Wnt信號(hào)通路中β-catenin、GSK3β及Lef-1在卵巢癌中的表達(dá)及其意義

郭玉霞，馬利國，陳遞林，李明娥，石麗云，葉芷芬，鄭繪霞(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，深圳市人民醫(yī)院婦科，深圳 5800;山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科)

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤，近幾年來死亡率已位居女性生殖系統(tǒng)腫瘤的首位。卵巢癌的發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，多數(shù)研究認(rèn)為其可能與多種作用機(jī)制有關(guān)。近期研究發(fā)現(xiàn)，Wnt通路中信號(hào)成分的改變?cè)诼殉舶┑陌l(fā)生過程中起著重要作用。本研究主要檢測Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中β-catenin、GSK3β及Lef-1在卵巢上皮性腫瘤中的表達(dá)及三指標(biāo)在卵巢腫瘤中的相互作用關(guān)系，探討Wnt信號(hào)通路在卵巢癌發(fā)病的作用機(jī)制，為卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 組織標(biāo)本

收集暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院(深圳市人民醫(yī)院婦科)及山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科2003－02～2014－08正常卵巢上皮組織、卵巢良性腫瘤以及卵巢癌組織標(biāo)本共218例，其中正常組織30例，卵巢漿液性囊腺瘤45例，黏液性囊腺瘤49例，漿液性囊腺癌51例，黏液性囊腺癌43例，年齡29－76歲，平均年齡53歲。所有標(biāo)本經(jīng)過兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的高級(jí)職稱病理專家診斷。

1．2 藥物與試劑

兔抗人 β-catenin多克隆抗體(工作濃度1∶100)，鼠抗人 GSK3β 單克隆抗體(工作濃度1∶100)，鼠抗人 Lef-1單克隆抗體(工作濃度1∶100)和DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1．3 免疫組織化學(xué)

采用EnVision法檢測β-catenin、GSK3β及Lef-1的表達(dá)。所有石蠟標(biāo)本4 μm連續(xù)切片，DAB顯色。卵巢癌組織染色設(shè)陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，陰性對(duì)照采用PBS液代替一抗。

結(jié)果判定:β-catenin在細(xì)胞膜陽性，胞質(zhì)或核中可出現(xiàn)陽性表達(dá);GSK3β在細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒為陽性染色;Lef-1則以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色散在顆粒為陽性。高倍顯微鏡(400×)下隨機(jī)觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算百分比，1分為陽性細(xì)胞1%－25%，2分為26%－50%，3分為51%－75%，4分為76%－100%。染色強(qiáng)度分為無(0分)，弱陽性(1分)，中等陽性(2分)，強(qiáng)陽性(3分)。二者相乘＞3分為陽性，≤3分為陰性。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 15．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)比較行χ2檢驗(yàn)，P＜0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 β-catenin在卵巢組織及卵巢腫瘤中的表達(dá)

β-catenin在腺癌中的表達(dá)(見圖1)明顯高于正常卵巢組織和卵巢良性腺瘤，差異有顯著性意義(P＜0．05);β-catenin的表達(dá)與腺癌的類型無關(guān)(P＞0．05)，無論是漿液性還是黏液性腺癌，β-catenin表達(dá)只與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FIGO分期有關(guān)(P＜0．05)，而與腫瘤分級(jí)無關(guān)(P ＞0．05，見表1，2)。

表1 β-catenin、GSK3β及Lef-1在組織中的表達(dá)情況Table 1 The expression of β-catenin，GSK3β and Lef-1 in different ovian tissues

表2 β-catenin、GSK3β及Lef-1在癌組織中與臨床參數(shù)的比較Table 2 Relationship between expression of β-catenin，GSK3β and Lef-1 and clinicopathological parameters in cancer tissues

2．2 GSK3β在卵巢組織及卵巢腫瘤中的表達(dá)

GSK3β同樣在腺癌中的表達(dá)(見圖2)明顯高于其他良性腺瘤及正常卵巢組織，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);GSK3β表達(dá)與腺癌的類型無關(guān)(P＞0．05)，與腫瘤分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FIGO分期有關(guān)(P ＜0．05，見表1，2)。

2．3 Lef-1在卵巢組織及卵巢腫瘤中的表達(dá)情況

Lef-1在腺癌中的表達(dá)(見圖3)明顯高于正常卵巢組織和卵巢良性腺瘤(P＜0．05);Lef-1中的表達(dá)與腺癌的類型無關(guān)(P＞0．05)，不論是漿液性還是黏液性腺癌，Lef-1表達(dá)只與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FIGO分期有關(guān)(P ＜0．05)，與腫瘤分級(jí)無關(guān)(P ＞0．05，見表1，2)。

2．4 β-catenin與GSK3β及Lef-1在卵巢癌中的相關(guān)性比較

由表3可見，相關(guān)性分析顯示，β-catenin與GSK3β 存在正相關(guān)(r=0．623，P=0．001)，與 Lef-1之間同樣存在正相關(guān)(r=0．421，P=0．001)。

表3 β-catenin與GSK3β及Lef-1在卵巢癌中的相關(guān)性比較 (例)Table 3 Correlation between β-catenin，GSK3β and Lef-1 in human ovarian carcinoma (cases)

