全細(xì)胞催化合成L-苯基乳酸重組大腸桿菌的構(gòu)建*

王穎，范銘，薛素妹，錢(qián)凱，齊斌，朱益波

1(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春，130118)

2(常熟理工學(xué)院生物與食品學(xué)院，蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，江蘇常熟，215500)

苯基乳酸(phenyllactic acid，PLA)，即2-羥基-3-苯基丙酸，是一種應(yīng)用廣泛的手性化合物［1-3］。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)PLA對(duì)大多數(shù)食源性致病細(xì)菌和真菌具有廣譜而高效的抗菌活性［4-7］，引起食品行業(yè)普遍關(guān)注。PLA作為乳酸菌苯丙氨酸的代謝產(chǎn)物，對(duì)人體和動(dòng)物細(xì)胞均無(wú)毒性［8-10］，是一種天然生物防腐劑。此外，它還具有溶解性好和熱穩(wěn)定性高、有效pH范圍寬、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，有利于其未來(lái)在食品工業(yè)的普遍應(yīng)用［11-14］。

L-苯基乳酸(L-phenyllactic acid，L-PLA)作為PLA兩種手性對(duì)映異構(gòu)體［15］中的一種，具有特殊的生物活性，可以作為手性中間體廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、農(nóng)藥和生物合成等領(lǐng)域［16］。采用聚苯基乳酸替代礦物類(lèi)工程塑料有助于減少礦物能源消耗和溫室氣體排放［17］。目前微生物轉(zhuǎn)化合成D-PLA和L/DPLA消旋體［18-20］的研究較多，攜帶 Lactobacillus plantarum subsp.plantarum基因D-ldhY52V突變體的重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhD由于關(guān)鍵位點(diǎn)基因突變導(dǎo)致重組菌轉(zhuǎn)化能力明顯提高至77%摩爾轉(zhuǎn)化率［21］。ZHENG［22］報(bào)道用凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans SDM)全細(xì)胞生產(chǎn)苯基乳酸產(chǎn)量高達(dá)37.3 g/L，轉(zhuǎn)化率為70%。Leuconostoc mesenteroides ATCC 8293［23］生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成D-PLA最大值35 mmol/L，轉(zhuǎn)化率高達(dá)75.2% ～83.3%。但目前報(bào)道D-PLA合成的文獻(xiàn)較多，關(guān)于L-PLA合成的報(bào)道較少，且產(chǎn)量和光學(xué)純度仍不理想。采用高效便捷的方法合成高光學(xué)純度是L-PLA大量投入應(yīng)用的前提。而生物催化因其高效和高度的立體選擇性，成為手性合成最重要的方法之一。

乳酸脫氫酶是微生物合成PLA的一種關(guān)鍵酶，但由于微生物細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，限制苯基乳酸合成［24］。因此，利用基因工程手段獲得高效過(guò)表達(dá)乳酸脫氫酶的重組菌是提高苯基乳酸產(chǎn)量的有效途徑。本研究構(gòu)建了1株能夠高效表達(dá)L-乳酸脫氫酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL，此重組菌具有較高的還原苯丙酮酸(phenylpyruvic acid，PPA)生產(chǎn)L-PLA能力，可為進(jìn)一步提高微生物合成PLA的產(chǎn)率、光學(xué)純度和底物轉(zhuǎn)化率提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

L-苯基乳酸、D-苯基乳酸和苯丙酮酸鈉，國(guó)藥集團(tuán);酵母提取物和胰蛋白胨，英國(guó)Oxoid公司;IPTG、DNA 聚合酶、DNA Marker、NADH(BBI)、X-Gal、硫酸卡那霉素、相關(guān)分子試劑盒、引物合成和DNA測(cè)序，上海生物工程公司;T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶，大連寶生物公司(TaKaRa);B-PER細(xì)菌總蛋白提取試劑，德國(guó)Thermo公司;所有實(shí)驗(yàn)試劑如果無(wú)特殊說(shuō)明均為分析純。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

pMD19-T Simple Vector大連寶生物公司(TaKa-Ra);E.coli JM109，E.coli BL21(DE3)，pET-28a(+)均為實(shí)驗(yàn)室保藏。

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基:酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L。根據(jù)需要，在培養(yǎng)基中添加50 μg/mL的硫酸卡那霉素。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀、水平電泳系統(tǒng)、垂直電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、微孔板分光光度計(jì)，美國(guó) Bio-RAD公司;高速臺(tái)式離心機(jī)，德國(guó)Thermo公司;恒溫金屬浴，德國(guó) Eppendorf公司;高效液相色譜儀，日本島津公司;恒溫振蕩培養(yǎng)箱，太倉(cāng)市華美生化儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分子克隆

