利用代謝工程構建高產乙偶姻枯草芽孢桿菌

張顯，趙曉靜，李欣，饒志明，2

1(江南大學生物工程學院，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

2(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

乙偶姻是一種重要的香料物質，又名3-羥基-2-丁酮或甲基乙酰甲醇。乙偶姻主要用于配置奶香型、肉香型、草莓香型的香精，或直接用于奶制品［1］。我國國家標準GB 2760—1986明確規(guī)定其為允許使用的食品級香料，美國食品和萃取協會(FEMA)安全號為2008［2］。乙偶姻在微生物體內的生理作用主要表現在3個方面:中和發(fā)酵過程中酸性產物對菌體的毒害作用，乙偶姻代謝產物2，3-丁二醇也被認為有這種作用［3］;儲存能量和碳源，研究證明，細胞在缺乏碳源時可以利用自身產生的乙偶姻來進行能量和物質供給［4］;由于乙偶姻和2，3-丁二醇在相互轉化的過程中需要NADH/NAD+作為輔酶，因此也認為乙偶姻和2，3-丁二醇在微生物中是調節(jié)細胞氧化還原水平的一種機制［4-5］。

乙偶姻的生產方法主要分為化學合成法、酶轉化法和微生物發(fā)酵法［6］。近年來微生物發(fā)酵法生產乙偶姻受到越來越多的關注，許多菌株可以生產乙偶姻，比如 Lactococcuslactis，Klebsiella oxytoca，Bacillus subtilis，Paenibacilluspolymyxa，Enterobacter aerogenes，Leuconostoc mesenteroides，Saccharomyces cerevisiae［7］。在這些菌株中，枯草芽孢桿菌被公認為是食品安全菌株，通常用來作為一種平臺微生物來獲得多種次級代謝產物。近年來微生物發(fā)酵法生產乙偶姻受到越來越多的關注，各國科學家相繼開展這方面的工作。目前對發(fā)酵法生產乙偶姻的研究多集中在篩選野生菌株和對發(fā)酵培養(yǎng)基或者工藝進行優(yōu)化方面，而基因工程改造菌株報道相對較少，大部分產量也較低。

本實驗室前期篩選到1株高產乙偶姻的枯草芽孢桿菌B.subtilis JNA3-10，該菌株利用葡萄糖發(fā)酵140 h左右，可以生產大約42.2 g/L的乙偶姻［8］。在枯草芽孢桿菌中，丙酮酸到乙偶姻的合成途徑包括兩個關鍵酶:alsS基因編碼的α-乙酰乳酸合成酶(α-acetolactate synthetase，ALS)和alsD基因編碼的α-乙酰乳酸脫羧酶(α-acetolacetate decearboxylase，ALDC)，它們催化丙酮酸到α-乙酰乳酸再到乙偶姻的這個過程。另外乙偶姻在bdhA基因編碼的乙偶姻還原酶/2，3-丁二醇脫氫酶(AR/BDH)催化下可以和2，3-丁二醇相互轉化。在代謝工程育種中，阻斷目標產物的降解途徑或加強目標產物前體物的代謝通量是有效提高目的產物積累量的重要手段。本課題將上述策略應用于B.subtilis JNA 3-10:在實驗室前期對bdhA基因進行分子敲除的基礎上［7］克隆了來自出發(fā)菌株的ALS和ALDC編碼基因，進一步研究了ALS和ALDC在bdhA敲除菌株(BM)中進行加強表達對乙偶姻發(fā)酵的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒與引物

在已公布的枯草芽孢桿菌全基因組序列中，我們選擇模式菌株B.subtilis 168基因序列作為參考，并以此設計實驗引物。表1為本實驗用到的菌株、質粒及設計的引物。

