兩種裸鼠胰腺癌模型腎上腺髓質(zhì)素的表達和建模效果比較

劉 娜，楊文彬，曹 罡，王 磊(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院超聲研究室，西安 70004;西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院普外科;通訊作者，E-mail:fanfanfriday@63．com)

根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，全世界范圍內(nèi)，胰腺癌在最常見的導(dǎo)致死亡的腫瘤中排第8位［1］，如果不治療，胰腺癌的平均生存時間為3－4個月［2］，即使經(jīng)過手術(shù)及放化療等治療，5年生存率也小于5%。胰腺癌術(shù)后死亡的原因主要是轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，晚期腹腔種植轉(zhuǎn)移極為常見，約占胰腺癌患者術(shù)后死亡人數(shù)的50%。一旦發(fā)生腹腔種植，其治療效果不佳。如何有效預(yù)防、治療腹腔種植轉(zhuǎn)移是提高胰腺癌患者生存率的關(guān)鍵。胰腺癌的嚴重性以及對其病因?qū)W所知甚少的事實迫切需要我們開展更深入的研究。胰腺癌治療進展緩慢的原因之一是缺乏一個適宜的動物模型。本實驗?zāi)康脑谟谕ㄟ^觀察皮下移植和原位移植胰腺癌裸鼠模型成功率，以及模型癌細胞中ADM和CD34的表達，比較兩種建模方法的優(yōu)劣，探討構(gòu)建胰腺癌異種裸鼠移植的適宜方法，并通過觀察ADM以及CD34的表達，探討ADM與血管生成的關(guān)系，力圖對胰腺癌深入研究提供幫助。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 細胞株 人胰腺癌低分化癌細胞株(BXPC-3)由上海中科院細胞庫提供。

1．1．2 實驗動物 Balb/c-nu/nu小鼠購于中科院上海動物實驗中心，周齡3－4周，體重10－20 g，雌雄各半，實驗裸鼠及實驗條件均達到SPF級標(biāo)準，恒溫25℃，空氣相對濕度45%－50%，自由進食高壓滅菌食物，飲用高壓滅菌水。試驗裸鼠總共40只，雌雄各半，按照隨機、對照、配對原則分為三組:第一組15只構(gòu)建皮下瘤模型;第二組15只建立原位移植瘤模型;第三組10只未做任何處理為陰性對照。

1．1．3 試劑 多克隆抗體ADM、CD34及 SP免疫組化試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1．2 方法

1．2．1 建立皮下移植瘤模型 人胰腺癌細胞株BXPC-3常規(guī)傳代培養(yǎng)至一定數(shù)量，取體外培養(yǎng)的細胞處于對數(shù)生長密集期時，用0．25%胰酶消化細胞，制成細胞懸液。用細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)，并用臺盼藍染色檢測細胞活力＞95%，調(diào)整濃度至1×107個/ml［3］，用規(guī)格為 1 ml的注射器抽取 0．2 ml(1 ×107個活細胞/ml)在裸鼠右背部皮膚皮下注射。

1．2．2 建立原位移植瘤模型 打開腹腔，分開胃與脾之間的薄膜，暴露胰腺，取50 μl瘤細胞懸液，將其注入胰腺被膜下，關(guān)閉腹腔。

1．2．3 觀察指標(biāo)及病理學(xué)觀察 實驗裸鼠沒有死亡，長出移植瘤則模型構(gòu)建成功。游標(biāo)卡尺測量皮下移植瘤模型腫瘤大小，長徑(L)和橫徑(W)，并按公式V=L×W2/2求得腫瘤的近似體積，每5 d測量一次計算生長率，生長率=平均腫瘤體積(mm3)/宿主裸鼠帶瘤時間(d)，并繪制生長曲線圖。移植30 d后，觀察實驗動物胸腹腔轉(zhuǎn)移情況。所有移植瘤均進行常規(guī)取材，石蠟切片，HE染色，光鏡觀察組織學(xué)特點。

1．2．4 免疫組化結(jié)果判定 ADM表達判定:陽性結(jié)果以細胞質(zhì)和/或細胞膜中出現(xiàn)棕色顆粒為準。在400倍高倍視野下選取3個視野，計數(shù)陽性細胞百分比后取平均值。陽性細胞數(shù)＜5%為陰性(－)，陽性細胞數(shù)5%－25%為陽性(+)，26%－50%為中度陽性(++)，＞50%為強陽性(+++)，取平均值。其中－、+、++即＜50%為ADM低表達組，+++為ADM高表達組［4］。微血管密度(MVD)判定:參照Weidner微血管計數(shù)法［5］，血管內(nèi)皮細胞胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色者為CD34陽性細胞。具體方法是低倍鏡(×100)下選取高血管密度區(qū)，在×200下計數(shù)3個視野的MVD，取其平均值作為該切片的MVD值，結(jié)果以3張片中的MVD的平均值表示。

