釀酒酵母糖基化缺陷型菌株中ALG6基因的過量表達(dá)*

張閣元，徐沙，高曉冬，中西秀樹

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)

糖蛋白(Glycoproteins)是由糖類分子與蛋白質(zhì)分子通過共價(jià)結(jié)合形式形成的一類蛋白質(zhì)。蛋白糖基化修飾一共有 5 種類型，N-、O-、P-、C-和 G-糖基化［1］，其中N-糖基化的修飾最為普遍，對(duì)蛋白的生化性質(zhì)和功能的實(shí)現(xiàn)起到關(guān)鍵的作用。N-糖基化在蛋白質(zhì)的生物活性［2］、穩(wěn)定性，分子間的相互識(shí)別［3-4］特定的免疫反應(yīng)［5］以及糖蛋白質(zhì)藥物的半衰期等方面都有重要的影響。目前已有多種糖蛋白藥物被批準(zhǔn)用于治療人類疾病，廣泛應(yīng)用的醫(yī)藥蛋白中70%以上是糖蛋白［6］。迄今為止，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系CHO)仍為獲取人體相似糖蛋白的唯一途徑。采用同屬真核細(xì)胞并擁有較強(qiáng)蛋白分泌能力的酵母作為表達(dá)體系，成為解決當(dāng)前糖蛋白難以低成本、批量化生產(chǎn)的最佳選擇。

酵母和高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞等真核生物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的糖基化過程具有高度的保守性，最終都會(huì)成形Man8GlcNAc2的N-糖基化修飾。進(jìn)入高爾基體后，酵母在 α-1，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶 (α-1，6-mannosyltransferase，Och1p)［7］和 α-1，3-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(α-1，3-mannosyltransferase，Mnn1p)［8］等一系列酶的催化作用下形成高甘露糖型的N-糖基化［9］。哺乳動(dòng)物細(xì)胞則在一系列甘露糖苷酶(Mannosidase)和其特有的糖基化轉(zhuǎn)移酶作用下形成不同于酵母的雜合型和復(fù)合型N-糖基化［9］。未經(jīng)改造的酵母生產(chǎn)的醫(yī)藥糖蛋白具有高甘露糖基化的修飾，這會(huì)造成蛋白活性和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的變化并引起人體的過敏反應(yīng)，因此必須對(duì)酵母糖基化途徑進(jìn)行去高甘露糖基化等方面的人源化改造［10］。2006 年，Hamiltion［11］等在 Science 上發(fā)表了通過在畢赤酵母(Pichia pastoris)Δoch1缺陷型菌株中合成CMP-唾液酸，CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和唾液酸轉(zhuǎn)移酶(SiaT)等酶的策略，得到了可以進(jìn)行人類復(fù)合型糖基化修飾的酵母表達(dá)系統(tǒng)。由于此系統(tǒng)中同時(shí)表達(dá)了過多的外源基因，造成表達(dá)的蛋白功能不穩(wěn)定等一系列問題，無法對(duì)糖蛋白進(jìn)行高效、均一的人類復(fù)合型糖基化修飾。因此，該研究并未有后續(xù)的報(bào)道，也無法真正的應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。為了實(shí)現(xiàn)酵母糖蛋白表達(dá)系統(tǒng)真正的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用，上述問題必須要解決。

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作為模式真核生物，其糖基化過程相關(guān)基因研究透徹，基因工程操作簡(jiǎn)單，是對(duì)酵母人源化改造過程進(jìn)行深入研究的理想菌株［12］。因此，本文以釀酒酵母W303a為出發(fā)菌株，對(duì)其N-糖基化途徑進(jìn)行人源化改造，并對(duì)改造后菌株出現(xiàn)的生長(zhǎng)速度緩慢、N-聚糖位點(diǎn)占有率降低等問題進(jìn)行研究。本研究為酵母糖蛋白表達(dá)系統(tǒng)的最終構(gòu)建及其工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

釀酒酵母出發(fā)菌株W303a，質(zhì)粒 pFA6a-URA3、pY26TEF-GPD、pRS424TEF-3FLAG-6His、pY26TEF-3FLAG均由本實(shí)驗(yàn)室保藏和提供。