表1 菌株、質粒及引物Table 1 Strains，plasmids and primers used in this study

1.2 主要試劑、相關培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

DNA膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒均購自博大泰克生物工程有限公司;工具酶和廣范圍蛋白質分子量標準購自Takara公司;丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、IPTG、咪唑、抗生素、2-(N-馬啉代)乙磺酸、Brij35購自上海 Sangon公司;PCR引物由上海Sangon公司合成;乙?；?2-甲基乙酰乙酸乙酯(ethyl-2-acetoxy-2-methylacetocetate)購自sigma公司;FAD(黃素腺嘌呤二核苷酸)、TPP(焦磷酸硫胺素)、DTT(二硫蘇糖醇)均購自百靈威公司;其他生化試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

發(fā)酵種子培養(yǎng)基:采用LB培養(yǎng)基(酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，配置LB培養(yǎng)基所需蛋白胨、酵母粉購于OXOID公司)，培養(yǎng)條件為旋轉式搖床37℃，160 r/min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母膏5 g/L，玉米漿6 g/L，尿素2 g/L，葡萄糖 100～150 g/L，培養(yǎng)條件為旋轉式搖床37℃，160 r/min;相應的固體培養(yǎng)基為上述培養(yǎng)基中添加20 g/L的瓊脂粉。

發(fā)酵條件:發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵初始pH在6.4～6.8，種齡選擇10 h，接種量選擇6%。

1.3 枯草芽孢桿菌染色體的提取

細菌染色體提取方法參照細菌基因組DNA提取試劑盒相關操作說明(上海生工生物)。

1.4 PCR反應及其產物回收

PCR總反應體系為50 μL，包含1 ng的DNA模板，200 μmol/L dNTP，20μmol/L 引物和 1 μL 的ExTaq DNA聚合酶。程序設定為95℃預變性5 min;循環(huán)擴增程序為95℃變性50 s，56℃退火90 s，72℃延伸90 s(根據實際情況，時間設定為1 kb/min)，35個循環(huán);72℃延伸10 min。PCR反應產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，目的條帶經分離后用膠回收試劑盒(Takara)按照說明書上的方法回收，回收的DNA產物送上海生工生物有限公司測序。

1.5 感受態(tài)細胞的制備與轉化

大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化采用CaCl2法［9］。

枯草芽孢桿菌感受態(tài)的制備及轉化按照文獻方法進行［10］。

1.6 重組菌構建及驗證

根據GenBank中公布的來自B.subtilis 168的alsS(Gene ID:936852)和alsD(Gene ID:936857)基因序列分別設計引物(見表1)。利用PCR技術克隆來自B.subtilis JNA 3-10的alsS基因(連接pET-28a(+)用到引物P1和P2，連接pMA5用到引物P1和P3)和alsD基因(連接pET-28a(+)用到引物P4和P5，連接pMA5用到引物P4和P6)，分別將其連接到大腸桿菌表達載體pET-28a(+)和枯草芽孢桿菌表達載體pMA5上。由于alsS和alsD基因在枯草芽孢桿菌染色體上處在相鄰的位置，因此可以利用alsS的上游引物和alsD的下游引物來克隆alsSD基因片段(用到引物P1和P6)，并將alsSD連接至枯草芽孢桿菌表達載體pMA5上，構建ALS和ALDC在枯草芽孢桿菌中的共表達質粒pMA5-alsSD。將構建好的質粒轉化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)和枯草芽孢桿菌B.subtilis JNA 3-10感受態(tài)細胞，抽提質粒后進行酶切驗證。

1.7 重組菌蛋白表達及總蛋白濃度測定

大腸桿菌重組蛋白的誘導表達:將活化好的菌液接種至10 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，菌體生長進入到對數期之后加入1 mmol/L的IPTG進行誘導培養(yǎng)，誘導培養(yǎng)時間約為4～12 h。

重組蛋白表達情況分析:利用SDS-PAGE分析重組菌的全細胞蛋白［11］;總蛋白質濃度采用Brandford方法，以牛血清蛋白(BSA)作為標準［12］。

1.8 ALS及ALDC酶活檢測分析

ALS和ALDC酶活力的測定參照文獻進行［10］。

ALS單位酶活(IU)定義為:在37℃，pH 7.0的反應條件下，每分鐘合成1 μmol乙酰乳酸所用的酶量;ALDC單位酶活(IU)定義為:在30℃，pH 6.0的反應條件下，每分鐘使α-乙酰乳酸脫羧形成1 μmol乙偶姻的酶量。

