發(fā)酵醪中添加酸性蛋白酶對黃酒穩(wěn)定性的影響

魏桃英，汪釗，魏瑞鋒

1(浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 紹興，312000) 2(浙江工業(yè)大學(xué)，浙江杭州，31000)

黃酒不穩(wěn)定，主要是由非生物渾濁引起的，而非生物渾濁，一般認為主要是由于酒體中的蛋白質(zhì)［1］或蛋白與多酚類物質(zhì)(如單寧)相結(jié)合而引起的［2］或氧化作用、重金屬影響［3］。黃酒不穩(wěn)定主要表現(xiàn)在黃酒的冷渾濁與陳釀過程中或瓶裝加熱后出現(xiàn)沉淀物［4］。要提高它的穩(wěn)定性，必須降低酒體中蛋白質(zhì)的含量。首先從蛋白質(zhì)上著手，加入蛋白酶來分解原料與微生物中的蛋白質(zhì)，從而減少酒體中的蛋白質(zhì)。啤酒生產(chǎn)中已在用木瓜蛋白酶來提高啤酒的穩(wěn)定性。借鑒啤酒的方法把木瓜蛋白酶運用到黃酒發(fā)酵中來。由于黃酒的pH值為3.7～4.5左右，本試驗通過向黃酒發(fā)酵醪中添加一定比較的酸性蛋白酶，以期提高黃酒的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料

酸性蛋白酶，10萬U/g;大米，市售;釀造用水，紹興地區(qū)自來水;安琪酵母(黃酒高活性干酵母)，安琪酵母股份有限公司;麥曲，會稽山生產(chǎn)。

1.2 主要儀器

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司，上海博迅儀器廠;生化培養(yǎng)箱BSP-150;酒精蒸餾儀一套;離心機;pH-3C酸度計，上海精密科學(xué)上海雷磁儀器廠;722型分光光度計，上海科曉科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃酒釀造工藝流程

(1)大米→浸米→蒸飯→攤冷→投料→添加酸性蛋白酶→前發(fā)酵→后發(fā)酵→壓榨→過濾→殺菌→灌裝→貯存

(2)大米→浸米→蒸飯→攤冷→投料→前發(fā)酵→添加酸性蛋白酶→后發(fā)酵→壓榨→過濾→殺菌→灌裝→貯存。

1.3.2 操作要點

浸米:稱取粳米15 kg于桶中，加水到浸沒米10 cm，浸米時間以氣溫來定，一般浸到米用手輕捻一下即能粉碎為止。浸米主要是為了讓大米吸水膨脹，蒸飯容易，一般根據(jù)米質(zhì)情況，浸漬24～48 h。

蒸飯:把浸好的米用紗布包好，進行蒸汽蒸，蒸到飯粒疏松不糊，顆粒完整，不黏連結(jié)塊，成熟均勻一致，內(nèi)無白心生粒。

1.3.3 酒用酸性蛋白酶的添加方案

添加量0、5、10、15、20、25 U/g 各 5 個樣品試驗，稱量所需的蛋白酶與0.1%的黃酒活性干酵母，混勻后接種于蒸好的米飯中，另外所有條件都相同，麥曲加量為米的18%，水的加量為米的120%。酸性蛋白酶在添加前用50℃熱水活化30 min，每組做平行試驗，取平均值。

投料后按黃酒生產(chǎn)工藝進行操作。開耙時，頭、二耙可視品溫的高低由開耙人掌握，有案例經(jīng)驗認為頭、二耙溫度之和不超過70℃(加酶后不超過63℃)。三、四耙則要結(jié)合感官檢查，通過聽、看、摸、嘗，判斷發(fā)酵醪的成熟程度，及時開耙和降溫，保證發(fā)酵正常進行;四耙以后，每天搗耙2～3次，直至接近室溫。適當(dāng)攪拌可增加酒醅中的氧氣，提高酵母活力，抑制雜菌生長，但應(yīng)注意減少酒精揮發(fā)，及時灌壇，進行后發(fā)酵。前酵時間一般控制在5 d。進入后發(fā)酵階段，應(yīng)保持低溫，一般品溫應(yīng)控制在15℃，后酵時間在15 d左右，前10天每天至少要攪拌開耙1次，通入新鮮空氣，保持酵母活力，使酒體逐漸豐滿協(xié)調(diào)。

