人乳腺癌裸鼠移植模型建立體會(huì)

周文斌，周冬仙，陳亦欣，彭樹松，邙建波(深圳市人民醫(yī)院＆暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院乳腺甲狀腺外科，深圳 5800;深圳市人民醫(yī)院＆暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所;深圳市人民醫(yī)院＆暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院病理科;通訊作者，E-mail:5449958@qq．com)

乳腺癌是一種嚴(yán)重危害婦女健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，對(duì)其基礎(chǔ)與臨床研究與日俱增，以進(jìn)一步認(rèn)識(shí)其生物學(xué)行為并發(fā)展新的治療方法。乳腺癌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是研究乳腺癌生物學(xué)行為及進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)治療的重要工具之一，目前報(bào)道的多為乳腺癌自發(fā)模型或誘發(fā)模型［1－3］。由于上述2個(gè)方法存在一定局限性，本研究探討建立人乳腺癌細(xì)胞移植模型。

1 材料與方法

1．1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:裸小鼠(BALB/C－nu/nu)20只，購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌性，6周齡，重量16－20 g，飼養(yǎng)于層流罩中。乳腺癌細(xì)胞系:雌激素受體(estrogen receptor，ER)陽性的MCF-7細(xì)胞系由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科提供。培養(yǎng)基為250 ml的RPMI1640，含10%小牛血清和4 U胰島素，pH為7．4;在5%CO2、37 ℃孵育箱中培養(yǎng);用0．25%胰蛋白酶(Sigma公司，美國(guó))消化傳代。

1．2 方法

人源性乳腺癌細(xì)胞MCF-7培養(yǎng)于DMEM(Gibco公司，美國(guó))培養(yǎng)液中，常規(guī)加10%FBS、100 μg/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素、0．2 U/ml胰島素、0．1 nmol/L雌激素。放置5%CO2、37℃孵育箱中培養(yǎng)。

培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，用Hank液清洗2次，再用1%錐蟲藍(lán)染色，在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上作細(xì)胞計(jì)數(shù)，并調(diào)節(jié)使活細(xì)胞濃度為1×107/ml，于裸鼠右下腹壁接種0．1 ml/只。裸鼠繼續(xù)飼養(yǎng)于層流罩中。

1．3 結(jié)果觀察及統(tǒng)計(jì)

腫瘤細(xì)胞接種后，每天觀察裸鼠生命體征、飼料及飲水情況、腫瘤生長(zhǎng)情況，每周測(cè)量腫塊的大小，計(jì)算公式:表面積=(長(zhǎng)/2+寬/2)×π，并對(duì)裸鼠瘤體拍照。裸鼠死亡后切除腫塊、測(cè)定腫塊的長(zhǎng)徑和重量，對(duì)腫塊進(jìn)行乳腺癌病理類型和雌激素受體免疫組化等病理學(xué)檢查。

2 結(jié)果

2．1 腫瘤生長(zhǎng)情況

MCF-7乳腺癌細(xì)胞接種后6 d，在左下腹接種部位處出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)，質(zhì)地較硬，腫塊隨著時(shí)間推移逐漸增大。我們每周測(cè)量腫塊大小，提示腫塊日漸增大(見表1)。第20－30天腫瘤生長(zhǎng)較快，第26天開始，裸小鼠出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，至第45天時(shí)死亡8只，死亡率 40．0%(8/20)。

表1 裸鼠腫瘤表面積(±s)Table 1 Changes of tumor surface of nude mice after incubation(±s)

表1 裸鼠腫瘤表面積(±s)Table 1 Changes of tumor surface of nude mice after incubation(±s)

時(shí)間(d) 腫瘤表面積(mm)3．96 ±1．88 14 5．01 ±2．05 21 7．97 ±2．35 28 10．00 ±2．12 7 35 12．98 ±2．20

在第45天，處死幸存12只荷瘤裸鼠，完整剝離腫塊，分別測(cè)量每一瘤體的最長(zhǎng)徑和瘤體質(zhì)量，具體見表2。計(jì)算所有腫瘤的平均直徑和質(zhì)量分別為(11．08 ±1．38)mm 和(0．996 ±0．097)g。移植瘤瘤體表面皮膚完整，無缺損(見圖1)。

2．2 病理學(xué)檢查

肉眼觀移植瘤呈圓形或橢圓形，與周圍組織及腹壁肌肉等輕度粘連，未侵犯皮膚。腫塊質(zhì)地中等，剖面呈灰白色(見圖2)。光鏡下見:癌組織內(nèi)間質(zhì)少，實(shí)質(zhì)多，癌細(xì)胞排列成團(tuán);癌細(xì)胞大，胞質(zhì)豐富，核大，核仁清晰，多型性明顯。病理診斷為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，免疫組化染色提示ER陽性表達(dá)。