1.9 組氨酸標簽蛋白的Ni-NTA純化

蛋白質純化方法參照文獻進行［13］。

1.10 發(fā)酵參數分析方法

乙偶姻和2，3-丁二醇采用氣相色譜法檢測［14］;葡萄糖采用SBA生物傳感器測定［15］;有機酸產物采用高效液相色譜法測定［16］。

2 結果與討論

2.1 枯草芽孢桿菌JNA 3-10 alsS和alsD基因的克隆及其序列分析

以B.subtilis JNA 3-10基因組DNA為模板，分別用alsS和alsD的上下游引物進行PCR擴增，分別得到大小約為1 713 bp的alsS片段及大約768 bp的alsD片段，分別連接pMD18-T載體，構建克隆載體T-alsS和T-alsD，送上海生工測序。

測序結果經GenBank BLAST比對，結果表明本實驗擴增得到的來自B.subtilis JNA 3-10的基因alsS和alsD與GenBank中公布的B.subtilis 168基因組中的alsS和alsD基因同源性分別達到99.5%和100%，其中alsS基因有8個堿基位點的差異，使得其編碼的ALS相比較模式菌株的ALS發(fā)生了5個氨基酸的變化，而alsD基因編碼的ALDC與模式菌株的ALDC氨基酸序列沒有差異。

2.2 大腸桿菌重組表達質粒pET28a-alsS和pET28a-alsD的構建

將T-alsS、T-alsD和表達載體pET-28a(+)用相應的限制性內切酶Xhol I和BamH I酶切，經膠回收、純化、連接后，重組質粒轉化E.coli BL21(DE3)。挑取在含氨芐青霉素平板上長出的轉化子，經活化后抽提質粒，并用限制性內切酶Xhol I和BamH I處理，釋放出5 369 bp長度的pET28a片段和相應長度的目的基因片段。酶切驗證如圖1，結果表明E.coli BL21/pET28a-alsS和E.coli BL21/pET28a-alsD構建成功。

圖1 pET28a-alsD與pET28a-alsS限制性酶切圖譜Fig.1 Enzyme digestion analysis of recombinant plasmids pET28a-alsS and pET28a-alsD

2.3 重組大腸桿菌的SDS-PAGE分析

將重組菌株E.coli BL21/pET28a-alsS和E.coli BL21/pET28a-alsD分別接種于LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數期，然后經IPTG誘導過夜，8 000 r/min離心10 min收集菌體，用pH 7.4的PBS緩沖液洗滌菌體2次，菌體重懸于20 mL細胞破碎緩沖液并置于冰水中，采用超聲波破碎細胞，經12 000 r/min離心30 min，得到的上清液即為粗酶液。將上述蛋白樣品經SDS-PAGE電泳，結果如圖2所示，排除載體本身可以表達大小約3 ku的His標簽，過量表達的重組菌特異性蛋白大小與預期一致，其中ALS大約為62 ku，ALDC大約為29 ku，初步確認為目的蛋白ALS與ALDC。

圖2 重組菌SDS-PAGE電泳圖片Fig.2 SDS-PAGE analysis of whole cell proteins in recombinant strains

2.4 ALS和ALDC的蛋白純化

收集經IPTG誘導后的E.coli BL21/pET28a-alsS和E.coli BL21/pET28a-alsD菌體經超聲波破碎，離心取上清液。采用Ni-NTA親和層析法對ALS和ALDC進行純化，經SDS-PAGE電泳，由圖3可以看到，純化后得到的蛋白大小與目的蛋白ALS和ALDC一致。經測定ALS粗酶液純化后比酶活可達到原來的6.8倍，而ALDC粗酶液純化倍數約為6.65，相關數據見表2。

