氧化誘導(dǎo)交聯(lián)對(duì)乳清蛋白膜光學(xué)性質(zhì)和水化性能的影響*

王耀松，吳滿剛

1(南京林業(yè)大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京，210037)

2(揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州，225127)

乳清蛋白是奶酪制作的副產(chǎn)物［1］，主要成分是α乳白蛋白(αLa)和 β 乳球蛋白(βLg)［2］。近年來(lái)，蛋白的成膜性很受關(guān)注［3］，這主要是因?yàn)槿榍宓鞍啄軌蛐纬赏该鳌椥?、無(wú)色的膜［4］，可作為食品包裝、涂膜材料［5］。由于生產(chǎn)成本和技術(shù)發(fā)展的原因，以及不同食品對(duì)包裝材料功能多樣性的要求，人們需要探索不同的技術(shù)以提升膜的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

目前對(duì)膜材料改造的技術(shù)已經(jīng)大大改善了膜材料的功能性［6-10］，這些技術(shù)的一個(gè)共同策略是促進(jìn)蛋白質(zhì)分子間共價(jià)交聯(lián)。然而，基于生產(chǎn)成本和食品安全的要求，非常有必要尋找新的交聯(lián)手段。前人報(bào)道中顯示羥基自由基能夠修飾蛋白，并促進(jìn)分子間的共價(jià)交聯(lián)［11-14］。事實(shí)上，在塑料工業(yè)中催化單體小分子交聯(lián)形成高分子［15］以及眾多親水膠體制備［16］中廣泛應(yīng)用這種自由基;因此有理由認(rèn)為它也可修飾蛋白膜材料，從而作為一種共價(jià)交聯(lián)手段。另外，乳清蛋白原料在貯藏過(guò)程中氧化反應(yīng)是不可避免的，特別是羥基自由基引起的自然氧化現(xiàn)象［17］，其結(jié)果可能造成肽鏈斷裂，側(cè)鏈氨基的修飾以及斷裂下來(lái)的肽或蛋白質(zhì)分子間(內(nèi))分子的交聯(lián)。在一些研究中發(fā)現(xiàn)羥基自由基氧化修飾蛋白三維構(gòu)象［18］，影響其凝膠性能［11-12］。在我們前期研究中也發(fā)現(xiàn)這種氧化促進(jìn)蛋白分子交聯(lián)，影響所成膜的機(jī)械性和浸出行為［19］，但對(duì)所成膜其他功能性質(zhì)(比如:顏色、透明性、溶解性)的影響還不清楚。

為此，研究采用先加熱后氧化(加熱→氧化)以及先氧化后加熱(氧化→加熱)2種模式分別模擬羥基自由基交聯(lián)蛋白以及氧化蛋白制備過(guò)程，同時(shí)結(jié)合不同加熱溫度以及pH處理，研究氧化對(duì)乳清蛋白所成膜的光學(xué)和水化性質(zhì)2個(gè)重要功能的影響，以加深對(duì)膜功能性改造的科學(xué)理論認(rèn)識(shí)以及為改造后膜的實(shí)際應(yīng)用提供技術(shù)策略。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清蛋白(WPI-90)，美國(guó) Hilmar公司;SDSPAGE實(shí)驗(yàn)所需試劑，美國(guó)Fisher Scientific公司;所有的化學(xué)試劑均為分析純。

恒溫恒濕箱，美國(guó)Parameter Generation＆Control公司;KT5-230-65千分尺，新加坡Kenta Technologies;UV紫外分光光度計(jì)，日本島津;色差儀Hunter Lab MiniScan XE plus(Mode-0/45，D65 鈉燈)，美國(guó)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳清蛋白氧化的制備