將pY26TEF-3FLAG質(zhì)粒和PCR擴(kuò)增得到的釀酒酵母ALG6基因片段用NotI、BglII雙酶切，對(duì)酶切后的產(chǎn)物膠回收純化后連接得到pY26TEF-ALG6-3FLAG質(zhì)粒。

hLYM為無糖基化位點(diǎn)的人類溶菌酶基因(來源于實(shí)驗(yàn)室人類基因文庫(kù))，hLYM(m)為定點(diǎn)突變后具有一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(57號(hào)位天冬酰胺，Asn57)的人類溶菌酶基因。hLYM(m)定點(diǎn)突變的具體方法參見文獻(xiàn)［13］，即通過融合PCR為基礎(chǔ)的位點(diǎn)定向誘變技術(shù)將人類溶菌酶的第59位氨基酸Arg59突變?yōu)镾er59(通過引物設(shè)計(jì)將其基因序列CGA突變?yōu)锳GT，如表1中引物R17、F18斜體部分所示，引物R17、F18為反向互補(bǔ)序列)，從而將hLYM基因編碼的Asn57-Thr58-Arg59多肽段突變成為Asn57-Thr58-Ser59多肽段，得到Asn57氨基酸位點(diǎn)就可被N-糖基化修飾的hLYM(m)基因。

將pRS424TEF-3FLAG-6His質(zhì)粒和PCR擴(kuò)增得到的hLYM、hLYM(m)基因片段用BamHI、EcoRI雙酶切，對(duì)酶切后的產(chǎn)物膠回收純化后連接得到pRS424TEF-hLYM-3FLAG-6His和pRS424TEF-hLYM(m)-3FLAG-6His質(zhì)粒。

本實(shí)驗(yàn)中所使用的PCR引物見表1，構(gòu)建和使用的質(zhì)粒見表2。轉(zhuǎn)入質(zhì)粒后得到的菌株見表3。引物合成和質(zhì)粒測(cè)序于華大基因。

表1 本研究中所用的引物Table 1 Primers used in this study

表2 本研究中所用的質(zhì)粒Table 2 Plasmids used in this study

1.1.2 主要試劑和儀器

KOD-Plus-Neo高保真DNA聚合酶購(gòu)于東洋紡公司;N-糖苷酶F(PNGase F)試劑盒、限制性內(nèi)切酶及T4-DNA Ligase購(gòu)置于大連寶生物公司;β-葡聚糖酶、5-氟乳清酸 (5-Fluoroorotic Acid，5-FOA)及 PCR產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)置于上海生物工程公司;SDSPAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)置于碧云天公司;相關(guān)抗體購(gòu)置于Life Technologies公司;其他試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。SDS-PAGE凝膠電泳儀購(gòu)置于美國(guó)伯樂公司;PCR儀器購(gòu)置于德國(guó)Eppendorf公司;ImageQuant LAS 4000mini顯像儀購(gòu)置于通用電氣醫(yī)療集團(tuán)。

1.1.3 培養(yǎng)基和溶液配方

①YPAD培養(yǎng)基:1 L含胰蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，葡萄糖20 g，腺嘌呤30 mg;②SD選擇性培養(yǎng)基:1 L含酵母氮基6.7 g，葡萄糖20 g，補(bǔ)加不同缺陷型培養(yǎng)基所需的氨基酸粉末;③SD全培養(yǎng)基:1 L含酵母氮基6.7 g，葡萄糖20 g，補(bǔ)加全部必須氨基酸粉末;④2×YT培養(yǎng)基:1 L含酵母氮基10 g，胰蛋白胨16 g，NaCl 5 g。以上所有的培養(yǎng)基均為液體培養(yǎng)基，配制固體培養(yǎng)基時(shí)添加2%(W/V)的瓊脂粉。配制含氨芐青霉素的培養(yǎng)基，需在培養(yǎng)基冷卻后加入氨芐青霉素，至終持量濃度為100 mg/L。配制含5-氟乳清酸的培養(yǎng)基，需在培養(yǎng)基冷卻后加入5-氟乳清酸，至終質(zhì)量濃度為1g/L。