圖3 ALS和ALDC經純化后電泳分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified ALS and ALDC

2.5 ALS和ALDC的酶學性質分析

2.5.1 pH對ALS和ALDC酶活力的影響

配制pH 3～11的反應緩沖液，分別測定不同pH環(huán)境下ALS和ALDC的活力，將最適pH條件的酶活力定義為100%，結果如圖4所示。ALS的最適pH為8.0，該酶在中性偏堿性的pH環(huán)境活力較高;圖5所示ALDC的最適pH為6.0，該酶在中性偏酸的環(huán)境活力較高，當pH大于7.0或者小于5.0時，ALDC的活力迅速下降。在自然發(fā)酵過程中，發(fā)酵培養(yǎng)基前期維持中性偏酸的環(huán)境有利于枯草芽孢桿菌的生長和底物的利用，前期發(fā)酵過程中酸性產物的生成也會使發(fā)酵培養(yǎng)基偏酸性，這個環(huán)境有利于ALDC將α-乙酰乳酸轉化到乙偶姻，但是并不利于ALS將丙酮酸轉化到α-乙酰乳酸，因此ALS的活力是限制乙偶姻高效合成的一個比較關鍵因素。

表2 重組菌目的蛋白純化過程Table 2 Purification of the over-expressed proteins

2.5.2 溫度對ALS和ALDC酶活力的影響

在25～60℃范圍內，每隔5℃設1個梯度，檢測ALS和ALDC在不同溫度條件下的酶活力的大小，將最適溫度下的酶活力定義為100%。結果如圖6所示，ALS最適溫度在50℃，低于或者高于該溫度，酶活力下降較明顯;圖7所示ALDC的最適溫度為35℃，在25℃至45℃范圍內酶活力相差不大，高于45℃酶活力下降較明顯。以上結果表明，ALS在正常發(fā)酵溫度(37℃左右)的酶活力較低，限制了丙酮酸分解代謝流向乙偶姻途徑的分配，而ALDC則在發(fā)酵溫度下保持了較高的酶活力。

圖4 pH對ALS酶活力的影響Fig.4 Effect of pH on enzyme activity of ALS

圖5 pH對ALDC酶活力的影響Fig.5 Effect of pH on enzyme activity of ALDC

圖6 溫度對ALS酶活力的影響Fig.6 Effect of temperature on enzyme activity of ALS

圖7 溫度對ALDC酶活力的影響Fig.7 Effect of temperature on enzyme activity of ALDC

2.5.3 pH對ALS和ALDC酶活力穩(wěn)定性的影響

根據酶最適的反應pH范圍，將純化后的酶保存在不同pH的緩沖液中，冰上放置10 h，每隔2 h取樣并在酶的最適溫度和最適pH條件下測定酶活力。圖8和9分別表示了ALS和ALDC在不同pH條件下的穩(wěn)定性情況。結果表明，ALS在pH 7.0和pH 8.0的時候較穩(wěn)定，10 h后仍有90%左右的活力，而在偏酸性環(huán)境下(pH 6.0)穩(wěn)定性較差，不利于乙偶姻發(fā)酵，因此增強ALS的表達對乙偶姻的發(fā)酵有重要意義;ALDC在pH為6.0的條件下較穩(wěn)定，較高或較低的pH都會導致酶活力較大的損失，當其在pH為8.0的緩沖液中保存4 h后完全失活。由于發(fā)酵后期乙偶姻的合成使得發(fā)酵液pH上升，呈現偏堿性的pH，因此當發(fā)酵后期乙偶姻產量積累到一定程度，發(fā)酵液pH發(fā)生上升時會反過來促使ALDC發(fā)生降解，阻止乙偶姻的合成，使發(fā)酵液pH維持在一個中性范圍，此時ALDC對維持發(fā)酵液pH起了一種調節(jié)作用。

圖8 pH對ALS酶活力穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of pH on enzyme stability of ALS

