外周血清趨化因子IP-10和Fractalkine及其受體在早期診斷移植腎急性排斥反應(yīng)的應(yīng)用

劉一帆，蘇澤軒，張 清，石利平，程云華(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院泌尿外科，廣州 50700;暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科;通訊作者，E-mail:suz008@6．com)

終末期腎病的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示全球腎替代治療已超140萬(wàn)人次，且每年以7%的比例增長(zhǎng)［1］，我國(guó)慢性腎臟病的總患病率高達(dá)10．8%［2］，雖然目前國(guó)內(nèi)大中心1年移植腎存活率已普遍超過(guò)95%，但10年生存率只為50%［3］。腎移植的預(yù)后主要取決于是否發(fā)生急性或慢性排斥反應(yīng)，如何提高腎移植術(shù)后排斥反應(yīng)的診斷水平，成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。KDIGO指南指出發(fā)生急性排斥反應(yīng)時(shí)，在不延誤治療的前提下，應(yīng)在治療前先行移植腎活檢，腎活檢仍是目前急性排斥反應(yīng)診斷的主要方法［4］，但作為有創(chuàng)檢查，存在術(shù)后移植腎血腫、破裂及感染等各種潛在并發(fā)癥，且不宜短期內(nèi)重復(fù)檢查，加上檢查費(fèi)用及患者的接受程度等因素制約了腎活檢的常規(guī)開(kāi)展。近年研究顯示，在外周血、尿中新型標(biāo)記物及基因檢測(cè)在無(wú)創(chuàng)診斷腎移植急性排斥反應(yīng)的應(yīng)用中有著廣闊的前景。有研究顯示，部分趨化因子及其受體在腎移植過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。早期研究表明，趨化因子家族中的 CXCL10/IP-10及受體 CXCR3和Fractalkine及受體CX3CR1，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，并作用于 T、B、NK 細(xì)胞［5－7］，這些細(xì)胞的活化是移植免疫進(jìn)入特異性反應(yīng)階段的前提，故兩者與移植腎的急性排斥有著密切聯(lián)系。

本試驗(yàn)通過(guò)監(jiān)測(cè)同種異體腎移植患者外周血中Fractalkine，IP-10及其受體表達(dá)在術(shù)后的動(dòng)態(tài)變化，研究它們與急性排斥(AR)的相關(guān)性，探討其在腎移植AR早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1．1 臨床資料

前瞻性地收集2009－10～2012～03在暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院因終末期腎病需行同種異體腎移植術(shù)的住院患者52例，男女比例為1．3∶1(男性30名，女性22名)，平均年齡(49．6 ±9．9)歲(28－66歲)。平均冷缺血時(shí)間(3．6±1．5)h。原發(fā)病均為慢性腎小球腎炎、糖尿病腎病、慢性腎功能不全(尿毒癥期)。供、受者血型相同40例，血型不同但符合輸血原則12例。

1．2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①因終末期腎病在本中心行同種異體腎移植的患者。②術(shù)后免疫抑制劑使用方案符合KDIGO(Kidney Disease Improving Global Outcomes，改善全球腎臟病組織)指南。③向患者及家屬解釋并接受簽署知情同意書(shū)。

1．3 排除標(biāo)準(zhǔn)

①伴隨有其他感染性疾病或者惡性腫瘤病史。②術(shù)后出現(xiàn)明顯的外科并發(fā)癥。

1．4 分組

根據(jù)術(shù)后臨床表現(xiàn)、輔助檢查及移植腎穿刺病理學(xué)檢查結(jié)果，在排除感染及其他干擾因素后(2例男性患者因術(shù)后感染排除在外)分為2組:AR組(n=15)均發(fā)生在移植后住院期間，AR組確診是急性排斥的時(shí)間為平均術(shù)后4．8 d(4－7 d);非AR組(n=35)。健康志愿者12例，作為正常對(duì)照組。

1．5 術(shù)后免疫抑制方案

腎移植術(shù)后，采用標(biāo)準(zhǔn)的三聯(lián)維持免疫抑制:鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑(他克莫司:低谷濃度5－10 ng/ml，或環(huán)孢素:低谷濃度200－300 ng/ml)、霉酚酸酯或硫唑嘌呤、強(qiáng)的松(移植后一個(gè)月內(nèi)劑量從80 mg/d逐漸減少到10 mg/d)，7 d后根據(jù)血藥濃度調(diào)整他克莫司或者環(huán)孢素A劑量。一旦診斷急性排斥后，采用3 d甲基強(qiáng)的松龍沖擊治療［6－10 mg/(kg·d)］。