基因組DNA的提取純化、質(zhì)粒DNA的提取純化、DNA酶切、連接和轉(zhuǎn)化、感受態(tài)細(xì)胞制備均參照文獻(xiàn)［25］。根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)中心(National Center ofBiotechndogy Information，NCBI)中 已 知 的B.megaterium WSH-002 L-乳酸脫氫酶基因(1dhL)序列設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物:5’-GCGCCCATATGATGAAAACACAATTTAC-3’;下游引物:5’-CCGGGATCCTTACACAAAAGCTCTG-3’。為了便于克隆與連接，上游引物5’設(shè)計(jì)了Nde I酶切位點(diǎn)，下游引物5’設(shè)計(jì)了BamH I酶切位點(diǎn)。

以巨大芽孢桿菌 B.megaterium Z2013513(CCTCC:M2013244)基因組為模板，對(duì)ldhL基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50 μL):10×PCR Buffer 5 μL，上下游引物(10 pmol)各2 μL，Mg2+(25 mmol/L)3 μL，dNTP 1 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)1 μL，基因組模板 2 μL，滅菌超純水 36 μL。PCR 擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸90 s，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后72℃終延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將膠回收的目的基因片段亞克隆到pMD19-T簡(jiǎn)易載體，用T4DNA連接酶16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coli JM109中，根據(jù)藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆。通過(guò)雙酶切鑒定后，獲得陽(yáng)性克隆子E.coli JM109/pMD19-T-ldhL，送往上海生工進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-ldhL的構(gòu)建

將克隆載體pMD19-T-ldhL經(jīng)Nde I和BamH I雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳膠回收，獲得目的基因ldhL，連接至經(jīng)Nde I和BamH I雙酶切的表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)，轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)質(zhì)粒酶切和菌落PCR驗(yàn)證，獲得重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-28a-ldhL。

1.3.3 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取 E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL、E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)和 E.coli BL21(DE3)單菌落分別接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50 μg/mL)，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。按1%的接種量(體積分?jǐn)?shù))轉(zhuǎn)接入100 mL LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)中，37℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600值為0.4～1.0，添加IPTG至終濃度為1 mmol/L，于25℃，200 r/min誘導(dǎo)表達(dá)6 h。取誘導(dǎo)后菌液，8 000 r/min、4℃離心5 min，菌泥經(jīng)超純水洗滌2遍后稀釋至OD600值為1，取1 mL稀釋液離心收集菌體，加入100 μL超純水和30 μL 5×上樣緩沖液，充分混勻后沸水浴加熱5 min，12 000 r/min、4 ℃ 離心 5 min，取10 μL上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。以12%的凝膠作分離膠，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R250染色。經(jīng)脫色液脫色后凝膠成像分析重組蛋白表達(dá)情況。

1.3.4 乳酸脫氫酶酶活力測(cè)定

誘導(dǎo)活化后的菌株E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)/pET-28a和E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL經(jīng)離心洗滌后稀釋至OD600值為1，取1 mL稀釋液離心收集菌體，加入500 μL B-PER試劑，充分混勻后30℃渦旋裂解10 min，12 000 r/min、4℃離心5 min，取適量上清液進(jìn)行乳酸脫氫酶酶活測(cè)定。

乳酸脫氫酶活性測(cè)定參照文獻(xiàn)［26］并做適當(dāng)修改，基本原理是鑒于NADH在340 nm處有最大吸收峰，通過(guò)光吸收峰值的改變定量測(cè)定酶的含量。酶活測(cè)定溫度 30℃，3 mL的反應(yīng)體系:pH 7.0，100 mmol/L磷酸鈉緩沖液，含10 mmol/L苯丙酮酸鈉，0.4 mmol/L NADH和適量粗酶液。在30℃、pH 7.0條件下，每分鐘消耗1 μmol/L NADH所需的酶量為1個(gè)酶活單位(U/mL)。比酶活定義為:1 mg酶蛋白所含的酶活單位(U/mg)。蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法:Bradford法［27］，以不同濃度的牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 重組大腸桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化PPA合成L-PLA

菌體活化:從固體培養(yǎng)基上挑取E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL單菌落接種至裝有10 mL新鮮LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)的100 mL三角瓶中培養(yǎng)，37℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。

重組菌誘導(dǎo)及L-PLA合成:將活化好的重組菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL按1%(體積比)的接種量接種至裝有100 mL新鮮LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)的500 mL三角瓶中，200 r/min、37℃培養(yǎng)至 OD600值為 1.2，加入誘導(dǎo)劑 IPTG至 0.2 mmol/L，25℃誘導(dǎo)6 h后，4℃、6 000 r/min離心5 min收集菌體。菌體用pH為7.0的磷酸鈉緩沖液洗滌2次，重懸于10 mL磷酸鈉緩沖液中，反應(yīng)60 min后取500 μL轉(zhuǎn)化液經(jīng)10 000 r/min，4℃離心5 min，上清進(jìn)行HPLC檢測(cè)產(chǎn)物L(fēng)-PLA和底物PPA物質(zhì)的量濃度，菌泥進(jìn)行OD600值檢測(cè)。