圖9 pH對ALDC酶活力穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of pH on enzyme stability of ALDC

2.5.4 溫度對ALS和ALDC酶活力穩(wěn)定性的影響

選擇常用的酶保藏所需的溫度和酶促反應所需的溫度，將純化后的酶保存液在不同的溫度下放置10 h，每隔2 h取樣并在酶的最適溫度和pH條件下檢測酶的活力。圖10和圖11分別表示了ALS和ALDC在不同溫度條件下的穩(wěn)定性。可以看出ALS在0℃和-20℃時放置10 h酶活力基本保持不變，而在其最適反應溫度50℃放置10 h后完全失活，表明該酶在最適反應溫度下并不穩(wěn)定，當ALS在發(fā)酵溫度37℃保存10 h后，酶活力僅剩余20%左右，表明該酶不穩(wěn)定，容易變性或降解;ALDC在0℃和-20℃時放置10 h酶活力同樣基本保持不變，隨著溫度的升高，酶的穩(wěn)定性逐漸下降，而在其最適反應溫度35℃時放置10 h，酶活力僅為初始酶活力的50%左右。以上結果表明ALS和ALDC在發(fā)酵溫度附近穩(wěn)定性較差，因此在細胞內加強它們的表達會有利于乙偶姻的合成，又由于ALS穩(wěn)定性相比ALDC更差，加強ALS的表達可能更為重要。

圖10 溫度對ALS酶活力穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effect of temperature on enzyme stability of ALS

圖11 溫度對ALDC酶活力穩(wěn)定性的影響Fig.11 Effect of temperature on enzyme stability of ALDC

2.5.5 金屬離子及EDTA對ALS和ALDC酶活力的影響

以不加金屬離子的反應體系為對照，分別在反應體系中加入終濃度為1 mmol/L的Ca2+、Sn2+、Ni2+、Zn2+、Li+、Mn2+、K+、Na+、Mg2+、Cu2+、Fe3+等離子以及EDTA，研究各金屬離子及EDTA對ALS和ALDC活力的影響。研究發(fā)現大多數金屬離子及EDTA對ALS都有較大抑制作用，而K+和Li+對其無明顯抑制作用(圖12);對于ALDC而言，EDTA和大部分金屬離子對其均有輕微的抑制作用，K+和Ni2+對其有輕微的促進作用(圖13)。

2.6 增強表達ALS和ALDC對枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產乙偶姻的影響

2.6.1 重組表達質粒pMA5-alsS、pMA5-alsD和pMA5-alsSD的構建

圖12 金屬離子及EDTA對ALS活力的影響Fig.12 Effect of mental ions and EDTA on enzyme activity of ALS

圖13 金屬離子及EDTA對ALDC活力的影響Fig.13 Effect of mental ions and EDTA on enzyme activity of ALDC

分別將克隆得到alsS、alsD以及alsSD基因和枯草芽孢桿菌表達載體pMA5用相應的限制性內切酶BamH I和Mlu I酶切，經膠回收、純化、連接，轉化克隆宿主E.coli JM109。挑取在氨芐抗生素平板上長出的轉化子，經活化后抽提質粒，并用相應的限制性內切酶處理重組質粒，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示釋放出約7 107 bp的pMA5片段和相應長度的目的基因片段。結果表明 pMA5-alsS、pMA5-alsD和 pMA5-alsSD構建成功。