圖1 β-catenin在漿液性及黏液性腺癌中的表達(dá)(EnVision，×100)Figure 1 Expression of β-catenin in serous and mucous adenocarcinoma(EnVision，×100)

3 討論

圖2 GSK3-β在漿液性腺癌及黏液性腺癌中的表達(dá)(EnVision，×100)Figure 2 Expression of GSK3-βin serous and mucous adenocarcinoma(EnVision，×100)

圖3 Lef-1在漿液性及黏液性腺癌中的表達(dá)(EnVision，×100)Figure 3 Expression of Lef-1 in serous and mucous adenocarcinoma(EnVision，×100)

Wnt信號(hào)通路是一條較為復(fù)雜且保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在調(diào)控胚胎發(fā)育、參與細(xì)胞增殖分化及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中都起著重要的作用［1］。研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路中某些成分的改變?cè)诼殉舶┑陌l(fā)生過程中起著重要的作用。β-catenin是Wnt信號(hào)通路的核心分子，參與了多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［2，3］。Wnt信號(hào)通路的異常激活是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因，而β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)的大量積聚是Wnt信號(hào)通路被異常激活的關(guān)鍵因素，β-catenin的蓄積是腫瘤形成的重要原因。GSK3β是β-catenin的上游調(diào)節(jié)因子，可與APC和Axin形成復(fù)合體，從而使β-catenin發(fā)生磷酸化，最終β-catenin被降解，進(jìn)入胞質(zhì)及胞核，并參與轉(zhuǎn)錄過程，引發(fā)細(xì)胞周期的的失控，最后導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展［4－6］。

在肝細(xì)胞癌的研究中通過干擾及轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可通過調(diào)節(jié) GSK3β的表達(dá)來參與肝癌的發(fā)生發(fā)展［7］。在子宮內(nèi)膜癌的研究中發(fā)現(xiàn)，β-catenin和GSK3β二者在癌組織中的表達(dá)明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織，且與內(nèi)膜癌的類型無關(guān)，而與組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、肌層浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，二者表達(dá)之間有顯著相關(guān)性，且二者過表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)［8］。

本研究表明，β-catenin及GSK3β蛋白在卵巢腫瘤中的表達(dá)明顯高于正常卵巢組織，但在良性腺瘤中的表達(dá)低于腺癌中的表達(dá)，即正常組織、腺瘤組織、癌組織中表達(dá)順序?yàn)橹饾u增高，癌組織中最高，β-catenin和GSK3β蛋白三者間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在癌組織中的比較發(fā)現(xiàn)，β-catenin及GSK3β蛋白表達(dá)與腺癌的類型無關(guān)，β-catenin與腫瘤分級(jí)無關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FIGO分期有關(guān)，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FIGO分期高者表達(dá)增高;GSK3β則與三者均有關(guān)，高級(jí)別、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移及FIGO分期高的病例GSK3β高表達(dá)。相關(guān)性分析顯示，β-catenin與GSK3β之間存在正相關(guān)，表明 β-catenin和 GSK3β在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著一定的作用，且二者對(duì)腫瘤的發(fā)展存在正調(diào)節(jié)作用，二者的高表達(dá)可能是腫瘤惡性進(jìn)展的標(biāo)志。

Lef-1是淋巴增強(qiáng)因子家族成員，是 Wnt/βcatenin信號(hào)通路關(guān)鍵的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，Lef-1在胚胎發(fā)育過程中起著重要的作用，其表達(dá)及功能異常是導(dǎo)致胚胎發(fā)育畸形的重要因素，Lef-1表達(dá)于多種組織細(xì)胞，其表達(dá)增高與惡性腫瘤有關(guān)［9，10］。但 βcatenin本身并不能與DNA結(jié)合，而是需要與DNA結(jié)合蛋白作用包括Lef-1的參與，在細(xì)胞核內(nèi)共同完成調(diào)控靶基因的表達(dá)［11］，因此二者在腫瘤中的作用值得關(guān)注。

在宮頸癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，LEF-1被成功轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)β-catenin依賴的細(xì)胞株，細(xì)胞增殖能力及速度增強(qiáng)，凋亡水平降低，表明二者在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起了重要的作用［12］。本研究結(jié)果顯示，LEF-1在癌組織中的表達(dá)明顯高于良性腺瘤及正常組織，且與腺癌的類型無關(guān)，只與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FIGO分期有關(guān)，可見LEF-1在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中有一定的作用，并且可能是其惡性進(jìn)展的標(biāo)志。相關(guān)性分析顯示，β-catenin與LEF-1表達(dá)之間存在正相關(guān)，表明二者能夠持續(xù)Wnt信號(hào)通路，從而激活一系列靶基因引起細(xì)胞的持續(xù)增殖及惡性進(jìn)展。

Wnt信號(hào)通路本身是一個(gè)復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)，βcatenin在其中參與著重要的作用，我們的研究證實(shí)β-catenin、GSK3β及LEF-1在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，可能是其惡性進(jìn)展的標(biāo)志，是判斷卵巢癌生物學(xué)行為的重要指標(biāo)，但具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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