Thermobifida fusca葡萄糖異構(gòu)酶在枯草桿菌中的表達(dá)*

鄧輝，陳存武，孫傳伯，韋傳寶

1(皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽六安，237012)

2(六安市蛋白質(zhì)分離與純化研究中心，安徽 六安，237012)

D-木糖異構(gòu)酶(xylose isomerase XIase.EC 5.3.1.5)能可逆催化D-木糖和D-木酮糖之間的異構(gòu)轉(zhuǎn)化，也能可逆催化D-葡萄糖為D-果糖之間的異構(gòu)轉(zhuǎn)化，所以在食品工業(yè)中也被稱為葡萄糖異構(gòu)酶(GI-ase)［1］。GIase 是高果糖漿(high fructosesyrup，HFS)工業(yè)的關(guān)鍵用酶，由于高果糖漿比蔗糖更有益于健康，并有著良好的發(fā)酵性能和適宜的口感，被越來越廣泛地應(yīng)用在食品和飲料工業(yè)中。

為大幅提高GIase的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度，將GIase的基因過量表達(dá)是最有效的途徑之一。常用的基因工程宿主菌有大腸桿菌、枯草桿菌以及酵母［2］。在本實(shí)驗(yàn)室前期工作中，一種來源于嗜熱菌Thermobifida fusca的GIase基因xylA在E.coli中成功克隆表達(dá)，并進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)和轉(zhuǎn)化率的分析，以葡萄糖為底物該酶的Km和Kcat值分別為190 mmol/L和35 s-1［3］，高的催化活力、高的轉(zhuǎn)化率將使該酶成為改進(jìn)葡萄糖異構(gòu)化食品工業(yè)過程中潛力巨大的候選者。然而大腸桿菌在過量表達(dá)外源蛋白時(shí)，易形成不溶性包涵體或聚集體，同時(shí)存在著可能對(duì)人體有害的內(nèi)毒素。枯草桿菌作為一種工業(yè)中應(yīng)用廣泛的工程菌，在一些方面具有無可比擬的優(yōu)勢(shì)［4-5］:首先，枯草桿菌是國(guó)際公認(rèn)的食品安全菌株;其次，種屬間的密碼子偏好性不明顯;最后，同大腸桿菌一樣，枯草桿菌的表達(dá)機(jī)理也已被深入研究。但關(guān)于GIase在枯草桿菌中的表達(dá)還研究較少，HUANG［6］等把大腸桿菌的GI-ase基因和Bacillus licheniformis青霉素酶的啟動(dòng)子相融合，使 GIase 基因在 B.subtilis成功表達(dá)，Lee［7］等將來源于Clostridium thermosulfurogenes的GIase基因克隆到大腸桿菌和枯草桿菌的穿梭質(zhì)粒pMG1，其表達(dá)量為1.54 U/mg，高于該酶在野生菌的表達(dá)量0.29 U/mg。雖然枯草桿菌具有強(qiáng)大的蛋白分泌能力，但可能是因?yàn)镚Iase是胞內(nèi)酶，兩位研究者測(cè)定的都是胞內(nèi)酶活。在本實(shí)驗(yàn)研究中我們嘗試選用不同誘導(dǎo)方式的枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)在胞內(nèi)表達(dá)Thermobifida fusca GIase，并進(jìn)一步研究培養(yǎng)基、溫度和pH等條件對(duì)重組枯草桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1 材料與方法

1.1 菌種和質(zhì)粒

Thermobifida fusca WSH03-11菌株，克隆宿主菌:E.coli JM109，B.subtilis WB600(his-nprB-nprE18-aprE-epr-bpf-mpr)，表達(dá)質(zhì)粒 pHCMC04、pAL12 和pMA09均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。pMD18-T simple購自大連寶生物工程公司。

1.2 試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂、蛋白胨、酵母抽提物購自O(shè)xoid，工具酶、基因組DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒、DNA膠回收試劑盒均購自上海生工生物工程有限公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基，Amp終濃度100 μg/mL。TB:甘油5 g/L，蛋白胨12 g/L，酵母粉24 g/L，K2HPO416.4 g/L，KH2PO42.3 g/L。