1．6 樣本收集

所有腎移植患者均常規(guī)于術(shù)前1 d以及術(shù)后1，3，5，9 d采集外周血2－3 ml，12 例健康對(duì)照組血清來(lái)自我院體檢中心，所有血標(biāo)本都在10 min，3 000 r/min設(shè)置下離心，取血清保存在－80℃液氮灌中，以便后續(xù)統(tǒng)一檢測(cè)。

1．7 急性排斥診斷標(biāo)準(zhǔn)

以移植腎穿刺活檢病理診斷為依據(jù)。

1．8 外周血CXCL10/IP-10及受體CXCR3和Fractalkine及受體CX3CR1的檢測(cè)

采用雙抗體夾心ELISA方法，試劑盒購(gòu)自廣州威佳科技有限公司，華美試劑盒(產(chǎn)品編號(hào):CSBE09942h/Lot:J21012596;CSB-E08850h/Lot:J19012597;CSB-E04558h/Lot:J06012595; CSB-E08181h/Lot:J19012594)，酶標(biāo)儀(南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司，DG5033A型);嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。

1．9 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2．1 一般特征資料

50例入選患者的年齡、體重、性別、冷缺血時(shí)間、并發(fā)癥、HLA錯(cuò)配、免疫抑制藥物使用等情況見(jiàn)表1，兩組間的基線資料均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05)。

2．2 移植前后兩組患者外周血血清IP-10以及CXCR3表達(dá)的比較

正常人血中IP-10和CXCR3的濃度分別為(66．74 ±11．77)pg/ml和(583．99 ±157．21)pg/ml。腎移植術(shù)后，AR組(n=15)中有13例患者可觀察到IP-10以及CXCR3的表達(dá)較術(shù)前上升，并明顯高于正常對(duì)照組(P＜0．05)，AR組的IP-10在術(shù)后5 d內(nèi)顯著高于 NAR組，CXCR3在術(shù)后各個(gè)檢測(cè)點(diǎn)均顯著高于非急性排斥組(non-acuterejection，NAR)。而術(shù)后NAR組Fractalkine和CX3CR1移植前后的變化不大，且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05，見(jiàn)表2)。另外，AR組的標(biāo)記物的表達(dá)與時(shí)間呈正相關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中以CXCR3的相關(guān)系數(shù)(r)較大，達(dá) 0．70。

表1 入選的AR組與NAR組患者基線特征比較Table 1 Demographic characteristics of AR and NAR patients

2．3 移植前后兩組患者的外周血清的Fractalkine以及CX3CR1表達(dá)的比較

正常人外周血中Fractalkine及其受體CX3CR1的濃度分別為(1 250．96 ±230．68)pg/ml、(241．85±53．39)pg/ml。術(shù)前兩組的Fractalkine及其受體并無(wú)顯著性差異，但兩者與正常對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0．05)。

腎移植術(shù)后，AR組(n=15)中有14例患者可觀察到Fractalkine及其受體CX3CR1的表達(dá)均有不同程度的上升，術(shù)后AR組的CX3CR1在術(shù)后1，3，5，9 d均比 NAR 組高(P ＜0．05)，而 Fractalkine在術(shù)后第5天顯著高于NAR組，另外，我們觀察到其中有3例AR患者在術(shù)后血肌酐與術(shù)前對(duì)比升高不明顯，但Fractalkine以及CX3CR1的表達(dá)已經(jīng)明顯較前升高。同樣，NAR組Fractalkine和CX3CR1表達(dá)在移植前后無(wú)明顯變化，見(jiàn)表2。AR組的Fractalkine及CX3CR1的高表達(dá)與時(shí)間均呈正相關(guān)(P＜0．05)，兩者相關(guān)系數(shù)分別為 0．45 和 0．56。

表2 腎移植AR組和NAR組患者血清趨化因子及受體的表達(dá)(±s，pg/ml)Table 2 Serum levels of chemokines and their receptors in AR and NAR groups(±s，pg/ml)

表2 腎移植AR組和NAR組患者血清趨化因子及受體的表達(dá)(±s，pg/ml)Table 2 Serum levels of chemokines and their receptors in AR and NAR groups(±s，pg/ml)