1．3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2．1 移植成功率

各種模型構(gòu)建的成功率分別為:皮下移植瘤模型47%(7/15)，原位移植瘤模型100%(14/14)，利用細胞注射法建立原位移植瘤模型成功率較高(見圖1)。

圖1 移植后30 d時皮下移植瘤模型Figure 1 Subcutaneous tumors in nude mice at 30 d after transplantation

2．2 移植30 d后的轉(zhuǎn)移情況

胰腺癌皮下移植瘤模型中無1例發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。原位移植模型胰腺處長出不規(guī)則腫瘤組織，并向周邊胃壁組織浸潤，發(fā)生腹腔種植轉(zhuǎn)移，在腸系膜上、腹膜上和肝臟均發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)(見圖2－4)。

2．3 移植瘤形態(tài)及組織形態(tài)觀察

皮下瘤模型瘤體與皮膚無粘連，瘤體基底與肌肉及后腹膜粘連，完整切除瘤體，質(zhì)地稍硬，表面凹凸不平，切開后，切面呈灰白色魚肉狀，打開胸腹腔，未見胸腹腔內(nèi)有遠處轉(zhuǎn)移。原位轉(zhuǎn)移模型在胰腺處形成不規(guī)則的腫瘤組織，并與周圍胃壁組織、腸管浸潤粘連，部分在腹膜、腸系膜及肝臟形成轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，切開腫瘤后切面呈灰白色魚肉狀。HE染色:腫瘤細胞大小形態(tài)不一，可見多角形細胞，梭形細胞，細胞異型性大，周圍有大量纖維間質(zhì)，看不到腺腔分化，可見彌漫分布的癌巢，細胞核大、核異型性明顯，極性消失，可見核仁和較多核分裂，符合低分化腺癌病理特點，肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)中可見正常肝細胞旁邊的腫瘤細胞(見圖5－7)。

2．4 ADM和CD34在移植瘤中的表達

ADM蛋白染色主要位于細胞質(zhì)內(nèi)和細胞膜上，呈棕褐色顆粒狀(見圖8)。CD34主要在腫瘤組織的微小血管上表達，特別是在腫瘤的邊緣部位較為集中，微血管被染成褐色(見圖9)。

圖2 胰腺癌原位移植模型腸系膜種植結(jié)節(jié)Figure 2 Metastatic node in the mesenterium of orthotopic transplanted pancreatic tumor mice

圖3 胰腺癌原位移植模型腹膜種植結(jié)節(jié)Figure 3 Metastatic node in the peritoneum of orthotopic transplanted pancreatic tumor mice

圖4 胰腺癌原位移植模型肝種植結(jié)節(jié)Figure 4 Metastatic node in the liver of orthotopic transplanted pancreatic tumor mice

圖5 皮下瘤模型大體標(biāo)本Figure 5 Gross of pancreatic carcinoma subcutaneous tumor

圖6 移植瘤HE染色(×200)Figure 6 Morphological changes of pancreatic carcinoma subcutaneous tumor by HE(×200)

圖7 肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)HE染色(×200)Figure 7 HE staining of metastatic node in the liver of pancreatic carcinoma subcutaneous tumor(×200)

圖8 原位移植模型轉(zhuǎn)移瘤ADM表達(×200)Figure 8 ADM expression in metastasis models of orthotopic transplantation tumor(×200)

圖9 原位移植模型轉(zhuǎn)移瘤CD34表達(×200)Figure 9 CD34 expression in metastasis models of orthotopic transplantation tumor(×200)

對裸鼠胰腺癌原位移植模型和皮下瘤模型腫瘤組織中ADM表達陽性率和MVD值進行統(tǒng)計學(xué)檢驗(見表1、表2)。①采用兩獨立樣本率卡方檢驗，兩者之間ADM陽性表達率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。②采用兩獨立樣本t檢驗，MVD值在兩者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，原位移植模型轉(zhuǎn)移瘤明顯高于皮下瘤模型(P＜0．01)。③兩組之間ADM表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)，MVD 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0．01)。④采用兩獨立樣本t檢驗，結(jié)果顯示ADM高表達者MVD相應(yīng)增多，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。

表1 ADM、CD34在皮下移植瘤和原位移植模型轉(zhuǎn)移瘤中的表達Table 1 ADM，CD34 expression in metastasis models

表2 移植瘤中不同ADM表達中MVD的變化Table 2 Comparison of mean MVD in metastasis models of different ADM expression