2.6.2 重組枯草芽孢桿菌BMS、BMD和BMSD的構建及發(fā)酵分析

將構建好的重組表達質粒 pMA5-alsS、pMA5-alsD和pMA5-alsSD轉化枯草芽孢桿菌BM，獲得重組菌BMS、BMD以及BMSD。對3株重組菌及原始菌進行了5+L罐發(fā)酵比較，如圖14和表3。結果表明:(A)在菌株BM中分別過量表達ALS、ALDC使得ALS和ALDC的酶活力提高幅度在30倍左右，而同時過量表達這兩個酶使得它們的酶活力提高幅度都在25倍左右;(B)在菌株BM中分別過量表達ALS和ALDC，發(fā)酵結果并不理想，說明單獨加強丙酮酸到乙偶姻代謝途徑中其中一個酶的表達水平并不能有效增強該途徑代謝流;另外，根據發(fā)酵過程曲線我們還發(fā)現過量表達ALS或ALDC抑制了發(fā)酵前期菌體的生長，最終導致重組菌的乙偶姻發(fā)酵水平提高不明顯。重組菌乙偶姻產量分別提高了5.2%和4.1%(BMS產量為50.8 g/L，BMD產量為50.3 g/L);(C)同時過量表達ALS和ALDC對乙偶姻發(fā)酵過程有較好的促進作用，但是由于發(fā)酵前期菌體生長也同樣受到了一定的抑制，乙偶姻產量提高約10.8%，達到53.5 g/L;(D)增強丙酮酸到乙偶姻的合成途徑會競爭性的削弱其它以丙酮酸為前體的副產物代謝流，表3結果顯示，乙偶姻發(fā)酵過程中的一些副產物如乙酸、乳酸、乙醇等的產量都有一定程度的下降。

圖14 菌株BM、BMS、BMD、BMSD的發(fā)酵過程曲線Fig.14 Fermentation curves of strain BM，BMS，BMD and BMSD

表3 菌株BM、BMS、BMD、BMSD的發(fā)酵特征比較Table 3 Comparison of fermentation characterizations of strains BM，BMS，BMD and BMSD

研究表明，只有當胞內的丙酮酸濃度達到一定水平［17-18］，伴隨著 ALS 活力較明顯的升高［19］，細胞才會開始大量合成乙偶姻，這可能是因為乙偶姻具有中和胞內酸性產物維持細胞內部pH的作用［20］，因為當丙酮酸過量積累時，細胞內的乳酸、乙酸等也會開始積累，使得發(fā)酵液pH下降。但是當過量表達ALS和ALDC的時候，細胞在發(fā)酵前期主要是進行蛋白質的合成，其生長速率受到了一定程度的影響，不利于菌體對葡萄糖的利用。

3 結論

本實驗克隆了來自B.subtilis JNA 3-10中的alsS和alsD基因，并與GeneBank中公布的B.subtilis 168基因組中的alsS和alsD基因進行序列比較，發(fā)現其相似度分別達到99.5%和100%。成功將B.subtilis JNA 3-10中alsS和alsD基因編碼的ALS和ALDC分別在大腸桿菌BL21中進行過量表達，隨后對ALS和ALDC進行了初步的純化。對ALS和ALDC酶學性質進行初步分析發(fā)現:ALS和ALDC的最適反應pH分別為pH 8.0和pH 6.0;ALS在pH 7.0和pH 8.0的時候較穩(wěn)定，ALDC在pH為6.0的條件下較穩(wěn)定，升高或降低pH都會導致ALDC酶活力較大的損失;兩個酶的最適反應溫度分別為50℃和35℃，在0℃和-20℃時保存都較穩(wěn)定，而在它們的最適反應溫度下，兩個酶的熱穩(wěn)定性都較差;大部分金屬離子或EDTA對ALS都有一定的抑制作用，而K+和Ni2+對ALDC酶活力有輕微的促進作用。為了進一步提高目標產物乙偶姻的產量，提出了在菌株BM中分別加強表達ALS或ALDC或者同時加強表達這兩個酶的策略，結果發(fā)現:過量表達的蛋白會對發(fā)酵前期菌體生長造成抑制;單獨表達ALS或者ALDC，乙偶姻發(fā)酵產量分別提高5.2%和4.1%(BMS為50.8 g/L，BMD為50.3 g/L);而同時過量表達ALS和ALDC，乙偶姻產量提高10.8%左右(53.5 g/L)。本研究表明，加強乙偶姻合成途徑關鍵酶的表達，會增強乙偶姻合成代謝流，并且會在一定程度上削弱相關副產物的積累。

［1］ 韓麗，趙祥穎，劉建軍.乙偶姻的性質、生產及應用［J］.山東輕工學院學報，2007，21(4):80-83.

