不同熔點乳脂模擬物對濃縮乳蛋白噴霧干燥粉理化性質的影響*

張洪超，胡錦華，郭宏慧，周鵬

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室食品學院，江蘇無錫，214122)

乳脂質是牛乳中的主要成分之一，其含量隨著乳牛的品種及其他條件而異，平均含量在3.5% ～4.5%。乳脂質是組成和結構較為復雜的脂質之一，它的主要成分是甘油三酯，此外還包括少量的極性脂和游離脂肪酸等。除了可以提供能量外，乳脂質對乳制品的風味起著重要的作用［1］。為了運輸的便利及延長產品貨架期，工業(yè)上通常利用干燥技術將液態(tài)奶轉化為乳粉，其中噴霧干燥技術則是目前常用的方法之一［2］。在乳粉干燥過程中通常伴隨著組分(蛋白質、脂肪和乳糖等)的遷移，其中脂肪遷移到乳粉表面是較為普遍的一種現象［3］。乳粉表面的脂肪對乳粉的潤濕性、流動性、結塊性以及氧化穩(wěn)定性等物理化學性質具有一定的影響［3-7］。

根據脂肪在乳粉中的分布位置，可以將乳脂肪分為表面脂肪、內部游離脂肪和被包埋的脂肪［8］三大類。目前研究較多的是乳粉表面脂肪對乳粉性質的影響，主要包括研究不同脂量含量的乳粉(如全脂、脫脂乳粉)在制備過程中產生的表面脂肪含量的差異［3，6，8］，還有研究乳粉在儲藏期內脂肪遷移到表面的規(guī)律［9-11］;此外，關于內部游離脂肪對乳粉的理化性質(除潤濕性外)的影響也有報道［12］。F?ldt在利用酪蛋白酸鈉/乳糖混合物包埋不同熔點的油脂時發(fā)現，添加的油脂不同，噴霧干燥后的乳粉表面含脂量也不同［10］。Kim在研究儲藏期內全脂乳粉表面組分的變化時發(fā)現，乳粉表面脂肪的脂肪酸組成，在不同的儲藏階段存在差異，并由此推測不同熔點的脂肪在乳粉中的遷移規(guī)律不同［9］。由于組成乳脂質的甘油三酯中含有多種脂肪酸，因此乳脂質的熔點范圍較為寬泛。與此相對應，尋找合適的乳脂模擬物(組分單一、熔點確定且可直接分析)近似模擬乳脂不同組分的遷移分布規(guī)律對于研究乳脂在乳粉生產和儲藏過程中的穩(wěn)定性具有重要的指導意義。

MPC是一種通過膜過濾技術得到的乳粉配料。MPC中酪蛋白與乳清蛋白的比例與脫脂奶十分接近，它具有的高蛋白、低乳糖的特點也使其在乳品工業(yè)上得到了廣泛的應用［13］。但是MPC的溶解度較差，因此對其溶解度方面的研究是當今研究的熱點之一［14-16］。本實驗選用MPC為研究對象，通過添加特定的單一組分的脂肪酸甲酯，討論了不同熔點的乳脂模擬物在噴霧干燥后在濃縮乳蛋白粉表面的分布狀況，同時研究了不同甲酯的添加對加脂乳粉的微觀結構及蛋白質溶解行為的影響。本研究將為研究開發(fā)高新型蛋白功能乳粉提供重要的應用支持［17］，同時也為乳蛋白在功能脂質包埋領域中的應用提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MPC485(主要組分為蛋白質 80.51%、脂肪1.42%、乳糖5.49%、水分5.74%)，新西蘭恒天然集團;月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、棕櫚酸甲酯、十九烷酸甲酯(純度均≥97%)、乙酰氯、甲苯(色譜純)，上海晶純生化科技股份有限公司;Supelco37種脂肪酸甲酯混標(CRM47885)，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;丙烯酰胺、亞甲基丙烯酰胺、SDS、甘油、考馬斯亮藍G250、考馬斯亮藍R250、溴酚藍、β-巰基乙醇，上海生工生物工程技術服務有限公司;正己烷、異丙醇、甲醇，國藥集團化學試劑有限公司，分析純。