1.2 Δalg3Δoch1Δmnn1無標(biāo)記菌株的構(gòu)建

基因敲除的具體方法參見文獻(xiàn)［14］。其中，質(zhì)粒pFA6a-URA3為敲除ALG3、OCH1和MNN1的模板。PCR引物見表1。尿嘧啶缺陷(URA3)標(biāo)簽的敲除是利用5-氟乳清酸的反篩選原理［15-16］。即URA3基因表達(dá)過程中產(chǎn)生的中間物質(zhì)會(huì)與5-氟乳清酸反應(yīng)產(chǎn)生毒性，從而使含URA3基因的菌株不能在含5-氟乳清酸的培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。

表3 本研究中所用的釀酒酵母菌株Table 3 Saccharomyces cerevisiae strains used in this study

1.3 液泡羧肽酶Y的提取

離心收集適量的酵母細(xì)胞，懸浮于1 mL的Lyticase緩沖液 (1.0 mol/L山梨醇，2 mmol/L MgCl2，0.14% β-Me，50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，含濃度為50 U/OD660的β-葡聚糖酶)中。30℃孵育60 min裂解酵母細(xì)胞壁。收集處理后的樣品，懸浮于裂解緩沖液(0.2 mol/L山梨醇，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5)中。加入蛋白酶抑制劑(1 mmol/L PMSF)和適量的玻璃珠后，振蕩30 s后冰浴30 s破碎細(xì)胞，重復(fù)上述循環(huán)5～7次。4℃ 1 000×g離心10 min去除未裂解的細(xì)胞和細(xì)胞壁雜質(zhì)，收集上清液，即可得到完整的胞內(nèi)蛋白。

1.4 胞外蛋白人類溶菌酶的提取

從平板上挑取單菌落接種于5 mL的Ura/Trp缺陷的SD選擇性培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)。培養(yǎng)至穩(wěn)定期初期后，將菌液全部轉(zhuǎn)移至100 mL的Ura/Trp缺陷的SD選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d左右。離心去除細(xì)胞沉淀收集上清液。利用超濾濃縮管(截留分子量為10 kDa)，4℃ 4 000×g條件下離心2 h，將上清液濃縮500倍左右。

1.5 糖蛋白N-糖鏈的酶切處理(PNGase F酶切處理)

PNGase F酶切處理方法參見Takara操作手冊(cè)。取10 μL的糖蛋白樣品溶液，加入10 μL的變性緩沖A溶液后充分混勻，置于100℃下孵育處理3 min。向處理后的溶液中加入20 μL的穩(wěn)定C溶液和52 μL的去離子水，充分混勻。加入8 mU的PNGase F酶于混合溶液中，37℃酶切反應(yīng)15～20 h，即可得到酶切后無糖鏈的蛋白樣品。

1.6 蛋白印跡分析

取適量的蛋白樣品，加入上樣緩沖液(2%SDS，5%甘油，5%2-頸基乙醇，0.002%溴酚藍(lán)，62.5 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8)，100 ℃條件下水煮3 min。對(duì)處理后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，并利用半干法電轉(zhuǎn)的方式將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用TBST(1%1 mol/L Tris，3%5 mol/L NaCl，0.5%Tween 20)對(duì)PVDF膜進(jìn)行清洗，牛奶(5%的脫脂奶粉TBST溶液)封閉處理2 h左右。將PVDF膜放入含一抗(anti-CPY或 anti-FLAG)的牛奶溶液中孵育2 h，TBST清洗后放入含二抗(Goat anti-Mouse或Goat anti-Rabbit)的牛奶溶液中孵育2 h(抗體稀釋2 000～5 000倍)。TBST清洗后對(duì)PVDF膜進(jìn)行顯色處理，用ImageQuant LAS4000mini對(duì)蛋白印跡顯色結(jié)果進(jìn)行觀察。