1.3.4 總糖的測定［5］

1.3.5 酒精度測定［5］

1.3.6 酸度與氨基酸態(tài)氮的測定［5］

1.3.7 酒樣穩(wěn)定性測定

(1)酒樣濁度的測定［6］:在可見分光光度計上，設(shè)定800 nm為測定波長，以澄清的空白同樣酒樣為參比，將待測定酒樣迅速搖勻測定透光率T，以1-T作為黃酒的濁度。

(2)酒樣的冷渾濁測定:取殺菌后的酒樣50 mL，在0℃冰箱中放置12 h，拿出后快速測定濁度。

(3)酒樣強化實驗［7］:以酒樣在0～4℃冰箱內(nèi)放置12 h，60℃烘箱中放置12 h，2次循環(huán)后，取出在常溫下800 nm處快速測定透光率T，1-T為其濁度。

(4)乙醇濁度測定［8］:在10 mL澄清酒樣加入5 mL無水乙醇，用混合器振蕩1 min，室溫放置2 h，取出后快速測定濁度。

1.3.8 黃酒發(fā)酵醪中酵母數(shù)的檢測

1.3.8.1 方法步驟

(1)稀釋:吸取10.0 mL樣品于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容后搖勻，即試樣。

(2)加樣:取潔凈干燥的血球計數(shù)板1塊，在計數(shù)區(qū)上蓋上蓋玻片，用1 mL移液管滴1小滴試樣，從計數(shù)板中間平臺兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴(不宜過多)，讓試樣利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余試樣。也可以將試樣直接滴加在計數(shù)區(qū)上(不要使計數(shù)區(qū)兩邊平臺沾上試樣，以免加蓋蓋玻片后，造成計數(shù)區(qū)深度的升高)，然后加蓋蓋玻片(勿使產(chǎn)生氣泡)。靜置片刻，使細胞沉降到計數(shù)板上，不再隨液體漂移。將血球計數(shù)板放置于顯微鏡的載物臺上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下找到計數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計數(shù)。由于生活細胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應(yīng)減弱光照的強度。靜置2 min。

(3)鏡檢計數(shù):用400倍顯微鏡觀察。調(diào)節(jié)顯微鏡使計數(shù)室清晰，計數(shù)時若計數(shù)區(qū)是由16個大方格組成，按對角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個大方格(即100小格)的菌數(shù)。如果是25個大方格組成的計數(shù)區(qū)(如圖2)，除數(shù)上述4個大方格外，還需數(shù)中央1個大方格的菌數(shù)(即80個小格)。為了保證計數(shù)的準確性，避免重復(fù)計數(shù)和漏記，在計數(shù)時，對沉降在格線上的細胞的統(tǒng)計應(yīng)有統(tǒng)一的規(guī)定。如菌體位于大方格的雙線上，計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。即位于本格上線和左線上的細胞計入本格，本格的下線和右線上的細胞按規(guī)定計入相應(yīng)的格中。對于出芽的酵母菌，芽體達到母細胞大小一半時，即可作為兩個菌體計算。每個樣品重復(fù)計數(shù)2～3次(每次數(shù)值不應(yīng)相差過大，否則應(yīng)重新操作)，計算出1 mL菌懸液所含細胞數(shù)量。

(4)清洗:測數(shù)完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數(shù)板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風(fēng)機吹干，放入盒內(nèi)保存。

黃酒發(fā)酵是多菌種發(fā)酵，利用形態(tài)與個體的大小來鑒別酵母菌。黃酒酵母菌細胞的形態(tài)通常有球形、卵圓形、橢圓形。比細菌的單細胞個體要大得多，一般為1～5 μm ×5～30 μm。酵母菌無鞭毛，不能游動。在放大400倍的顯微鏡下，細菌只能看到很小的一個點，它與黃酒酵母菌很容易區(qū)別。至于霉菌一般情況下，它是以菌絲為單位，呈長管狀的，很易與黃酒酵母菌區(qū)分。

1.3.8.2 計算

16×25規(guī)格的計數(shù)板:

2 結(jié)果與討論

2.1 投料時添加不同量的酸性蛋白酶對黃酒的酒精度影響

在黃酒釀造投料時添加不同量的酸性蛋白酶后對黃酒的酒精度生成量的影響見圖1。

從圖1可知，使用酸性蛋白酶比例越高，則發(fā)酵初期的酒度相對也越高。在投料時添加酸性蛋白酶，相當(dāng)于在培菌階段添加。添加不同量的酸性蛋白酶對黃酒前4天內(nèi)的酒精度影響較大，這是因為，在投料時加入酸性蛋白酶，可以快速地分解原料中的蛋白質(zhì)，分解出游離的氨基酸等小分子物質(zhì)，為酵母生長提供充足的必需營養(yǎng)物，有利于酵母快速繁殖［7］。增加酒精發(fā)酵的能力，表現(xiàn)為發(fā)酵醪的酒度明顯提高。第1天的各指標檢測時間是28 h左右。

圖1 投料時加入酸性蛋白酶酒精度的變化Fig.1 Add the change of the acid protease alcohol feeding

2.2 投料時添加不同量的酸性蛋白酶對黃酒發(fā)酵醪酵母數(shù)的影響

在投料時添加不同量的酸性蛋白酶后對黃酒發(fā)酵醪中酵母數(shù)的生成量的影響見圖2。

圖2 投料時加入酸性蛋白酶黃酒酵母數(shù)變化情況Fig.2 Feeding when adding acid protease，the change of the number of yellow wine yeast

從圖2分析可知，在黃酒生產(chǎn)中通過增加酸性蛋白酶的添加量，可以使酵母細胞數(shù)在1 d后增加，到2 d時其酵母數(shù)量可翻倍，而沒有加酸性蛋白酶的醪液中酵母數(shù)2 d檢測的數(shù)值與添加酸性蛋白酶1 d檢測的數(shù)值相當(dāng)，而且也增加到頂峰。黃酒發(fā)酵醪中酵母數(shù)增加得多，產(chǎn)生酒精的量也相應(yīng)增加，這與圖1的數(shù)值相吻合。當(dāng)然由于酵母數(shù)檢測時，取樣有系統(tǒng)誤差與偶然誤差存在，不同的酸性蛋白酶添加量與酵母生成量是否有比例關(guān)系這一點不能下結(jié)論，但加入酸性蛋白酶確實可以增加酵母的數(shù)量。

2.3 投料時添加不同量的酸性蛋白酶對黃酒發(fā)酵醪中酸度的影響

投料時添加不同量的酸性蛋白酶后對黃酒發(fā)酵醪中酸度的影響如圖3所示。

圖3 投料時加入酸性蛋白酶發(fā)酵醪酸度的變化Fig.3 Feeding when adding acid protease fermentation mash acidity change

研究之初加入酸性蛋白酶的量為10，20，30，40，50U/g，發(fā)酵到7天，加入酶量為40、50 U/g的二只酒檢測酸度為8.5 g/L，酸度超過GB/T13662-2008黃酒國標7.5 g/L，且有酸臭氣，出現(xiàn)了酸敗現(xiàn)象。因此減少用酶量，適當(dāng)降低開耙溫度，再進行實驗。在投料時添加不同酸性蛋白酶的酸度變化情況如圖3所示，在試驗范圍內(nèi)添加的酸性蛋白酶量越多，產(chǎn)生的酸度相對也高，這一方面可能是因為前發(fā)酵添加酸性蛋白酶，使醪液的氮源增多，氨基酸含量豐富，不但有利于酵母菌的繁殖與生長，也有利于其他雜菌的生長與繁殖，同時此時醪液酒精度較低，不能抑制雜菌生長，前期產(chǎn)生的生酸菌增加，發(fā)酵后期造成酸敗，同時黃酒發(fā)酵是開放性發(fā)酵，酵母菌與乳酸菌是共存的，加入蛋白酶有利于乳酸菌的生長，所以醪液中酸度比沒加酸性蛋白酶的黃酒醪液要高。

2.4 投料時添加不同量的酸性蛋白酶對黃酒發(fā)酵醪中糖含量的影響

投料時添加不同量的酸性蛋白酶對黃酒發(fā)酵醪中糖生成量的影響如表1所示。

表1 投料時加入酸性蛋白酶發(fā)酵醪糖度的變化Table 1 Feeding when adding acid protease fermentation mash sugar changes