1.2 儀器與設備

Ultra Turrax T18高速分散機，IKA RO10高效多點磁力攪拌器，Vortex Genius 3漩渦振蕩器，德國IKA公司;AH-2010超高壓納米均質機，加拿大 ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司;步琪B-290噴霧干燥儀，瑞士步琪公司;EL204電子天平，C20庫侖法卡爾費休水分儀，瑞士梅特勒-托利多國際股份有限公司;S3500型激光粒徑儀，美國 Microtrac公司;TM3030臺式掃描電子顯微鏡，日本日立公司;GC-2014氣相色譜儀(配備FID檢測器)，UV-2700紫外可見分光光度計，日本島津公司;SOTAX CE7 smart溶出儀，瑞士SOTAX公司;Heraeus Multifuge X1R臺式高速冷凍離心機，賽默飛世爾科技(中國)有限公司;PQ001-Analyst核磁共振分析儀，上海紐邁電子科技股份有限公司;Mini-PROTEIN Tetra Cell電泳儀，美國 Bio-rad公司;電熱恒溫振蕩水槽，上海一恒科學儀器有限公司;純水系統(tǒng)，力新儀器(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的生產工藝

根據超濾液總固形物含量與最終MPC中蛋白質含量的關系表［17］，本實驗中乳液固形物含量固定為15%。此外，實驗中設計的甲酯與MPC485的質量比為1∶6，制備對照組MPC的乳液中用超純水代替脂肪酸甲酯。樣品的制備流程見圖1。

圖1 樣品的制備流程圖Fig.1 Powder preparation procedure

1.3.2 樣品基本指標測定

1.3.2.1 水分含量測定

準確取1 g樣品與40 mL甲醇于三角瓶中，磁力攪拌24 h后靜置，吸取1 mL上清液稱重并注入水分儀，同時以甲醇為對照，計算干粉中水分含量，每個樣品平行測定3次。

1.3.2.2 粒徑測定［18］

樣品粒徑利用Microtrac S3500型激光粒徑儀測定，此儀器配備干法分散裝置，進樣量0.1 g，方法設置選擇“Bluewave”，顆粒形狀設置為“irregular”，折光系數為1.59。

1.3.3 樣品中脂肪酸組成及脂肪含量測定

1.3.3.1 MPC485中脂肪酸組成測定

MPC485中脂肪酸組成參照 GB 5413.27-2010中第一法“乙酰氯-甲醇甲酯法”［19］測定。

1.3.3.2 樣品總脂肪與表面脂肪含量測定

實驗中脂肪含量測定選用氣相色譜內標標準曲線法，選用濃度為2 mg/mL的十九烷酸甲酯為內標。首先分別以3種脂肪酸甲酯為標品，以標品和內標的峰面積比Ai/As為橫坐標，質量比Mi/Ms為縱坐標作標準曲線。

樣品中總脂肪含量測定參考Kim［9］的方法設計如下:準確稱取1 g干粉并加入50℃的超純水4 mL，振蕩混勻，向上述溶液中加入45 mL正己烷/異丙醇(體積比=3∶1)的混合溶劑(其中含有2 mL內標)，室溫下混合15 min后于20℃下離心15 min，轉速為1 000 g，收集上層有機相;將下層水相中殘余脂質按同樣方法再提取一次(此次加入的45 mL混合溶劑中不含內標)，合并2次得到的有機相。吸取2 mL有機相并用0.45 μm有機濾膜過濾，之后用氣相色譜法測定。測得的脂肪含量以甲酯質量與干粉質量的比值(g/100g)表示。

干粉表面脂肪含量測定采用Soottitantawat［20］的方法。準確稱取1 g干粉，加入含有2 mL內標的正己烷20 mL，將溶液于漩渦振蕩器上混合30 s后過濾，取2 mL過濾液再經0.45 μm有機濾膜過濾，氣相色譜法測定。表面脂含量的表示方法同樣以甲酯質量與干粉質量的比值(g/100g)表示。

實驗用氣相色譜條件:色譜柱為DB-Wax，30 m×0.25 mm，0.25 μm;進口溫度與檢測器溫度均為250℃;柱箱溫度采用程序升溫法:初始溫度為50℃，保持1 min，以20℃/min升溫到200℃后再以3℃/min速率升溫至230℃，保持25 min;載氣為高純氮氣，柱流速為1 mL/min，分流比1/50;進樣量為1 μL，每個樣品平行測定2次。

1.3.4 微觀結構測定

采用日立臺式掃描電子顯微鏡TM3030觀測粉末的表面及剖開面微觀結構。取適量樣品于導電雙面膠上，并用洗耳球將多余的粉末吹掉，噴金30 s后觀測，加速電壓為15 kV。