1.7 不同菌株的人類溶菌酶分泌效果分析

取上清濃縮處理后的等體積(10 μL)不同菌株分泌得到的人類溶菌酶蛋白溶液(人類溶菌酶蛋白的提取見材料與方法1.4)，對(duì)其進(jìn)行蛋白印跡分析(見材料與方法1.6)，通過對(duì)人類溶菌酶蛋白條帶的粗細(xì)比較從而對(duì)不同菌株的人類溶菌酶分泌效果進(jìn)行分析。

1.8 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

從平板上挑取單菌落接種于3 mL的Ura缺陷的SD選擇性培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)。離心收集等量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，并將其轉(zhuǎn)移到20 mL的Ura缺陷的SD選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每8 h取1次樣品，對(duì)其OD660進(jìn)行測(cè)定，至OD660數(shù)值基本不變的時(shí)候停止測(cè)定。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)3次。根據(jù)測(cè)定的OD660的數(shù)值，計(jì)算出對(duì)應(yīng)的細(xì)胞數(shù)量以10為底取對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，得到不同菌株的生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 Δalg3Δoch1Δmnn1無標(biāo)記菌株的構(gòu)建

釀酒酵母糖蛋白表達(dá)系統(tǒng)的最終構(gòu)建，需要外源表達(dá)多種糖基化相關(guān)的基因。為了便于后續(xù)的進(jìn)一步基因操作，本研究利用融合PCR和同源重組等方法，構(gòu)建Δalg3Δoch1Δmnn1無篩選標(biāo)記的三缺陷型菌株。

以W303a為出發(fā)菌株，采用 URA3作為敲除MNN1基因的篩選標(biāo)記。以F1與R1為引物，pFA6a-URA3為模板，通過PCR擴(kuò)增得到的URA3片段轉(zhuǎn)化W303a，在Ura缺陷的SD選擇性培養(yǎng)基平板上篩選得到Δmnn1缺陷型菌株。融合PCR構(gòu)建URA3敲除框的過程如圖1所示。利用兩對(duì)引物(F2、R2為上游引物，F(xiàn)3、R3為下游引物)分別PCR擴(kuò)增得到MNN1的上下游兩臂(大小均為300bp)。以F2與R3為引物，通過融合PCR將其連接起來(大小為600bp)。將此片段轉(zhuǎn)入Δmnn1菌株中，涂布于YPAD培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)后，再影印到SD全培養(yǎng)基(含1 g/L 5-氟乳清酸)上培養(yǎng)，篩選得到Δmnn1無標(biāo)記菌株(平板劃線驗(yàn)證結(jié)果如圖2)。采用相同的方法敲除ALG3和OCH1基因，得到 Δalg3Δoch1Δmnn1 無標(biāo)記菌株(KN1菌株)。

圖1 利用融合PCR敲除URA3(MNN1)標(biāo)記的示意圖Fig.1 The schematic diagram of disruption of URA3(MNN1)by fusion PCR

圖2 營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株在SD培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況Fig.2 The verification of the auxotrophic strains on SD plates

2.2 ALG6過量表達(dá)提高Δalg3Δoch1Δmnn1菌株的N-聚糖位點(diǎn)占有率

釀酒酵母的ALG3等糖基化相關(guān)基因的敲除會(huì)造成N-聚糖位點(diǎn)占有率顯著的降低［17］。寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體(Oligosaccharyl transferase complex，OST)介導(dǎo)的多萜醇連接的寡糖前體(Dol-pp-glycan)上的寡糖轉(zhuǎn)移到新生的多肽前體上的高效進(jìn)行需要Dolpp-連接的寡糖前體上的3個(gè)葡萄糖帽的存在［18］。ALG3的敲除會(huì)造成Alg6p催化作用的顯著降低，從而降低了第1個(gè)葡萄糖添加到Man5GlcNAc2-PP-Dol糖鏈結(jié)構(gòu)上的效果［19］。這就會(huì)造成低葡萄糖基化的寡糖前體的形成，從而使OST的催化效果降低，造成低的N-聚糖位點(diǎn)占有率。

為了提高 Δalg3Δoch1Δmnn1菌株(即 KN1菌株)的N-聚糖位點(diǎn)占有率，作者在此菌株中過量表達(dá)ALG6，并以含有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)的液泡羧肽酶Y(CPY)為研究的模型蛋白，對(duì)不同菌株的N-聚糖位點(diǎn)占有率進(jìn)行分析比較，結(jié)果如圖3所示。