［2］ 張小舟，曾崇余，任曉乾.乙偶姻合成研究現狀及展望［J］.江蘇化工，2001，23(4):29-31.

［3］ Speck E L，Freese E.Control of metabolite secretion in Bacillus subtilis［J］.J Gen Microbiol，1973，78(2):261-275.

［4］ Johansen L，Bryn K，Stormer F C.Physiological and biochemical role of the butanediol pathway in Aerobacter(En-terobacter)aerogenes［J］.J Bacteriol，1975，123(3):1 124-1 130.

［5］ JI Xiao-jun，HUANG He，OUYANG P K.Microbial 2，3-butanediol production:A state-of-the-art review［J］.Biotechnology Advances，2011，29(3):351-364.

［6］ 韓麗，趙祥穎，劉建軍.3-羥基丁酮的研究現狀［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(10):116-118.

［7］ ZHANG Xian，ZHANG Rong-zhen，BAO Teng，et al.The rebalanced pathway significantly enhances acetoin production by disruption of acetoin reductase gene and moderateexpression of a new water-forming NADH oxidase in Bacillus subtilis［J］.Metabolic Engineering，2014，23:34-41.

［8］ ZHANG Xian，YANG Tao-wei，LIN Qin，et al.Isolation and identification of an acetoin high production bacterium that can reverse transform 2，3-butanediol to acetoin at the decline phase of fermentation［J］.World Journal of Microbiology ＆ Biotechnology，2011，27(12):2 785-2 790.

［9］ Sambrook J，Russell D W.Molecular cloning:a laboratory manual［M］.Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001.

［10］ ZHANG Xian，ZHANG Rong-zhen，BAO Teng，et al.Moderate expression of the transcriptional regulator ALsR enhances acetoin production by Bacillus subtilis［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2013，40(9):1 067-1 076.

［11］ Laemmli U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］.Nature，1970，227(5 259):680-685.

［12］ Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72:248-254.

［13］ ZHANG Xian，BAO Teng，RAO Zhi-ming，et al.Two-stage pH control strategy based on the pH preference of acetoin reductase regulates acetoin and 2，3-butanediol distribution in Bacillus subtilis［J］.PLoS One，2014，9(3):e91187.

［14］ ZHANG Xian，ZHANG Rong-zhen，YANG Tao-wei，et al.Mutation breeding of acetoin high producing Bacillus subtilis blocked in 2，3-butanediol dehydrogenase［J］.World J Microbiol Biotechnol，2013，29:1 783-1 789.

［15］ YANG Tao-wei，RAO Zhi-ming，ZHANG Xian，et al.Production of 2，3-butanediol from glucose by GRAS microorganism Bacillus amyloliquefaciens［J］.Journal of Basic Microbiology，2011，51(6):650-658.

［16］ YANG Tao-wei，RAO Zhi-ming，ZHANG Xian，et al.Fermentation of biodiesel-derived glycerol by Bacillus amyloliquefaciens:effects of co-substrates on 2，3-butanediol production［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2013，97(17):7 651-7 658.

［17］ XIAO Zi-jun，LIU P H，QIN Jia-yang，et al.Statistical optimization of medium components for enhanced acetoin production from molasses and soybean meal hydrolysate［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2007，74(1):61-68.

［18］ Starrenburg M J，Hugenholtz J.Citrate Fermentation by Lactococcus and Leuconostoc spp.［J］.Appl Environ Microbiol，1991，57(12):3 535-3 540.

［19］ Martin M G，Magni C，de Mendoza D，et al.CitI，a transcription factor involved in regulation of citrate metabolism in lactic acid bacteria［J］.J Bacteriol，2005，187(15):5 146-5 155.

［20］ XIAO Zi-jun，XU Ping.Acetoin metabolism in bacteria［J］.Critical Reviews in Microbiology，2007，33(2):127-140.