從表1可知，前發(fā)酵期加入不同量的酸性蛋白酶，酒樣總糖含量略有增加，這可能是因為酸性蛋白酶分解原料較徹底，醪液營養(yǎng)成分更加豐富;另外加酸性蛋白酶的醪液中霉菌數(shù)量比沒加的醪液霉菌數(shù)量多，霉菌分泌出的總的糖化酶與液化酶較多，從而有利于淀粉的分解，使總糖稍高于沒加酸性蛋白酶的黃酒醪液。加入適量酸性蛋白酶可以使麥曲的糖化力升高，可能是因為釀酒原料中的淀粉對糖化性淀粉有吸附作用，加入酸性蛋白酶可以降低吸附能力［9］。加入酸性蛋白酶使糖度略有上升，從2.1得出的結(jié)論可知，加入適量的酸性蛋白酶使酒精度上升，這是因為葡萄糖作為酒精產(chǎn)生的反應(yīng)前體，如果前體物質(zhì)葡萄糖的數(shù)量大，反應(yīng)后剩余的葡萄糖的量也相對較多。

2.5 投料時添加不同量的酸性蛋白酶對黃酒理化指標的影響

投料時添加不同量的酸性蛋白酶，發(fā)酵結(jié)束時黃酒理化指標如表2所示。

表2 投料時加入酸性蛋白酶發(fā)酵結(jié)束時理化指標Table 2 Feeding when adding acid protease fermentation at the end of the physical and chemical indicators

2.6 前發(fā)酵后添加不同量的酸性蛋白酶進行發(fā)酵釀造試驗分析

投料5 d前發(fā)酵后加入不同量的酸性蛋白酶，進行發(fā)酵，只是加入酸性蛋白酶的時間不同，另外都與投料時加入酸性蛋白酶的操作相同。到發(fā)酵結(jié)束時對其理化指標進行檢測，前發(fā)酵后添加不同量的酸性蛋白酶在黃酒發(fā)酵結(jié)束時理化指標如表3所示。

表3 前發(fā)酵后加入酸性蛋白酶發(fā)酵結(jié)束時理化指標Table 3 before fermentation after adding acid protease fermentation at the end of the physical and chemical indicators

從表2與表3檢測數(shù)據(jù)可知，投料時加入酸性蛋白酶與前發(fā)酵5 d后加入酸性蛋白酶到發(fā)酵結(jié)束時兩者理化指標的差別不大，總的來說酒精度、酸度、氨基酸態(tài)氮、非糖固形物生成量與加入酸性蛋白酶的量成正比，對氨基酸態(tài)氮的影響最明顯，對表3數(shù)據(jù)進行分析，不加酶的氨基酸態(tài)氮含量為0.33，添加25 U/g酶的氨基酸態(tài)氮含量為0.56，氨基酸態(tài)氮含量增加了70%，酒精度增加9%，酸度增加了30%，總糖增加了40%，非糖固形物含量增加了13%。從本次研究數(shù)據(jù)分析可知，除了表2前發(fā)酵加入25 U/g酶的非糖固形物比沒加酶的增加了18.1%，另外的檢測數(shù)值都相差不多。從理論上來講，黃酒用酸性蛋白酶的最適作用溫度是30℃，在投料時加入的效果比前發(fā)酵后加入的效果好。因為后酵溫度控制在15℃左右，這有可能會影響酸性蛋白酶的活性。在投料時加入酸性蛋白酶更加方便些，開耙次數(shù)多有利于酶與物料接觸，使反應(yīng)均勻，如果在后酵時加入又多了一道工序，所以結(jié)合生產(chǎn)情況。在投料時加入與前酵后(發(fā)酵5 d后)加入兩者相比，只要控制好溫度，還是在投料時加入比較好。

2.7 添加酸性蛋白酶對發(fā)酵釀造的酒樣穩(wěn)定性的影響

不同時間段加入的酸性蛋白酶釀成的酒經(jīng)過濾后用3種方法來檢測酒樣的穩(wěn)定性，檢測結(jié)果如表4、表5所示。

表4 投料時加入不同量的酸性蛋白酶酒樣穩(wěn)定性比較Table 4 Feeding with different amount of acid protease liquor stability

表5 后發(fā)酵時加入不同量的酸性蛋白酶酒樣穩(wěn)定性比較Table 5 After fermentation when adding different amount of acid protease liquor stability