與 NAR 組比較，*P＜0．05

指標(biāo) 組別 術(shù)前1 d 術(shù)后1 d 術(shù)后3 d 術(shù)后5 d 術(shù)后9 d Fractalkine AR 組 1 629．29 ±201．05 1 801．98 ±262．99*1 865．46 ±237．51*2 046．43 ±234．46* 1 643．65 ±310．54*NAR 組 1 493．69 ±209．98 1 465．97 ±264．90 1 487．15 ±263．57 1 544．72 ±264．24 1 588．53 ±240．47 CX3CR1 AR 組 356．24 ±77．77 379．48 ±70．47* 398．34 ±80．49* 402．04 ±47．09* 473．54 ±86．49*NAR 組 325．61 ±55．43 309．86 ±63．78 310．24 ±63．12 365．51 ±74．26 290．42 ±65．42 IP-10 AR 組 94．72 ±34．98 107．49 ±34．99* 114．24 ±26．95* 175．84 ±64．25* 113．13 ±19．04*NAR 組 83．31 ±14．93 80．17 ±16．S63 99．75 ±20．94 103．43 ±20．66 102．08 ±20．70 CXCR3 AR 組 755．68 ±154．22 821．69 ±134．73*1 174．47 ±173．21*2 122．99 ±216．10*1 489．70 ±518．03*NAR 組 661．68 ±120．95 674．73 ±135．29 691．12 ±143．69 718．26 ±164．13 449．38 ±145．47 Scr AR 組 599．3 ±18．00* 635．14 ±19．73* 679．43 ±23．41* 573．6 ±21．30* 599．98 ±33．54 NAR 組 507．11 ±55．29 426．73 ±73．66 345．54 ±104．05 218．3 ±135．30 586．88 ±48．43

2．4 激素沖擊治療對(duì)外周血中IP-10及Fractalkine及其受體的表達(dá)的影響

患者確診為急性排斥均在術(shù)后4－7 d，在激素沖擊治療2－3 d后，AR組8例患者血肌酐、IP-10及Fractalkine及其受體的表達(dá)與確診當(dāng)天相比均有不同程度的下降，其中以CXCR3、IP-10為著，以在術(shù)后9 d最明顯，表明這些患者為激素治療敏感，但與非AR組比較，差異仍有顯著性。此外，2例患者治療后所有指標(biāo)無(wú)下降，表明為激素耐藥，改用OKT3(抗CD3 細(xì)胞單克隆抗體)治療［0．1 mg/(kg·d)］。

2．5 趨化因子及其受體在預(yù)測(cè)腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)準(zhǔn)確度的ROC分析

由于AR組的四個(gè)指標(biāo)在術(shù)后1 d的數(shù)值均顯著高于NAR組，故本文分別采用四個(gè)指標(biāo)在術(shù)后1 d的數(shù)據(jù)與是否發(fā)生急性排斥反應(yīng)做ROC曲線分析，結(jié)果見(jiàn)表3、圖1－2。IP-10在預(yù)測(cè)急性排斥反應(yīng)的 AUC 值為0．74(95%CI 0．57－0．91)，而 Fractakine則為0．75(95%CI 0．61－0．89)，兩者比較并無(wú)顯著性差異。分別聯(lián)合IP-10與Fractakine、CX CR3與CX3CR1再次行ROC曲線分析，結(jié)果顯示:兩者聯(lián)合后預(yù)測(cè)急性排斥反應(yīng)的AUC值分別提高至0．86(95%CI 0．77－0．96)和 0．83(95%CI 0．70－0．96)。

表3 標(biāo)記物單獨(dú)及聯(lián)合在預(yù)測(cè)腎移植急性排斥反應(yīng)的ROC分析結(jié)果匯總Table 3 Results of ROC curve analysis of single or combined detection of chemokines for acute rejection

圖1 IP-10、Fractalkine單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)腎移植急性排斥反應(yīng)的ROC曲線Figure 1 ROC curve analysis of IP-10 and Fractalkine alone or in combination for predicting acute rejection