圖3 利用蛋白質(zhì)印跡法分析不同菌株中N-聚糖位點(diǎn)占有率Fig.3 The analysis of N-glycosylation sites occupancy in different strains by western blot

出發(fā)菌株W303a中液泡羧肽酶Y的western結(jié)果只有單一的蛋白條帶，其4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)都能被正常的N-糖基化修飾。對(duì)W303a菌株中的液泡羧肽酶Y蛋白進(jìn)行PNGase F酶切處理得到無N-糖基化修飾的液泡羧肽酶Y蛋白(如圖3中W303a(PNGase F)泳道所示)，其蛋白分子量發(fā)生顯著的降低、液泡羧肽酶Y條帶電泳遷移率顯著加快。ALG3、OCH1、MNN1基因被敲除后，KN1菌株(如圖3中KN1-pY26泳道所示)中的高甘露糖基化修飾被完全去除、N-糖鏈分子量降低，故其4個(gè)位點(diǎn)都被糖基化的液泡羧肽酶Y條帶電泳遷移率要快于出發(fā)菌株W303a。與出發(fā)菌株W303a菌株相比還可發(fā)現(xiàn)，KN1菌株中液泡羧肽酶Y的N-糖基化修飾并不完全、電泳條帶不均一，絕大部分液泡羧肽酶Y只有2或3個(gè)位點(diǎn)被N-糖基化修飾，N-聚糖位點(diǎn)占有率發(fā)生顯著降低。KN1菌株中過量表達(dá)ALG6后，KN1-ALG6菌株中液泡羧肽酶Y的N-聚糖位點(diǎn)占有率顯著提高，大部分液泡羧肽酶Y具有3或4個(gè)位點(diǎn)被N-糖基化修飾。表明ALG6基因的過量表達(dá)可以改善KN1菌株低的N-糖基化修飾效果，顯著提高其N-聚糖位點(diǎn)占有率。

對(duì)不同菌株的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖4所示。與出發(fā)菌株W303a(如圖4中W303a-pY26結(jié)果所示)相比，ALG3、OCH1、MNN1基因被敲除后，KN1菌株(如圖4中KN1-pY26結(jié)果所示)的生長(zhǎng)變的極其緩慢，30 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在KN1菌株中過量表達(dá)ALG6后，KN1-ALG6菌株的生長(zhǎng)速度得到顯著提高，15 h左右已經(jīng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，32 h左右基本進(jìn)入穩(wěn)定期，與出發(fā)菌株W303a的生長(zhǎng)狀況基本相同。表明ALG6基因的過量表達(dá)可以顯著回補(bǔ)KN1菌株的生長(zhǎng)狀況。

圖4 不同菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.4 The growth curve of different strains

2.3 ALG6過量表達(dá)提高人類溶菌酶的分泌效率

溶菌酶(Lysozyme，LYM)的肽鏈上無糖基化位點(diǎn)，人類溶菌酶蛋白的分子量為14.4 kDa，糖基化位點(diǎn)的存在可以提高溶菌酶蛋白的穩(wěn)定性。本研究通過點(diǎn)突變使其57位天冬酰胺(Asn)可以被糖基化(用LYM(m)表示)，并以具有糖基化修飾的分泌蛋白溶菌酶作為模式蛋白，對(duì)菌株的蛋白分泌效果進(jìn)行研究，結(jié)果如圖5(A)所示。不同的KN1菌株均可對(duì)外源分泌蛋白人類溶菌酶進(jìn)行高效分泌。KN1-LYM菌株只可分泌未被糖基化的溶菌酶蛋白，KN1-LYM(m)，KN1-LYM(m)-ALG6則可同時(shí)分泌未被糖基化和單糖基化的溶菌酶蛋白。對(duì)KN1-LYM，KN1-LYM(m)菌株的蛋白分泌效果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，糖基化位點(diǎn)的存在與否不會(huì)影響蛋白的分泌效果。在溶菌酶可被單糖基化修飾的KN1-LYM(m)菌株中過量表達(dá)Alg6p(如圖5B所示)可顯著提高溶菌酶蛋白的分泌效果。表明ALG6的過量表達(dá)可以顯著的提高KN1菌株對(duì)糖蛋白(具有單糖基化的溶菌酶)的分泌效果。