1.3.5 橫向弛豫時間(T2)測定

脂肪在粉末中的流動性通過橫向弛豫時間T2表征，實驗儀器為PQ001-Analyst。準確稱取一定量樣品，用保鮮膜包裹后放入口徑為25 mm的核磁管中，利用多脈沖回波序列(CPMG)掃描樣品進行實驗，其中采樣點數TD=40 3052，回波個數NECH=10 000，掃描次數 NS=64，弛豫衰減時間 TE=0.202 ms，檢測溫度=32℃。實驗數據通過MultiExp Inv Analysis軟件的sirt方程反演，樣品平行測定2次。

1.3.6 蛋白質溶解行為測定

蛋白質的溶解行為采用SOTAX CE7 smart測定，該儀器運行采用閉路循環(huán)系統(tǒng)，同時還配備了自動取樣裝置。本實驗測定的是樣品與溶媒接觸后0～10 min內的蛋白質溶出情況。將200 mg樣品放入粉末樣品池中，以50 mL超純水作為溶媒，并全程將溶媒在25℃的室溫環(huán)境下恒速攪拌。實驗檢測溫度為25℃，泵流速為 8 mL/min，采樣間隔前 6 min為1 min/次，之后設置為2 min/次，每次取樣1.5 mL。蛋白質濃度采用Bradford法檢測，檢測波長為595 nm，每個樣品平行測定2次。

1.3.7 SDS-PAGE

SDS-PAGE被用來觀測樣品溶解過程中蛋白質溶出的情況。取溶出液與樣品緩沖液(每1 mL樣品緩沖液中含50 μL β-巰基乙醇)等體積混合，將混合液在沸水浴中煮沸3 min，冰浴冷卻。電泳用濃縮膠和分離膠的濃度分別為5%和12%，上樣量為15 μL。電泳結束后，取下膠版并置于培養(yǎng)皿中，倒入適量考馬斯亮藍染色;3 h后回收染色液，分批次更換脫色液進行脫色，直至膠版背景清晰。取出膠版后拍照，將膠版重新放回含脫色液的培養(yǎng)皿中保存。

2 結果與分析

2.1 乳脂肪模擬物的選擇

實驗通過分析MPC485中脂肪酸的組成和參照乳脂肪的熔點特征選擇乳脂肪模擬物。

2.1.1 MPC485中脂肪酸的組成

圖2為本實驗條件下37種脂肪酸甲酯標準品的色譜圖，其中共有32種脂肪酸可被檢測出。對比標品的出峰時間可以發(fā)現，商業(yè)MPC485中主要的脂肪酸有月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸(圖3)。

圖2 脂肪酸甲酯混合標準品色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of mixed fatty acid methyl ester standards

圖3 MPC485乳脂肪色譜圖Fig.3 Gas chromatogram of milk protein concentrate 485

2.1.2 乳脂肪的熔點特征

MacGibbon采用差式掃描量熱法(DSC)研究了新西蘭牛乳脂肪的熔點特征，并認為乳脂肪中大量存在的甘油三酯導致了乳脂肪寬泛的熔點范圍［21］。Kim［8］同樣利用DSC技術研究了噴霧干燥乳粉中乳脂肪的熔點性質，并與MacGibbon得到了相似的實驗結果。乳脂肪熔點范圍從-35～38℃，按照熔點峰出現位置可以劃分為3個范圍:低熔點區(qū)為0～10℃，峰值在7℃附近;中間熔點區(qū)為10～20℃，波峰對應溫度為17℃;高熔點區(qū)為22～36℃，波峰出現在30℃附近。

結合MPC485中脂肪酸的組成與乳脂肪熔點特征，實驗中選擇市場易得、實驗易測的脂肪酸甲酯為乳脂模擬物。其中月桂酸甲酯(C12)的熔點為4～5℃，處于低熔點區(qū);肉豆蔻酸甲酯(C14)的熔點為18℃，與乳脂肪最主要的波峰熔點(17℃)接近;棕櫚酸甲酯(C16)的熔點為28℃，處于高熔點區(qū)。