準(zhǔn)備60 g/L乳清分離蛋白水溶液，pH值調(diào)節(jié)到8或保持原始的值(pH 6.8);70～90℃水浴加熱30 min，冰塊冷卻到室溫(22℃)，然后采用羥基自由基氧化體系(含有0.1 mmol/L FeCl3+1 mmol/L抗壞血酸+0～20 mmol/L H2O2)在室溫下氧化2 h，之后加入最終濃度為1 mmol/L Trolox終止反應(yīng)，即為先加熱后氧化模式(加熱→氧化);調(diào)節(jié)加熱和氧化先后順序，則是先氧化后加熱模式(氧化→加熱)，具體加熱、氧化參數(shù)設(shè)置不變。所制備樣品置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蛋白膜的制備

將上述氧化、加熱蛋白溶液加入24 g/L的甘油，充分?jǐn)嚢?，?0 mL溶液均勻涂抹在10 cm×10 cm有機(jī)玻璃板上，置于23℃、RH 50±2%恒溫恒濕箱中;測(cè)定膜功能性前，樣品在箱內(nèi)至少平衡24 h。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

采用濃度分別為5%濃縮膠和15%分離膠的還原(加入5% β-巰基乙醇作為還原劑，β-ME)和非還原SDS-PAGE方法來(lái)測(cè)定蛋白交聯(lián)［20］。標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量大小(MW)采用6.5 kDa到200 kDa間的標(biāo)記物來(lái)定性。

1.2.4 厚度測(cè)定

千分尺隨機(jī)測(cè)定膜上的10個(gè)位置，其平均值則為膜的厚度。

1.2.5 顏色和透明性測(cè)定

對(duì)同一類型處理蛋白膜至少進(jìn)行3次掃描;標(biāo)準(zhǔn)白板(L＇=92.42，a＇=-0.95，b＇=0.85)對(duì)儀器背景值進(jìn)行校準(zhǔn)，測(cè)定膜的L，a和b值。用600 nm處膜材料的吸光度A600與膜厚度(mm)的比值來(lái)表示蛋白膜的透明性。

1.2.6 蛋白膜溶解度測(cè)定

將膜切成1 cm×2 cm大小，加入5.0 mL去離子水，室溫下放置搖床上搖動(dòng)24 h;采用雙縮脲試劑測(cè)定溶液里蛋白含量。蛋白膜溶解度表示為溶出的蛋白占膜總蛋白含量比例(單位:%)。

1.2.7 浸出蛋白質(zhì)組分測(cè)定

在室溫下將2.0 cm×2.4 cm大小的膜浸在50 mmol/L Mc’Ilvaine(pH 3 ～7)緩沖液中浸泡 24 h，采用SDS-PAGE方法測(cè)定上清液組分分子質(zhì)量。分離膠的濃度采用12.5%，其他測(cè)定參數(shù)設(shè)置同1.2.3。

1.2.8 微觀結(jié)構(gòu)測(cè)定

采用掃描電鏡(Model S-3400N，日立，日本東京)對(duì)所成膜材料的表面進(jìn)行觀察。使用鋒利刀片把膜切成小片，然后對(duì)膜樣品進(jìn)行噴金處理;電鏡的加速電壓為10 kV，觀察表面的超微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 氧化對(duì)蛋白質(zhì)交聯(lián)的影響