1.4 重組質(zhì)粒pHGI、pMGI和pAGI的構(gòu)建

提取Thermobifida fusca的基因組DNA，并以此為模板PCR擴(kuò)增GIase酶基因。PCR反應(yīng)條件:94℃8 min;94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 130 s，循環(huán)30次;72℃ 10 min。PCR引物如下:

PH1(5’-3’):A/CTAGTATGAGCAACTACCAGCCCACACCCG

PH2(5’-3’):G/GATCCTTAGCGCACGCCCAGGAGGTAGT

PM1(5’-3’):CATATGAGCAACTACCAGCCCACACCCGAG

PM2(5’-3’):G/GATCCTTAGCGCACGCCCAGGAGGTAGT

PA1(5’-3’):G/GATCCATGAGCAACTACCAGCCCACACCCG

PA2(5’-3’):T/CTAGATTAGCGCACGCCCAGGAGGTAGT

引物對(duì)PH1、PH2分別含SpeI和BamH I的限制性酶切位點(diǎn)(載體不含信號(hào)肽序列)，引物對(duì) PM1、PM2分別含NdeI和BamH I的限制性酶切位點(diǎn)(去除信號(hào)肽序列 SestA)。引物對(duì) PA1、PA2分別含BamH I和XbaI的限制性酶切位點(diǎn)(去除信號(hào)肽序列SamyQ)，分別以引物對(duì)擴(kuò)增得到xylA基因片段，將其克隆、純化、回收后分別插入E coli-B.subtilis穿梭載體 pHCMC04［8］、pMA09［9］和 pAL12［10］中，其中，pHCMC04的啟動(dòng)子為PxylA，為木糖或IPTG誘導(dǎo)表達(dá);pMA09的啟動(dòng)子為PHpaII，為組成性表達(dá);pAL12啟動(dòng)子為Pdes，為低溫25℃誘導(dǎo)表達(dá)。分別構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pHGI、pMGI和pAGI。

1.5 枯草桿菌轉(zhuǎn)化及培養(yǎng)

枯草桿菌轉(zhuǎn)化參照Spizizen的方法［14］。挑取轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主B.subtilis的單克隆于LB培養(yǎng)基生長(zhǎng)9 h，按體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量將種子發(fā)酵液接入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，在37℃搖床培養(yǎng)30 h，其中重組菌WB600/pHGI在培養(yǎng)到 OD600值為 1.5時(shí)，添加 4 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，WB600/pAGI在培養(yǎng)到OD600值為1.5時(shí)，降溫到25℃誘導(dǎo)表達(dá)，因WB600/pMGI為組成性表達(dá)，所以培養(yǎng)條件不作變動(dòng)。每隔一段時(shí)間取樣，將發(fā)酵液于12 000 r/min離心2 min，除上清液收集菌體，將菌體復(fù)溶后超聲破壁12 000 r/min，4℃離心10 min，保留上清液、懸浮沉淀待用。

1.6 分析方法

DNA瓊脂糖凝膠電泳和表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE按文獻(xiàn)［11］方法進(jìn)行。GIase活性的測(cè)定其異構(gòu)轉(zhuǎn)化葡萄糖為果糖的活性。反應(yīng)體系為1 mL，包含5 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)，900 mmol/L D-葡萄糖水溶液，5 mmol/L MgSO4水溶液，0.1 mL適當(dāng)稀釋的酶液。反應(yīng)體系在70℃水浴10 min，然后用1 mL 0.5mol/L HClO4溶液終止反應(yīng)。反應(yīng)體系中的D-果糖通過半胱氨酸-咔唑方法測(cè)定［12］。1個(gè)酶活力單位(U)定義為:上述反應(yīng)條件下，1 min內(nèi)生成的1 μmol D-果糖。菌體的濃度采用分光光度法測(cè)定。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.7 重組枯草桿菌外源蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