2.2 樣品基本理化指標及含脂量

將冷藏的噴霧干燥粉取出后放置在干燥器(內有變色硅膠)中平衡3 h，在室溫下分別測定粉末的粒徑、水分含量、總脂和表面脂含量(表1)。

表1 噴霧干燥粉基本指標及含脂量Table 1 Physiochemical properties of spray-dried milk powders

由表1可見，4種噴霧干燥粉粒徑均分布均勻，平均粒徑大約為21 μm;平均含水量大約為4%;實驗配方下得到加脂乳粉中總脂含量約為10%～13%，總脂含量的差異可能與均質及噴霧干燥過程中的損失有關;表面脂含量與所用模擬物有關，即乳粉表面脂肪含量隨脂肪熔點的升高而增加。表面脂含量的實驗結果與 F?ldt［10］的研究結果類似，F?ldt認為，一定量的高熔點脂肪會導致乳液聚集并進而降低干燥過程中乳液的穩(wěn)定性，但是具體機制還有待研究。目前研究粉末中含油量的方法很多但各有利弊［22］，傳統(tǒng)的溶劑提取及烘干法在實驗結果的準確性及操作的安全性上存在不足;而光電子能譜法雖能研究乳粉表面約10 nm的最外層中脂肪的覆蓋率，但測得的同種樣品的表面脂含量與覆蓋率存在差異，而且不同研究者測試相同樣品時得到的表面脂肪覆蓋率結果并不一致［9］。本實驗選用氣相色譜法測定單一脂肪酸甲酯的含量，方法操作簡單且重復性較好。

2.3 樣品的微觀結構

實驗中通過SEM研究了乳粉顆粒的表面及內部微觀結構(圖4)。

由圖4可見，4種樣品表面均含有不同程度的凹痕，這與噴霧過程中表面快速的形成有關。由于含高蛋白的乳液具有較高的黏度，因此在一定的干燥速率下，當液滴下墜并擴散時擴張受阻，進而表面在高溫下快速固化而形成凹痕。商業(yè)MPC485復水后重新噴霧干燥，所得粉末表面光滑、內壁致密;而含有脂肪酸甲酯的3種樣品則表面相對粗糙、內壁疏松。當電鏡放大倍數達到10 000倍時，加脂濃縮乳蛋白的表面則有較多可見的小孔(白色箭頭處)及脂肪層(黑色箭頭處)?？紫稙橛偷蔚拇嬖谔峁┝丝臻g，而且這些小孔也可能為乳粉在儲藏期內脂肪的遷移提供了便利［11］。綜上所述，脂肪的存在不僅會影響乳粉的表面微觀結構，而且對乳粉的內壁結構也存在影響，進而有可能影響到乳粉的結塊、復水等性質。

圖4 含不同乳脂模擬物乳粉的微觀結構Fig.4 SEM images of milk powders with different fatty acid methyl esters

2.4 橫向弛豫時間T2

低場核磁技術測得的橫向弛豫時間(T2)可用來表征樣品內部氫質子所處的化學環(huán)境，T2越大則質子所受束縛越小，流動性越強［23］。低場核磁技術常常用來研究不同自由度水分在固態(tài)體系中的存在狀態(tài)。蛋白質、碳水化合物及脂肪中氫質子因所處化學環(huán)境的不同，T2差異可以區(qū)分出來，故而也可以利用T2研究乳脂肪［24］。

對照MPC可知(圖5)，脂肪的T2主要出現在100～1 000 ms。噴霧干燥制備的樣品中因為含有的脂肪酸甲酯的熔點不同，因而不僅表面脂的含量不同，不同的甲酯在乳粉內的流動性也不同。熔點最低的月桂酸甲酯(C12)的T2平均值為464 ms，流動性最強;中間熔點的肉豆蔻酸甲酯(C14)的T2為305 ms，流動性居中;熔點較高的棕櫚酸甲酯(C16)的T2縮短到266 ms，在3種甲酯中總的流動性最差。

圖5 噴霧干燥樣品第0天的T2分布圖Fig.5 T2distribution of different powders after preparation(0 day)

通常將乳粉中的脂肪分為表面脂、內部游離脂和包埋脂，低場核磁技術只能檢測到脂的存在，具體檢測到脂的種類還有待研究。

2.5 樣品中蛋白質溶解行為

乳粉的復水包括潤濕、下沉、崩解和分散4個步驟，目前研究表面脂肪對乳粉復水的影響主要集中在潤濕階段。研究粉末潤濕性的方法有靜態(tài)法和流變法，靜態(tài)法受人為操作因素的影響較大，而流變法普及度不高。溶出儀常被用在藥物中活性成分的釋放動力曲線的研究上。乳粉的溶解動力曲線研究通常采用循環(huán)水?。?5］手動取樣法，如果用磁力攪拌分散，則短時間內粉末不能夠完全的潤濕，因而導致了取樣時間較長，這對比較表面性質的差