3 討論

生物標(biāo)記物的重要性在臨床實(shí)踐中不言而喻。在器官移植領(lǐng)域中，生物學(xué)標(biāo)記物的應(yīng)用尚處在摸索初始階段。在同種異體腎移植術(shù)后，移植物的功能多通過(guò)血肌酐、尿量、臨床表現(xiàn)或者一些免疫性指標(biāo)監(jiān)測(cè)，由于缺乏特異性，這些指標(biāo)都不能成為反映移植腎免疫狀態(tài)的標(biāo)記物。近年來(lái)一些關(guān)于新型生物標(biāo)記物在移植領(lǐng)域的研究結(jié)果提示，在早期預(yù)測(cè)急性排斥中有較高的特異性和敏感性，它將指導(dǎo)我們臨床更合理、準(zhǔn)確地使用免疫抑制劑。

圖2 CXCR3、CX3CR1單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)在預(yù)測(cè)腎移植急性排斥反應(yīng)的ROC曲線Figure 2 ROC curve analysis of CXCR3，CX3CR1 alone or in combination for predicting acute rejection

急性移植腎排斥是腎移植術(shù)后最常見(jiàn)的并發(fā)癥，急性排斥的嚴(yán)重程度和治療效果對(duì)移植物的長(zhǎng)期存活有直接的影響。急、慢性移植物損傷常伴有白細(xì)胞的浸潤(rùn)，炎性細(xì)胞的刺激，最終發(fā)生纖維化。目前研究顯示，趨化因子作為非選擇性或特定角色在動(dòng)物移植實(shí)驗(yàn)，甚至在人體試驗(yàn)都顯示出巨大的潛力，其在腎移植過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。趨化因子作為白細(xì)胞因子超家族，具有內(nèi)源性白細(xì)胞趨化性，是一類具有活性化作用的堿基—肝素結(jié)合性蛋白質(zhì)的總稱，其功能主要是作為各種粒細(xì)胞的化學(xué)誘導(dǎo)劑，使之從血漿聚集于感染或損傷的部位，并發(fā)揮抗炎功能，同時(shí)趨化因子也具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)活性的功能，如淋巴細(xì)胞的活化、黏附和脫顆粒等，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答［8，9］。早期研究表明，CC類的趨化因子 (包括 CCL2/MCP-1，CCL5/RANTES，CCL3/MIP-1a，CCL4/MIP-1B)以及其相應(yīng)受體(CCR1，CCR2，CCR5)在急性人體移植物排斥反應(yīng)上調(diào)［10，11］。而本文通過(guò)檢測(cè)同種異體腎移植患者外周血中IP-10、Fractalkine及其受體表達(dá)，探討其在預(yù)測(cè)腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的應(yīng)用價(jià)值。

早前研究指出IP-10的mRNA以及其表達(dá)的蛋白質(zhì)可以預(yù)測(cè)移植物功能［12］。而Hoffmann等指出CXCR3陽(yáng)性染色比例在急性腎間質(zhì)及血管排斥中明顯升高，而無(wú)排斥的移植物活檢則無(wú)明顯變化［13］。Tatapudi等研究結(jié)果顯示，IP-10以及其受體CXCR3在腎移植排斥反應(yīng)中的mRNA的表達(dá)升高，其敏感度以及特異度分別為 100%、78%，以及63%、83%［14］。而本研究結(jié)果顯示，腎移植術(shù)后，AR組的外周血IP-10以及CXCR3的表達(dá)均有逐漸上升趨勢(shì)，與時(shí)間呈正相關(guān)(P＜0．05)，兩者在術(shù)后第5天達(dá)到高峰。另外，我們觀察到一些最終確診為AR患者在早期排斥臨床表現(xiàn)不典型，肌酐與基線對(duì)比升高不明顯或者蛋白尿陰性的情況下，仍可觀察到IP-10及其受體的升高。ROC分析結(jié)果表明，IP-10、CXCR3對(duì)預(yù)測(cè)腎移植急性排斥反應(yīng)的準(zhǔn)確度分別達(dá)到0．74和0．75，兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)AR的準(zhǔn)確度可提升至0．86，當(dāng)以1 619．17 pg/ml為閾值，敏感度、特異度分別為 80．0%，76．4%，綜合診斷價(jià)值較高。