蛋白溶液在成膜前一系列的處理會(huì)對(duì)最終膜的性質(zhì)影響有重要的決定性作用。為了考察不同溫度(70～90℃)、氧化濃度(0～20 mmol/L H2O2)以及它們先后順序?qū)Φ鞍踪|(zhì)交聯(lián)行為的影響，采用SDSPAGE對(duì)pH 6.8的樣品進(jìn)行蛋白分離。圖1顯示了2種加熱、氧化模式，對(duì)分離出的蛋白條帶經(jīng)過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量條帶比對(duì)計(jì)算，可確定有牛血清白蛋白(BSA)，單體 αLa和 βLg及其二、三聚體(βLg dimer/trimer)和它們之間交聯(lián)物(βLg-αLa)。對(duì)于先加熱后氧化處理的樣品，發(fā)現(xiàn)溫度越高對(duì)交聯(lián)貢獻(xiàn)越大;在同樣溫度下，不同氧化濃度處理樣品間則無(wú)明顯差異。這可能是蛋白在空氣中加熱已發(fā)生氧化而致使羥基自由基后續(xù)氧化對(duì)交聯(lián)無(wú)顯著提高作用。在還原條件下，大部分聚集物被還原，但βLg的二聚物隨著氧化濃度越高條帶變得越濃。這意味著聚集物除了二硫鍵外，還有其他非還原性的化學(xué)鍵產(chǎn)生，比如羰基氨和雙酪氨酸［13］。對(duì)于先氧化后加熱處理的樣品在非還原條件下，70～90℃ 加熱促進(jìn)βLg、αLa二聚物隨著氧化濃度越高而含量越多，高聚物的量也同時(shí)增多，而不同加熱溫度間對(duì)二聚物含量增加沒(méi)有顯著效應(yīng);也就說(shuō)是，單體βLg、αLa對(duì)氧化比對(duì)加熱更敏感，導(dǎo)致二聚物抑制加熱對(duì)其進(jìn)一步交聯(lián)。類似的現(xiàn)象在前期工作中將樣品pH調(diào)至到8.0后也被觀察到［19］。

2.2 氧化對(duì)乳清蛋白膜感光特性的影響

2.2.1 乳清蛋白膜顏色

由表1可以看出，對(duì)于先加熱后氧化處理的乳清蛋白所制備的膜，總體趨勢(shì)上是白度L值隨著氧化濃度升高而增大，尤其是在H2O2濃度達(dá)到20 mmol/L顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，而綠度a值(負(fù)值)特別是黃度b值(正值)在H2O2濃度為5 mmol/L時(shí)就顯著降低(P＜0.05)。對(duì)于先氧化后加熱處理的樣品所制備的膜，白度L值和綠度a值與前者有類似的規(guī)律，而對(duì)于黃度b值在H2O2濃度超過(guò)10 mmol/L時(shí)，其值有正值變成負(fù)值，也就說(shuō)是這種序列氧化加熱方式能夠降低膜的黃度并且向藍(lán)度轉(zhuǎn)變?？傊?，氧化提高了蛋白膜的白度和綠度，降低黃度以及提高藍(lán)度(對(duì)先氧化后加熱樣品而言)。這些顏色上的變化，可能與模擬氧化體系中加入的鐵離子相關(guān)，與二價(jià)、三價(jià)鐵離子有關(guān)，在氧化、還原劑的作用下可相互轉(zhuǎn)化造成膜顏色的變化。在作為食品包裝膜材料，要考慮到對(duì)食品顏色的影響及進(jìn)一步影響消費(fèi)者偏好。

圖1 序列氧化和加熱處理乳清蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of sequential heating and oxidation or vice versa treated whey proteins

表1 氧化劑H2O2濃度對(duì)乳清蛋白膜顏色的影響Table 1 Effect of oxidant H2O2 concentration on the color of whey protein films

2.2.2 乳清蛋白質(zhì)透明性

相比顏色對(duì)于膜材料的重要性，透明性也是評(píng)價(jià)膜質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，因?yàn)檫@也直接影響消費(fèi)者對(duì)最終包裝食品的選擇。由表2可以看出，經(jīng)先加熱后氧化(在pH 6.8下)處理的乳清蛋白制備膜的透明性能先降低，特別在0.5 mmol/L H2O2達(dá)到最低然后又隨著氧化濃度上升而透明性增加;而H2O2在pH 8.0下對(duì)膜的透明性不及pH 6.8下影響大。對(duì)于先氧化后加熱所制備的乳清蛋白膜，在pH 6.8下氧化劑 H2O2對(duì)膜透明性沒(méi)有顯著性影響(P＞0.05)，而在pH 8.0下H2O2則降低膜的透明性。此外，對(duì)于同一氧化濃度，無(wú)論加熱和氧化順序，較高pH值則能提高膜的透明性，這是因?yàn)閜H值的提高有利于乳清蛋白帶有更多負(fù)電荷(遠(yuǎn)離等電點(diǎn)緣故)而促使蛋白分子間排斥，使蛋白均勻分散開(kāi)而提高透明性。

