛋白酶添加量下對(duì)應(yīng)的水解率。堿性蛋白酶、中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶，在酶濃度較低時(shí)，底物過量，增加蛋白酶的量，可降低沒有與酶的活性中心結(jié)合的底物的量，明顯提高螺旋藻的水解率。超過4%的添加量，其用量接近足量，再繼續(xù)添加蛋白酶，水解率升高幅度不大。而對(duì)于風(fēng)味蛋白酶，2%的添加量已經(jīng)接近足量，其用量提高對(duì)水解率的影響一直不大。

圖4　蛋白酶添加量對(duì)水解率的影響

2.3底物濃度對(duì)螺旋藻蛋白質(zhì)水解率的影響在一定添加量范圍內(nèi)，酶解效果隨底物濃度增加而減小。圖5所示堿性蛋白酶在不同底物濃度(pH 8.9、E/S為4%、55 ℃、水解5 h)下的水解率，可以看出，在該條件下，水解率隨底物濃度的增大而減小。隨著底物濃度的增加，溶液密度增高，變得黏稠，底物的有效濃度減小，底物中能與酶的活性中心結(jié)合并反應(yīng)的底物比例下降，導(dǎo)致水解率降低。

圖5　底物濃度對(duì)螺旋藻蛋白質(zhì)的水解率的影響

3結(jié)論與討論

通過該試驗(yàn)可以看出，所用4種蛋白酶按對(duì)螺旋藻蛋白的水解率，由高到低依次為：堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶。最佳水解條件為：底物濃度20 g/L，酶添加量為4%，反應(yīng)溫度為55 ℃，堿性蛋白酶的最適pH為8.9，其水解率可達(dá)到60.5%。復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶的最適pH為7，最高水解率分別為16.0%、12.5%、41.1%。

試驗(yàn)過程中所算得氨基氮的量在醬油質(zhì)量的評(píng)定中作為風(fēng)味的指標(biāo)。在底物濃度為20、40、60、80 g/L，其他條件為堿性蛋白酶的最適條件下，其氨基氮的含量分別為660、1 271、1 760、2 471 mg/L,具有良好的鮮味。蛋白酶主要催化水解蛋白質(zhì)內(nèi)部的肽鍵。水解率均在3～4 h后才變得平緩。如果希望得到更小分子的多肽和游離氨基酸，可通過延長水解時(shí)間實(shí)現(xiàn)[17]。該試驗(yàn)水解時(shí)間經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)確定為5 h。

酶解溫度:所購買的堿性蛋白酶，推薦使用溫度50～60 ℃，pH使用范圍6.0～9.5；風(fēng)味蛋白酶推薦使用溫度45～50 ℃，pH使用范圍4.5～8.0；若2種酶同時(shí)使用，反應(yīng)溫度為50 ℃。復(fù)合蛋白酶及中性蛋白酶推薦使用溫度55 ℃，試驗(yàn)中反應(yīng)溫度定為55 ℃?？紤]離心后的殘?jiān)倪M(jìn)一步酶解及酶解得到的多肽生物學(xué)功能，有待進(jìn)一步試驗(yàn)。

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