3 討論

導(dǎo)致胰腺癌預(yù)后極差的原因除了胰腺癌患者就診時已屬中晚期外，其侵襲和轉(zhuǎn)移的能力仍是制約和影響胰腺癌治療的關(guān)鍵。腹腔轉(zhuǎn)移在腹部惡性腫瘤的治療中往往預(yù)后很差，占腫瘤術(shù)后死亡人數(shù)的50%［6］，現(xiàn)在常用的治療方法是腹腔化療和腹膜切除的方法，療效大都不理想，腹腔轉(zhuǎn)移過程的機制尚不明確，如何有效預(yù)防、治療腫瘤腹腔轉(zhuǎn)移是提高腫瘤患者生存率的關(guān)鍵，其轉(zhuǎn)移機制也成為腫瘤治療領(lǐng)域的熱點。而是否能建立一種完善的動物胰腺癌模型是進行相關(guān)領(lǐng)域研究的前提和關(guān)鍵。

自從Rygaard和Povlsen首次報道在裸鼠上成功移植入人結(jié)腸癌后［7］，許多研究者開始使用這種模型研究胰腺癌生物學(xué)機制和對治療的反應(yīng)。這種無胸腺小鼠又稱裸鼠，因為T細胞功能缺陷，所以不排斥外來組織移植物。裸鼠技術(shù)促進了人類腫瘤細胞庫的建立，細胞系種類包括高－低分化腫瘤，本實驗所采用的胰腺癌BXPC-3細胞系屬于胰腺低分化腺癌，侵襲力較強，容易制造移植模型。最常用的方法是將細胞株傳代培養(yǎng)后以一定量接種于裸鼠皮下，模型重復(fù)性好，技術(shù)操作簡單，長出的腫瘤肉眼可以觀察，腫瘤大小，生長速度等均可以量化，比較適合評估一種新的抗腫瘤藥物，或某種化學(xué)物質(zhì)甚至放射治療對腫瘤產(chǎn)生的影響。但在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，異位移植模型幾乎不發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，雖然可用于治療藥物的篩選評估，但容易出現(xiàn)藥物的假陽性，即對皮下移植瘤有效的治療方法不一定對轉(zhuǎn)移灶有效，而治療胰腺癌消除轉(zhuǎn)移灶是非常關(guān)鍵的一步［8］。相對的，原位移植模型模擬了人胰腺癌的常見發(fā)病部位及組織學(xué)類型，移植癌生長在胰腺原位、局部微環(huán)境、血液循環(huán)及淋巴引流特征與人類胰腺癌十分相似，在形態(tài)、生長、浸潤轉(zhuǎn)移方面與其來源腫瘤保持一致，而且成瘤潛伏期短，成瘤率可達到100%，有利于對干預(yù)效果進行全面、長期追蹤觀察，為更深入地研究胰腺癌提供了良好的實驗平臺。

此外，本研究中我們發(fā)現(xiàn)ADM在兩種模型腫瘤組織中均有表達，ADM表達高者MVD相應(yīng)增多，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義。腎上腺髓質(zhì)素(ADM)廣泛分布于人體內(nèi)的各個組織器官，發(fā)揮多種生物效應(yīng)。其中以腎上腺髓質(zhì)、腺垂體、腦、腎、心臟中的濃度較高［9］。其生理作用主要是參與調(diào)節(jié)循環(huán)系統(tǒng)功能。有研究表明胰腺癌ADM4 mRNA水平比正常胰腺組織和慢性胰腺炎高4倍，胰腺癌細胞本身可以生產(chǎn)和分泌ADM，并與由胰腺星狀細胞和內(nèi)皮細胞分泌的處于微環(huán)境中的受體相互作用，提高胰腺癌細胞增殖、侵襲活動［10］。CD34主要表達于處于活躍增生狀態(tài)的血管內(nèi)皮細胞，是內(nèi)皮細胞增殖的相關(guān)標(biāo)志，與新生血管密切相關(guān)。腫瘤組織的內(nèi)皮增殖是正常組織的20－2 000倍，內(nèi)皮細胞快速增殖形成血管為腫瘤細胞增殖和浸潤轉(zhuǎn)移提供了基礎(chǔ)。腫瘤組織中的微血管密度(MVD)與癌癥患者的預(yù)后相關(guān)［11］。本實驗采用免疫組織化學(xué)法測定移植瘤體中ADM和CD34表達，通過計數(shù)微血管密度，發(fā)現(xiàn)ADM表達高者MVD相應(yīng)增多，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這在基因與分子層面上證明了原位移植瘤模型在胰腺癌相關(guān)方面的研究利用效果要優(yōu)于皮下移植瘤模型，并可推測ADM有調(diào)節(jié)胰腺癌血管生成的作用，那么抗ADM的藥物如果有相反的作用，就可以為臨床上胰腺癌的治療提供一個新的腫瘤抗血管靶點。

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