表2 氧化劑H2O2濃度和pH值對(duì)乳清蛋白膜透明性的影響Table 2 Effects of oxidant H2O2 concentration and pH on the transparency of whey protein films

2.3 氧化對(duì)乳清蛋白膜溶解度的影響

考察蛋白基質(zhì)材料的親、疏水性是為其在實(shí)際食品體系中應(yīng)用中提供一個(gè)重要參考。為此，采用溶解度來(lái)表征乳清蛋白膜的水化性能。未經(jīng)任何處理的乳清蛋白膜通常有較低的溶解性，而乳清蛋白原料經(jīng)過(guò)處理制備的膜溶解性會(huì)有較大的變化。由圖2-A可以看出，不同加熱溫度，特別是較高溫度90℃相比較低溫度(70℃和80℃)對(duì)膜有較低的溶解度，這與乳清蛋白分子在加熱下結(jié)構(gòu)展開(kāi)致使更多相互作用力(比如疏水性基團(tuán)間的作用力)而降低膜的溶解性。然而隨著H2O2濃度的提高至5 mmol/L以上，乳清蛋白膜的溶解度顯著上升。氧化因素比溫度因素對(duì)膜的溶解性影響更大。從圖2-B中(即先氧化后加熱處理的樣品)亦可以發(fā)現(xiàn)與先加熱后氧化制備的乳清蛋白膜的溶解性有類似的規(guī)律。從分子水平上來(lái)看，溶解性的變化可能與在氧化過(guò)程中蛋白分子中疏水性氨基酸遭到破壞有關(guān)。事實(shí)上，在前期研究中發(fā)現(xiàn) Met、Leu 及 Lys在氧化作用下?lián)p失較大［19］，即驗(yàn)證了羥基自由基通過(guò)氧化疏水性氨基酸而提高膜的溶解性。這給了我們一個(gè)重要啟示，氧化處理可有效改變膜的溶解性。

圖2 氧化劑H2O2濃度和成膜加熱溫度對(duì)乳清蛋白膜溶解度的影響Fig.2 Effects of oxidant H2O2 concentration and heating temperature on the solubility of whey protein films

2.4 氧化對(duì)乳清蛋白膜蛋白浸出性的影響

對(duì)經(jīng)歷90℃加熱再對(duì)經(jīng)歷5 mmol/L H2O2氧化處理的乳清蛋白制備膜的蛋白浸出成分進(jìn)行分析，一方面可反映膜蛋白分子間的作用力及膜的結(jié)構(gòu)，另外一方面可為膜在不同pH值食品體系中的應(yīng)用提供依據(jù)。從圖3可以看出，相同pH條件下，未經(jīng)氧化的樣品所成的蛋白膜蛋白浸出量顯著低于5 mmol/L H2O2處理的乳清蛋白膜。對(duì)照組(即蛋白未氧化)與處理組(即經(jīng)歷5 mmol/L H2O2氧化)在pH 3～7下膜蛋白浸出規(guī)律類似，僅是蛋白浸出量不同。具體表現(xiàn)如下:在非還原條件下，樣品在pH 3處有少量蛋白浸出，在pH 6和pH 7處蛋白浸出量則顯著提高，而在pH 4和pH 5處僅有極少量蛋白出現(xiàn);對(duì)浸出蛋白組分分子大小而言，在pH 6和pH 7處除了少量的bLg的二聚物及其三聚物，還有較大量的高聚物(處理組)，結(jié)合還原試驗(yàn)可知這些聚合物大部分是由還原性二硫鍵交聯(lián)而成，也含有少量非還原性共價(jià)。至于樣品在pH 4和pH 5處浸出率極少，這與乳清蛋白等電點(diǎn)(主要成分 βLg等電點(diǎn)為4.5)［21］相關(guān)，進(jìn)而使膜蛋白浸出量受到抑制。