1.7.1 不同培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)酶的影響

采用6種培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)酶，25 h后測(cè)定OD600值和酶活。

1.7.2 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

在最佳培養(yǎng)基中，分別采用25、30、37℃培養(yǎng)25 h后測(cè)定OD600值和酶活。

1.7.3 初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

在最佳培養(yǎng)基和最適溫度條件下，調(diào)節(jié)初始pH分別為 5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，25 h 后測(cè)定OD600值和酶活。

2 結(jié)果

2.1 重組菌B.subtilis WB600/pHGI、WB600/pM GI和WB600/pAGI的構(gòu)建與表達(dá)

以提取的T.fuscaWSH03-11的 xylA基因(與GenBank Accession No.CP000088序列一致)片段插入pMD18-T simple質(zhì)粒中，分別采用相應(yīng)的引物PCR擴(kuò)增目的基因，純化回收目的基因后分別與同樣酶切純化回收的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pHCMC04、pMA09和pAL12連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑取陽性克隆，提質(zhì)粒，雙酶切鑒定，顯示出2條明顯的條帶，條帶大小與預(yù)期相符，證明xylA基因已成功連接到E.coli-B.subtilis穿梭載體pHCMC04、pMA09和pAL12中，將重組質(zhì)粒分別命名為pHGI、pMGI和pAGI。將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB600，獲得重組枯草芽孢桿菌WB600/pHGI、WB600/pMGI和WB600/pAGI。通過質(zhì)粒提取和限制性酶切鑒定確認(rèn)了重組菌構(gòu)建成功。同時(shí)，以空載轉(zhuǎn)化宿主菌WB600為對(duì)照，處理方式同上。將上述重組枯草芽孢桿菌 WB600/pHGI、WB600/pMGI和 WB600/pAGI以及含空載質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌WB600/pHCMC04、WB600/pMA09和WB600/pAL12分別接入LB培養(yǎng)基中表達(dá)，間隔一定時(shí)間取樣，測(cè)定胞內(nèi)GIase的酶活。測(cè)得重組枯草芽孢桿菌WB600/pHGI、WB600/pMGI和 WB600/pAGI破壁上清液的活力分別為1.1，1.8和1.3 U/mL，而含空載的重組枯草芽孢桿菌對(duì)照菌株均檢測(cè)不到GIase活性。利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的SDS-PAGE對(duì)重組枯草桿菌破壁上清和破壁后沉淀進(jìn)行檢測(cè)，在破壁上清和破壁沉淀中均發(fā)現(xiàn)與GI酶分子量相對(duì)應(yīng)的約42 kDa處有條帶(圖1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果一方面表明構(gòu)建的3種重組質(zhì)粒在重組枯草芽孢桿菌胞內(nèi)均成功表達(dá)，且WB600/pMGI的表達(dá)量最高;另一方面表明重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶速度過快，導(dǎo)致細(xì)胞破壁沉淀中也含有目的蛋白條帶，發(fā)酵過程有待近一步優(yōu)化。

圖1 GIASE表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the expression of GIase

2.3 重組枯草桿菌外源蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

選取上述實(shí)驗(yàn)中表達(dá)量最高的重組菌株WB600(pMGI)對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，因該載體為本底水平表達(dá)，對(duì)其搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)基、溫度和初始pH進(jìn)行優(yōu)化，并考察最優(yōu)條件下?lián)u瓶中重組B.subtilis WB600(pMGI)產(chǎn)GIase的發(fā)酵過程。

2.3.1 初始培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)酶的影響

首先選擇適合重組枯草桿菌表達(dá)GIase的培養(yǎng)基，將重組菌株置于6種較典型的枯草桿菌培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定 OD600值和酶活，其他條件為:初始pH 7.5，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時(shí)間25 h。在這些培養(yǎng)基中，TB培養(yǎng)基是最利于GIase表達(dá)的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵液中菌體的濃度最高，酶活力也最高，這可能與其pH緩沖能力強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)成分豐富有關(guān)。如圖2，在TB培養(yǎng)基中，發(fā)酵25h后胞內(nèi)酶活達(dá)到3.4 U/mL。