圖5 ALG6的過量表達(dá)對(duì)KN1菌株中人類溶菌酶的分泌效果影響Fig.5 The effect of overexpression of ALG6 on the secretion of human lysozyme in KN1

3 結(jié)論

酵母人源化糖蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建主要是對(duì)其N-糖基化途徑的人源化改造，不同酵母菌株的N-糖基化改造存在一定的差異性。畢赤酵母的糖基化改造相對(duì)簡(jiǎn)單，只需敲除OCH1，即可得到低甘露糖基化的表達(dá)系統(tǒng)［20］。但其以甲醇作為誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)的唯一碳源，對(duì)于食品、醫(yī)藥領(lǐng)域來說不夠安全，且至今仍沒有實(shí)現(xiàn)人源化糖蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)。作者所在研究室前期通過敲除ALG3、OCH1、MNN1等糖基化相關(guān)基因，得到了N-糖鏈均一性較好的主要結(jié)構(gòu)為Man5GlcNAc2的釀酒酵母菌株［21］。但糖基化相關(guān)基因的敲除嚴(yán)重的影響了菌株的生長(zhǎng)速率和N-聚糖位點(diǎn)占有率。在此前的研究中，利用適應(yīng)性進(jìn)化的方法對(duì)菌株進(jìn)行馴化培養(yǎng)后，得到了生長(zhǎng)狀況和N-聚糖位點(diǎn)占有率部分回補(bǔ)的菌株。

2012 年，De Pourcq［22］等通過在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Δalg3缺陷型菌株中過量表達(dá)ALG6，得到了N-聚糖位點(diǎn)占有率提高的基因工程酵母。在本研究中，作者利用相同的方法，在釀酒酵母Δalg3Δoch1Δmnn1菌株中過量表達(dá)ALG6，提高了N-聚糖位點(diǎn)占有率和外源糖蛋白的分泌效果，顯著改善菌株的生長(zhǎng)狀況。作者在研究中還發(fā)現(xiàn)，RHO1［23］(細(xì)胞壁完整信號(hào)通路CWI的關(guān)鍵基因，參與眾多胞內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)制)和 WBP1［24］(OST的必須亞基基因，被猜測(cè)與OST對(duì)多萜醇寡糖前體的糖鏈識(shí)別作用相關(guān))的過量表達(dá)也可改善N-聚糖位點(diǎn)占有率和菌株的生長(zhǎng)狀況(結(jié)果未在此顯示)。研究中發(fā)現(xiàn)，RHO1的過量表達(dá)還能顯著的增強(qiáng)Δalg3Δoch1Δmnn1菌株對(duì)高溫、潮霉素及高滲透壓的抗性(結(jié)果未在此顯示)。RHO1過量表達(dá)所造成的一系列的效果與細(xì)胞壁(β-1，3葡聚糖層，占細(xì)胞壁質(zhì)量的30% ～45%)變厚密切相關(guān)(結(jié)果未在此顯示)。因此，作者猜測(cè)，ALG6基因過量表達(dá)后缺陷型菌株生長(zhǎng)的回補(bǔ)也可能是由于細(xì)胞壁變厚造成的。過量表達(dá)ALG6后菌株對(duì)溶菌酶糖蛋白分泌效果的提高，則是由于Alg6p的過量表達(dá)回補(bǔ)了其生長(zhǎng)狀況，從而促進(jìn)了蛋白的分泌。

綜上所述，本研究進(jìn)一步的改善了 Δalg3Δoch1Δmnn1三缺陷型菌株的N-聚糖位點(diǎn)占有率、生長(zhǎng)狀況和外源蛋白分泌效果。在此基礎(chǔ)上，作者將對(duì)釀酒酵母進(jìn)行進(jìn)一步的糖基化改造，以期得到可以用于工業(yè)生產(chǎn)醫(yī)藥糖蛋白的工程菌株。

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