對(duì)應(yīng)地是經(jīng)歷90℃加熱再經(jīng)不同濃度氧化劑H2O2處理生產(chǎn)的乳清蛋白膜在pH 6緩沖液下浸出電泳圖，結(jié)果見(jiàn)圖4。從非還原膠上可以看出(見(jiàn)圖4-A)，在pH 6溶液中的浸出蛋白量隨著H2O2濃度上升而顯著增加，特別是氧化劑H2O2濃度在5 mmol/L以上，有大量的高聚物浸出。對(duì)照還原電泳實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)圖4-B)，說(shuō)明這些蛋白浸出物除了大部分是由二硫鍵組成，還有部分由非還原性共價(jià)鍵交聯(lián)，而后者這些非還原性共價(jià)鍵主要交聯(lián)αLa單體和βLg單體形成它們單體的二(三)聚物及αLa/βLg，這與圖1結(jié)果也相互驗(yàn)證。

圖3 經(jīng)先加熱后氧化處理所成乳清蛋白膜在不同pH緩沖液中蛋白浸出物的電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of leached-out proteins from whey protein films(in pH 3 to pH 7 solutions)prepared with heating then oxidation

圖4 經(jīng)先加熱后不同濃度氧化劑量氧化所成膜在pH 6緩沖液中蛋白浸出物的電泳圖Fig.4 SDS-PAGE of leached-out proteins from the films prepared with heated then oxidized whey proteins.Leaching was done at pH 6

蛋白浸出性能一方面是由于其經(jīng)歷加熱，特別是氧化修飾而改變蛋白結(jié)構(gòu)從而引起親水性能的變化;另外一方面，加熱和氧化因素也會(huì)導(dǎo)致蛋白所成膜微觀結(jié)構(gòu)的變化。從pH 8.0條件下制備乳清蛋白膜微觀結(jié)構(gòu)圖(圖5)可以看出，先加熱(90℃)后氧化蛋白所成膜的微孔數(shù)量和孔徑大小會(huì)隨著氧化濃度的上升(B:1 mmol/L H2O2→C:10 mmol/L H2O2)而明顯增多和增大(圖5-B、圖5-C)。相比之下，先氧化后加熱蛋白所成膜(D:1 mmol/L H2O2→E:10 mmol/L H2O2)的微孔數(shù)目和大小不及前者數(shù)量多和孔徑大。這些微孔的存在極有可能與蛋白溶解度相關(guān)。與膜溶解性數(shù)據(jù)(圖2)對(duì)照，可見(jiàn)微孔數(shù)目和大小與溶解度正相關(guān)，至于膜的橫截面結(jié)構(gòu)特征對(duì)溶解度的影響也有類似的結(jié)果［19］;也就是說(shuō)，微觀結(jié)構(gòu)形貌學(xué)特征解釋了膜材料水化性能的變化，即羥基自由基氧化蛋白最終修飾其所成膜的水化功能性。

圖5 WPI經(jīng)過(guò)先氧化后加熱以及先加熱后氧化處理所制備膜的表面掃描電鏡圖Fig.5 SEM surface images of the films prepared from the sequential heating and oxidation or vice versa treated whey proteins

3 結(jié)論

氧化可作為交聯(lián)手段修飾乳清蛋白重要手段，對(duì)其具有共價(jià)交聯(lián)作用。氧化乳清蛋白不利于發(fā)生熱誘導(dǎo)交聯(lián)，但能夠提高所生產(chǎn)膜的白度和綠度、降低黃度以及降低膜的透明性，通過(guò)修飾蛋白疏水性及所成膜的多孔性來(lái)控制膜材料的水化性能，較高pH值和溫度均能夠提高膜的透明性、降低膜的水溶解性。此外，先加熱后氧化方式處理還能夠促進(jìn)膜在不同pH下(pI除外)的浸出率，在5 mmol/L H2O2以上浸出率顯著上升。因此，可通過(guò)調(diào)節(jié)氧化程度、pH值及加熱溫度以使膜功能具有多功能性以滿足實(shí)際食品應(yīng)用體系中對(duì)膜功能性的要求。

［1］ Anker M，Stading M，Hermansson A M.Effects of pH and the gel state on the mechanical properties，moisture contents，and glass transition temperatures of whey protein films［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47(5):1 878-1 886.