表2 存活裸鼠瘤體長(zhǎng)徑和質(zhì)量Table 2 Tumor size and weight of survived nude mice

圖1 移植瘤皮膚外觀Figure 1 Skin appearance of transplanted tumor

圖2 移植瘤瘤體外觀Figure 2 Appearance of transplanted tumor

3 討論

乳腺癌是一個(gè)世界范圍內(nèi)的嚴(yán)重危害婦女健康的惡性腫瘤，在我國(guó)其發(fā)病率不斷上升，部分地區(qū)已躍居女性惡性腫瘤的第一位。單純依靠改進(jìn)手術(shù)技巧很難提高手術(shù)切除率，化療、放療和內(nèi)分泌等的治療效果也都有一定的局限性，而且副作用較大，乳腺癌總體治愈率近10年來沒有得到顯著提高。目前臨床治療效果略有改觀的主要原因是由于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療，而不是治療方法本身的進(jìn)步［4，5］。治療失敗的主要原因是腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，人們一直在努力探索新的有效治療方法［4，5］。在對(duì)乳腺癌生物學(xué)行為的認(rèn)識(shí)和發(fā)展新的治療方法上，乳腺癌動(dòng)物模型是其中一項(xiàng)基礎(chǔ)性工作，起著非常重要的作用。

目前報(bào)道的乳腺癌模型，多為乳腺癌的自發(fā)模型、誘發(fā)模型或轉(zhuǎn)移模型。自發(fā)性的通常比用實(shí)驗(yàn)方法誘導(dǎo)的腫瘤與人類所患的腫瘤更為相似，但腫瘤發(fā)生情況可能參差不齊，模型很難在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的腫瘤學(xué)材料;誘發(fā)性乳腺癌模型操作簡(jiǎn)單，但誘癌過程需要較長(zhǎng)的時(shí)間。研究乳腺癌的治療，移植模型更能直觀地反映療效［6－8］。本研究的目的是建立人乳腺癌細(xì)胞移植模型，為研究?jī)?nèi)皮抑素的抗血管和淋巴管生成治療提供可靠的研究工具。

本研究所選用的動(dòng)物為裸鼠(nude mice)，它是一種因基因突變?cè)斐傻南忍煨约?xì)胞免疫缺陷動(dòng)物。裸鼠無毛、無胸腺，缺乏成熟的T淋巴細(xì)胞，接受人類及其他異種不發(fā)生排斥，腫瘤移植后生長(zhǎng)良好，并能保持腫瘤細(xì)胞的原有形態(tài)及病理特性，是腫瘤研究中較為理想和常用的動(dòng)物［3］。MCF-7細(xì)胞株是人源性乳腺癌細(xì)胞株，國(guó)內(nèi)外研究也多采用此種瘤細(xì)胞系。

多數(shù)學(xué)者常將MCF-7乳腺癌細(xì)胞株接種于裸鼠的乳墊部位［7］，個(gè)別也將MCF-7乳腺癌細(xì)胞株接種于裸鼠腋窩皮下［9］。本課題組發(fā)現(xiàn)，接種于裸鼠的乳墊部位，可能乳墊部位皮膚比較敏感，由于瘤體生長(zhǎng)的刺激，裸鼠的前肢體更容易抓傷接種部位皮膚而造成瘤體及表面皮膚潰爛;而接種于腋窩皮下，裸鼠的固定和操作略微復(fù)雜。因而我們改為將MCF-7乳腺癌細(xì)胞株接種于裸鼠右下腹壁皮下部位，裸鼠取平臥體位，操作簡(jiǎn)單。本研究證明:MCF-7乳腺癌細(xì)胞株在裸鼠右下腹壁部位生長(zhǎng)良好，瘤體表面皮膚完整。筆者認(rèn)為，如果我們建立人乳腺癌裸鼠移植動(dòng)物模型不是研究與乳腺癌區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性課題，而主要是用于腫瘤生物學(xué)行為研究和療效評(píng)估等，將MCF-7乳腺癌細(xì)胞株接種于裸鼠右下腹壁皮下部位是可行的。

本組結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞移植后，荷瘤裸鼠在層流罩中存活、生長(zhǎng)良好，移植瘤成功率高，達(dá)100%。腫瘤生長(zhǎng)情況易于觀察，腫塊切除后病理檢查確定為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，免疫組化檢測(cè)ER受體陽性。移植的腫瘤細(xì)胞保持了人類乳腺癌腫瘤細(xì)胞的病理學(xué)特征，為基礎(chǔ)研究、臨床治療和療判斷提供了可靠工具。

本實(shí)驗(yàn)的失敗之處是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物裸小鼠容易出現(xiàn)死亡。我們每天觀察裸鼠3次，下午觀察時(shí)裸鼠并沒有明顯不適表現(xiàn)，可是第2天上午去查看時(shí)卻出現(xiàn)死亡裸鼠，我們與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心專家研討，沒有找到明確原因和解決辦法。初步考慮如下幾種可能:①疾病因素。由于我們沒有對(duì)死亡裸鼠進(jìn)行尸體解剖，目前尚不能證實(shí)。②飼料污染。我們購(gòu)買的是包裝好的經(jīng)過輻射滅菌的飼料，符合飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)。③荷瘤對(duì)裸鼠的影響。目前尚無實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持，下一步，我們將建立對(duì)照組，以了解荷瘤對(duì)裸鼠生存時(shí)間的影響。研究如何降低裸鼠死亡率是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中需要探討的一個(gè)重要課題。

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