2.3.2 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

表1為不同溫度下，菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶情況。其他條件為，TB培養(yǎng)基、初始pH 7.5和發(fā)酵時(shí)間25 h。結(jié)果表明:在30℃下酶活最高，為最適發(fā)酵溫度。

圖2 出發(fā)培養(yǎng)基對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)GIase酶活力的比較Fig.2 Effect of media on cell growth and production of GIase

表1 溫度對(duì)GIase發(fā)酵生產(chǎn)的影響Table 1 Effect of temperature on the production of GIase

2.3.3 初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

表2為不同初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響。其他條件為，TB培養(yǎng)基、發(fā)酵溫度30℃和發(fā)酵時(shí)間25 h。結(jié)果表明:控制初始pH在6.0～7.5有利于菌株產(chǎn)酶，初始pH在7.0時(shí)更有利于菌體生長(zhǎng)，在pH 7.0時(shí)酶活最高，說明中性環(huán)境有利于該菌體的生長(zhǎng)和外源基因的表達(dá)。

表2 初始pH對(duì)GIase發(fā)酵生產(chǎn)的影響Table 2 Effect of initial pH on the production of GIase

2.3.4 搖瓶中重組B.subtilis WB600(pMGI)產(chǎn)GI-ase的發(fā)酵過程

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了搖瓶中重組B.subtilis WB600(pMGI)產(chǎn)GIase的發(fā)酵過程的菌體生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線，以確定發(fā)酵終止時(shí)間。由圖3可知，重組菌約在20 h菌體濃度達(dá)到最高，產(chǎn)酶量約在24 h達(dá)到最高，所以合適的發(fā)酵終止時(shí)間為24 h。

圖3 搖瓶條件下重組B.subtilis WB600/pMGI產(chǎn)GIase的發(fā)酵過程Fig.3 Recombinant-GIase production by B.subtilis WB600/pMGI in shake flask

3 討論

本實(shí)驗(yàn)室前期已將GIase在大腸桿菌中成功表達(dá)，但是為了更好滿足食品工業(yè)的安全要求，從國(guó)際公認(rèn)的食品工業(yè)安全宿主菌(GRAS)著眼，選擇枯草桿菌這種工業(yè)上常用的工程菌嘗試表達(dá)GIase酶。研究首先將GIase基因分別克隆到表達(dá)載體pHCMC04、pMA09 和 pAL12 上，轉(zhuǎn)化B.subtilis TEB1030［13］、B.subtilis WB600 和 B subtilis WB800N(npr Eapr EeprbprmprblenprB::bsr.vprwprA:hyg cm:neo;NeoR)，僅B.subtilis WB600所獲得的基因工程重組菌能產(chǎn)GIase，而其他兩個(gè)宿主菌均不能表達(dá)目的酶，相對(duì)于 WB600敲除 6個(gè)酶基因，TEB1030敲除4個(gè)酶基因，WB800N敲除8個(gè)酶基因，可能WB600的表達(dá)系統(tǒng)更適合GIase的表達(dá)。而從GIase的產(chǎn)酶效率上看，pMA09＞pAL12＞pHCMC04。最后選擇組成型表達(dá)菌株WB600/pMGI進(jìn)一步發(fā)酵優(yōu)化，將該菌以TB為培養(yǎng)基，初始pH 7.0，30℃恒溫培養(yǎng)24 h后，測(cè)得發(fā)酵上清液酶活5.6 U/mL，為培養(yǎng)野生菌 Thermobifida fusca產(chǎn) GIase酶量的12.3倍，是已知外源GIase在枯草桿菌最高表達(dá)量的3.5倍。本研究為探索GIase在枯草桿菌中的表達(dá)和生產(chǎn)提供了重要的參考。

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