［2］ Kinsella J E，Whitehead D M.Proteins in whey:chemical，physical，and functional properties［J］.Advances in Food Nutrition Research，1989，33:343-439.

［3］ Gennadios A.Protein-based films and coatings［M］.New York:CRC Press，2002:1-42.

［4］ Fairley P，Monahan F J，German J B，et al.Mechanical properties and water vapor permeability of edible films from whey protein isolate and sodium dodecyl sulfate［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1996，44(2):438-443.

［5］ Janjarasskul T，Krochta J M.Edible packaging materials［J］.Annual Review of Food Science and Technology，2010，1:415-448.

［6］ Miller K S，Chiang M T，Krochta J M.Heat curing of whey protein films［J］.Journal of Food Science，1997，62(6):1 189-1 193.

［7］ Galietta G，Gioia L D，Guilbert S，et al.Mechanical and thermomechanical properties of films based on whey proteins as affected by plasticizer and crosslinking agents［J］.Journal of Dairy Science，1998，81(12):3 123-3 130.

［8］ Yildirim M，Hettiarachchy N S.Properties of films produced by cross-linking whey proteins and 11S globulin using transglutaminase［J］.Journal of Food Science，1998，63(2):248-252.

［9］ Frgemand M，Otte J，Qvist K B.Cross-linking of whey proteins by enzymatic oxidation［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46(4):1 326-1 333.

［10］ Ustunol Z，Mert B.Water solubility，mechanical，barri-er，and thermal properties of cross-linked whey protein isolate-based films［J］.Journal of Food Science，2004，69(3):129-133.

［11］ LIU G，XIONG Y L.Oxidatively induced chemical changes and interactions of mixed myosin，b-lactoglobulin and soy 7S globulin［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2000，80(11):1 601-1 607.

［12］ LIU G，XIONG Y L，Butterfield D A.Chemical，physical，and gel-forming properties of oxidized myofibrils and whey-and soy-protein isolates［J］.Journal of Food Science，2000，65(5):811-817.

［13］ CUI X H，XIONG Y L，KONG B H，et al.Hydroxyl radical-stressed whey protein isolate:chemical and structural properties［J］.Food and Bioprocess Technology，2012，5(6):2 454-2 461.

［14］ LI C，XIONG Y L.Disruption of secondary structure by oxidative stress alters the cross-linking pattern of myosin by microbial transglutaminase［J］.Meat Science，2015，108:97-105.

［15］ Kobayashi S，Müllen K.Encyclopedia of polymeric nanomaterials［M］.Springer Berlin Heidelberg，2014:1-11.

［16］ Carpi A.Progress in molecular and environmental bioengineering-from analysis and modeling to technology applications［M］.Rijeka:In Tech，2011:117-150.

［17］ Rector D，Matsudomi N，Kinsella J E.Changes in gelling behavior of whey protein isolate and β-lactoglobulin during storage:possible mechanism(s)［J］.Journal of Food Science，1991，56(3):782-788.

［18］ Howell N K，Herman H，Li-Chan E C.Elucidation of protein-lipid interactions in lysozyme-corn oil system by fourier transform raman spectroscopy［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49(3):1 529-1 533.

［19］ WANG Y，XIONG Y L，Rentfrow G K，et al.Oxidation promotes cross-linking but impairs film-forming properties of whey proteins［J］.Journal of Food Engineering，2013，115(1):11-19.

［20］ Laemmli U.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］.Nature，1974，227(5259):680-685.

［21］ Pelegrine D H G，Gasparetto C A.Whey proteins solubility as function of temperature and pH［J］.LWT-Food Science and Technology，2005，38(1):77-80.