異對乳粉理化性質的影響而言意義不大。本實驗中利用SOTAX溶出儀研究乳粉復水前期的蛋白質溶解情況，溶媒逆流接觸樣品的方式保證了溶媒與樣品的充分接觸，初始取樣時間點和取樣時間間隔均可設置為1 min，這對研究乳粉前期的溶解具有重要的實用價值。

圖6表現了樣品與25℃的超純水在接觸前10 min內的蛋白質溶解情況。MPC中含脂量不到2%，蛋白質的溶出呈現先慢后快再次變慢的“S”型曲線形式。由于噴霧過程中形成了一層較致密的表面殼層，因此溶媒溶解表面層需要一定的時間;當表面層溶解后，蛋白質溶出速率加快。在溶解過程中，MPC的溶解速度明顯要快于添加模擬脂質的樣品，特別是在中后期更為明顯。對于添加模擬脂質的樣品，添加C14的樣品溶出速度在中后期要快于添加C12及C16的樣品。結合乳粉的微觀結構和T2數據分析，認為一方面含脂樣品中蛋白質在中后期時間段的溶出速率可能與乳粉內部脂肪的含量有關，以樣品中總脂含量減去表面脂含量表示內部脂肪含量，其中含C12的加脂乳粉中內部脂含量高于含C14的乳粉，因此在3 min后觀測到含C12的乳粉中蛋白質溶出速率低于含C14的乳粉;另一方面加脂乳粉內脂肪的流動性也可能影響著蛋白質的溶出速率，含C14與含C16的乳粉中內部脂含量接近，但由于C16的流動性較低(T2=266 ms)，因此含C16的濃縮乳蛋白粉中蛋白質溶出速率小于含C14的乳粉(T2=305 ms)。

圖6 樣品前10 min蛋白溶解行為Fig.6 Dissolution of protein in different powders within ten minutes

2.6 SDS-PAGE觀測蛋白質溶出情況

圖7表征了不同乳粉在前10 min內不同蛋白質組分的溶出狀況。

圖7 樣品中蛋白質溶出情況Fig.7 Gel electrophoresis of protein fractions by dissolution test

由電泳圖可見，隨著溶出時間的增加，蛋白質逐漸溶出，其中含量變化最大的為α-酪蛋白和β-酪蛋白。與重新噴霧干燥制備的MPC相比，加脂乳粉溶出的蛋白質中乳清蛋白(尤其是α-乳白蛋白)含量較少。將3種加脂乳粉的溶出情況進行比較，當溶出時間為2 min時，含月桂酸甲酯的乳粉并未檢測到疏水性最強的β-酪蛋白。由于實驗中選擇的乳脂模擬物具有一定的疏水性，因此在乳粉均質過程中，有可能流動性最強的月桂酸甲酯表面覆蓋了較多的疏水性酪蛋白［26］，進而影響了疏水性蛋白的溶解情況。

綜上可知，脂肪對乳粉中蛋白質溶出的影響既與乳粉的表面及內部脂肪的含量有關，同時也與脂肪在乳粉內的流動性有關。

3 結論

本研究通過分析MPC485中主要的脂肪酸組成及參考乳脂肪的熔點特征選取了3種乳脂肪模擬物:月桂酸甲酯(MP=4～5℃)、肉豆蔻酸甲酯(MP=18℃)、棕櫚酸甲酯(MP=28℃)，主要研究了不同熔點的脂肪對噴霧干燥粉的微觀結構及粉末中蛋白質溶解行為的影響。

研究發(fā)現，噴霧干燥粉表面脂含量與脂肪的熔點有關，隨熔點的升高，加脂乳粉表面脂含量逐漸增加。表征乳脂肪流動性的橫向弛豫時間T2也與熔點有關，熔點最低的月桂酸甲酯的流動性最好，其次為中間熔點的肉豆蔻酸甲酯，熔點最高的棕櫚酸甲酯流動性最差。對粉末中蛋白質溶解行為的研究表明，含脂樣品會延緩粉末中蛋白質的溶出速率，這種延緩蛋白質溶出的現象受乳粉中表面脂和內部脂的含量及脂肪在乳粉中的流動性的影響，表面脂含量越高則蛋白質初期的溶出越慢，內部脂肪含量越高則蛋白質中后期的溶出越慢;脂肪在乳粉中的流動性越差，蛋白質的溶出也會變得緩慢。

綜上所述，本研究探討了不同熔點的脂肪對濃縮乳蛋白噴霧干燥粉的溶解性能的影響，為進一步提高此類產品的功能性及貯藏穩(wěn)定性奠定了基礎。同時研究結果還為乳蛋白在功能脂質包埋領域中的應用提供了指導。

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