Fractalkine存在于腎小血管內(nèi)皮、近端腎小管上皮［15］，F(xiàn)ractalkine分為膜結(jié)合以及游離兩種形式，前者作為黏附分子促發(fā)后續(xù)白細(xì)胞面受體CX3CR1的表達(dá)，使NK細(xì)胞或者單核細(xì)胞結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)移植物排斥反應(yīng)的發(fā)生［16］。而游離的Fractalkine同樣在排斥過(guò)程中起到類似作用。受體CX3CR1的缺乏可致NK細(xì)胞的減少?gòu)亩鸬奖Ｗo(hù)移植物的作用［17］，F(xiàn)ractalkine及其受體在排斥反應(yīng)中角色不容忽視。目前Fractalkine在心臟移植領(lǐng)域的應(yīng)用已得到一定認(rèn)識(shí)［16，17］，而本研究發(fā)現(xiàn)Fractalkine及其受體CX3CR1數(shù)值顯著高于正常對(duì)照組，而術(shù)后AR組兩者表達(dá)顯著高于NAR組，AR組標(biāo)記物的表達(dá)隨著時(shí)間推移而遞增，在術(shù)后第5天達(dá)到高峰。ROC曲線結(jié)果顯示:當(dāng)Fractalkine及CX3CR1分別以 1 519．35 pg/ml，361．51 pg/ml為臨界點(diǎn)時(shí)，敏感度/特異度分別為 73．3%/65．0%，66．7%/80．0%。Wang等約300例樣本量的研究結(jié)果顯示，F(xiàn)ractalkine在判斷腎移植術(shù)后出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)的AUC達(dá)到0．83(95%CI 0．770－0．899)，而且其很好地鑒別急性排斥反應(yīng)患者是否耐受激素［18］。而本研究結(jié)果顯示:Fractakine的 AUC則為 0．75(95%CI(0．61－0．89)，而CX3CR1 則為0．72(95%CI 0．56－0．88)，比Wang等的研究結(jié)果稍低，且可信區(qū)間較大，可能與本研究納入例數(shù)較少有關(guān)。

由于 IP-10、Fractakine與相應(yīng)的受體 CXCR3、CX3CR1存在較強(qiáng)的相關(guān)性，故我們采用分別聯(lián)合IP-10與Fractakine、CXCR3與CX3CR1再次行ROC曲線分析，結(jié)果顯示:兩者預(yù)測(cè)急性排斥反應(yīng)的AUC 值分別提高至 0．86(95%CI 0．77－0．96)、0．83(95%CI 0．70－0．96)，大于它們各自預(yù)測(cè)的AUC，這提示我們聯(lián)合這些指標(biāo)評(píng)價(jià)腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)發(fā)生價(jià)值更好。

大部分AR患者經(jīng)激素沖擊治療2－3 d后，在患者臨床癥狀好轉(zhuǎn)以及血肌酐出現(xiàn)下降的同時(shí)，IP-10、Fractakine及其受體水平均出現(xiàn)不同程度的下降，提示這些生物標(biāo)記物可能用來(lái)判斷免疫抑制治療的療效，同時(shí)也表明后續(xù)的激素沖擊治療對(duì)免疫排斥反應(yīng)可能具有逆轉(zhuǎn)作用。

本研究局限性在于由于觀察時(shí)間較短，一些AR患者在第9天的生物標(biāo)記物仍未有顯著性下降，而且大部分AR組的數(shù)值仍顯著高于NAR組，這些因子是否持續(xù)維持高位水平，以及這些因子長(zhǎng)期如何變化仍有待進(jìn)一步的研究跟蹤。

目前，雖然各種新型免疫抑制劑的使用已經(jīng)大大改變了腎移植的預(yù)后，但是在移植腎功能在未嚴(yán)重受損的情況下，及時(shí)、準(zhǔn)確地診斷出急性排斥反應(yīng)并治療，延長(zhǎng)移植腎的存活時(shí)間仍為移植科的重要研究方向。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)腎移植術(shù)后出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)的患者在早期臨床表現(xiàn)不典型，血清肌酐不升高的情況下，仍可觀察到血清中IP-10及受體CXCR3、Fractalkine及受體CX3CR1顯著地增高，且與時(shí)間呈正相關(guān)，IP-10聯(lián)合Fractalkine在預(yù)測(cè)AR的總準(zhǔn)確度達(dá)到0．86，這對(duì)于指導(dǎo)臨床及時(shí)采取進(jìn)一步檢查如移植腎穿刺活檢，避免延誤治療時(shí)機(jī)有著重要意義，而且檢測(cè)樣本收集簡(jiǎn)單、快捷，故上述趨化因子及其受體有望成為腎移植急性排斥反應(yīng)的新型無(wú)創(chuàng)檢測(cè)方法。

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