分析表4與表5數(shù)據(jù)可知，加入酸性蛋白酶的酒樣，原始濁度總的趨勢是隨著酶量的增加而增加，沒加酶的酒樣原始濁度最低。這種情況主要是由于加入酸性蛋白酶使酒體內(nèi)的固形物增多造成的。從冷渾濁、強化試驗、乙醇濁度試驗3種方法檢測數(shù)據(jù)可知，添加10、15、20 U/g酸性蛋白酶釀成的酒樣濁度相對都低。所以酸性蛋白酶的加入量在10～20 U/g較為適宜。不同時間段添加蛋白酶量，反映出相同的規(guī)律。這說明在投料時加入與前酵后加入，對酒樣的非生物穩(wěn)定性影響不大，這可能是由于養(yǎng)醅時間較長，酸性蛋白酶有充分的反應(yīng)時間，而生產(chǎn)中實際釀造時間與之相比要短一些，因此投料時加入酸性蛋白酶效果更好。

3 小結(jié)

酸性蛋白酶添加過量易使黃酒醪酸敗。酸性蛋白酶加入50U/g，開頭耙溫度36℃，結(jié)果不到8 d發(fā)酵醪就酸敗了，酸度大于8.5g/L，經(jīng)鏡檢后發(fā)現(xiàn)桿菌大量出現(xiàn)，而酵母數(shù)只有0.5億/mL。這有可能是因為發(fā)酵溫度過高，來不及散熱，使酵母衰敗過速。在減少酶量的同時也降低了開耙溫度，溫度為33℃開頭耙。這樣發(fā)酵醪沒有整批酸敗的現(xiàn)象發(fā)生。由于開頭耙的溫度比大生產(chǎn)的低2%～3%。投料時加入酸性蛋白酶與前發(fā)酵5 d后加入酸性蛋白酶到發(fā)酵結(jié)束時兩者理化指標的差別不大，總的來說酒精度、酸度、氨基酸態(tài)氮、非糖固形物生成量與加入酸性蛋白酶的量成正比，對氨基酸態(tài)氮的影響最明顯。通過冷混濁與強化試驗發(fā)現(xiàn)加入10～20 U/g的蛋白酶的強化濁度比原酒降低了0.3左右，冷混濁的沉淀量比原酒明顯減少。這說明黃酒的穩(wěn)定性有一定提高。通過發(fā)酵的不同時期加入相同量的酸性蛋白酶對黃酒穩(wěn)定性沒有多大的影響，但從黃酒的理化指標數(shù)據(jù)分析可知，投料時與前發(fā)酵后不同時間加入酸性蛋白酶對非糖固形物有影響。根據(jù)生產(chǎn)的實際情況，在投料時加入與前酵后(發(fā)酵5 d后)加入兩者相比只要控制好溫度還是在投料時加入比較好，本次課題的研究目的是黃酒的穩(wěn)定性，所以從本次黃酒穩(wěn)定性試驗結(jié)果可知在發(fā)酵時加入酸性蛋白酶添加量在10～20 U/g之間比較合適，結(jié)合試驗數(shù)據(jù)與企業(yè)的經(jīng)濟成本兩方面考慮，選用15U/g的酸性蛋白酶為最好。

［1］ Ferreira，Ricardo B;Picarra-Pereira，Maria A.Monteiro，Sara，Loureiro，Virgilio B，etal.The wine proteins，Trends in Food Science and Technology［J］，2001，(7):230-233.

［2］ Siebert K J.Effects of protein-polyphenol interactions on beverage haze stabilization and analysis［J］.J.Agri.Food.Chem.1999，47(2):353-362

［3］ 白樹雄.木瓜蛋白酶在啤酒生產(chǎn)中的應(yīng)用試驗［J］.廣西輕工業(yè)，1997(1):37-38.

［4］ 顧國賢.釀造酒工藝(第2版)［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1996.

［5］ GB/T13662-2008.黃酒［S］.

［6］ 錢俊青，蔣同雋，徐國明.吸附法提高黃酒穩(wěn)定性的研究［J］.中國釀造，1997(1):25-29.

［7］ 蔡小云，林峰，鄒慧君，等.一種快速判斷黃酒酒體非生物穩(wěn)定性的新技術(shù)［J］.中國釀造，2008(9):102-105.

［8］ 魏煒，張洪淵.酸性蛋白酶的性質(zhì)及其在白酒釀造中的作用［J］.釀酒科技，1997(6):18-20.

［9］ 鄭東寶.食品酶學(xué)［M］.南京:東南大學(xué)出版社，2006:144.