1.3.6 高效液相色譜分析方法

將轉(zhuǎn)化液離心，取上清液與流動(dòng)相混合均勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后采用HPLC檢測(cè)L-PLA物質(zhì)的量和光學(xué)純度。PPA和L-PLA定量檢測(cè)條件:色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H;流動(dòng)相為5 mmol/L稀硫酸;流速0.6 mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣體積5 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。L-PLA光學(xué)純度檢測(cè)條件為:手性柱OJ-RH，流動(dòng)相:V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(三氟乙酸)∶V(去離子水)=50∶50∶1.5∶900，流速 0.3 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量5 μL。

1.3.7 PPA摩爾轉(zhuǎn)化率計(jì)算［公式(1)］

2 結(jié)果與分析

2.1 ldhL基因克隆及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以B.megaterium Z2013513基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段大小約1.0 kb，(如圖1A)，片段大小與預(yù)期相符。將PCR產(chǎn)物連接至克隆質(zhì)粒pMD19-T簡(jiǎn)易載體，經(jīng)測(cè)序分析，ldhL基因長(zhǎng)度為957 bp，表明已擴(kuò)增到ldhL基因。重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-ldh L圖譜如圖2所示。重組克隆質(zhì)粒pMD19-T-ldh L和重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-ldh L經(jīng)Nde I和BamH I雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果分別如圖1B和圖3A，表明克隆質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒均構(gòu)建成功。E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldh L菌落PCR電泳圖如3B，表明重組大腸桿菌能成功克隆并轉(zhuǎn)錄ldh L基因。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖(A);重組克隆質(zhì)粒pMD19-T-ldhL(B)的酶切鑒定Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification(A);Restrication analysis of recombinant cloning plasmid pMD19-T-ldhL(B)

圖2 pET-28a-ldhL質(zhì)粒圖譜Fig.2 Map of recombinant plasmid pET-28a-ldhL

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-ldhL的酶切鑒定(A);菌落PCR鑒定(B)電泳圖Fig.3 Restrication analysis of recombinant cloning plasmid pET-28a-ldhL(A);Electrophoresis of clone PCR verification(B)

2.2 ldhL基因的誘導(dǎo)表達(dá)及酶活測(cè)定

對(duì)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL、E.coli BL21(DE3)/pET-28a 和原始菌株E.coli BL21(DE3)進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖4所示。與對(duì)照菌株相比，E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL在約40 ku處有明顯條帶，除去質(zhì)粒上融合表達(dá)的融合標(biāo)簽，與預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白大小一致，表明巨大芽孢桿菌ldhL在大腸桿菌中成功表達(dá)。

圖4 SDS-PAGE分析重組大腸桿菌L-乳酸脫氫酶蛋白表達(dá)Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant L-lactate dehydrogenase expression in E.coli

對(duì)E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL粗酶液酶活和蛋白表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，未檢測(cè)出對(duì)照菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a和 E.coli BL21(DE3)對(duì) PPA的酶活，重組菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL對(duì)PPA的比酶活為3.4 U/mg，說(shuō)明重組ldhL在大腸桿菌中成功表達(dá)且對(duì)PPA顯示出催化活力。

2.3 重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化PPA合成L-PLA

全細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)表明E.coli BL21(DE3)/pET-28aldhL對(duì)PPA具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)化能力。在37℃、200 r/min條件下轉(zhuǎn)化60 min，70.32 mmol/L PPA經(jīng)25 g/L(干重)重組大腸桿菌將全細(xì)胞轉(zhuǎn)化還原為50.59 mmol/L LPLA，底物摩爾轉(zhuǎn)化率為71.94%。HPLC檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5:此轉(zhuǎn)化體系不對(duì)稱還原PPA合成的L-PLA具有較高的光學(xué)純度(96.98%e.e.)，以上結(jié)果表明此一步生物轉(zhuǎn)化體系能高效地不對(duì)稱合成L-PLA。

圖5 HPLC分析重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-PLAFig.5 HPLC analysis of L-PLA production by whole cells of recombinant E.coli

3 結(jié)論

Rubrivivax benzoatilyticus JA2［28］可將 1 mmol/L L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為 0.92 mmol/L L-PLA。1996年，Hashimoto［29］等從土壤中篩選1株假單胞菌(Pseudomonas sp.)，能將2-羥基3-苯基丙腈(3-phenyllactonitrile)轉(zhuǎn)化為e.e.值為75%的L-PLA。本研究通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)L-乳酸脫氫酶的重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ldhL，采用全細(xì)胞一步生物轉(zhuǎn)化法，將PPA高效不對(duì)稱還原成高光學(xué)純度L-PLA，為進(jìn)一步提高微生物合成L-PLA的產(chǎn)率、光學(xué)純度和底物轉(zhuǎn)化率提供依據(jù)。

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