VEGF-C和CCBE1在子宮內(nèi)膜異位癥組織中的表達與意義

楊永康，張淼芳，李 峰，席穩(wěn)燕(陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，咸陽 7000;西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科;西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科;通訊作者，E-mail:xveyyk004@6．com)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)的發(fā)病率近年來隨著剖宮產(chǎn)率、人工流產(chǎn)與宮腹腔鏡操作的增多逐年增高，且與社會經(jīng)濟狀況呈正相關(guān)［1］。子宮內(nèi)膜異位癥具有多樣性表現(xiàn)，在組織學(xué)上呈現(xiàn)良性表現(xiàn)，但卻有增生、侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等類似惡性腫瘤的特征。目前在臨床上對于子宮內(nèi)膜異位癥的治療效果并不理想，主要原因是其發(fā)病機制目前還不是很清楚，所以只能是對癥治療，而不能做到對因治療［2，3］。

隨著研究的深入，學(xué)者對于子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制提出了很多的假說，其中異位種植學(xué)說目前被眾多學(xué)者所接受。異位種植假說認為子宮內(nèi)膜異位癥患者體內(nèi)具有黏附、侵襲及血管新生等生物學(xué)功能的子宮內(nèi)膜是異位種植的根本。近年來研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)與膠原和鈣結(jié)合EGF域1(collagen and calcium binding EGF domains 1，CCBE1)的結(jié)合有誘導(dǎo)淋巴管的生成和促進腫瘤細胞淋巴轉(zhuǎn)移的作用［4，5］，其在子宮內(nèi)膜異位癥組織中的表達如何，是否也參與了子宮內(nèi)膜異位癥的病理生理過程，目前研究還很少。

1 材料與方法

1．1 研究對象

選取2013－03～2013－11在西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科腹腔鏡中心行手術(shù)、病理檢查確診的子宮內(nèi)膜異位癥(卵巢型)的患者共36例;取同一患者的在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜，并將其分為在位內(nèi)膜組和異位內(nèi)膜組。在位內(nèi)膜組增殖期20例，分泌期16例;異位內(nèi)膜組增殖期33例，分泌期3例。對照組為同期因子宮肌瘤行手術(shù)、病理檢查確診為非子宮內(nèi)膜異位癥的患者共40例，取其新鮮內(nèi)膜組織，增殖期22例，分泌期18例。所有研究對象術(shù)前3月內(nèi)無激素使用史。

1．2 實驗主要試劑和儀器

兔抗人CCBE1、VEGF-C單克隆抗體及HRP標記的羊抗兔二抗均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。RNA提取試劑盒購自上海飛捷，cDNA反轉(zhuǎn)試劑盒購自TAKARA公司。Trizol、氯仿、75%乙醇等均購于西安交通大學(xué)試劑科。OLYMPUS倒置顯微鏡、Bio-Teck多功能酶標儀、水浴鍋、Bio-Rad CF96 QPCR系統(tǒng)、Bio-Rad PCR儀、電熱恒溫干燥箱、普通離心機、水平離心機、離心管、吸管、加樣槍及其槍頭、微量振蕩器均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部中心實驗室提供。CCBE1、VEGF-C及β-actin引物均購自蘇州金唯智公司。

1．3 方法

1．3．1 免疫組化 將術(shù)中取得的子宮內(nèi)膜及卵巢型子宮內(nèi)膜異位囊腫壁浸泡于10%中性甲醛，常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋及切片處理。在實驗前，在鏡下觀察組織形態(tài)進行篩查。采用免疫組化兩步法:常規(guī)脫蠟、水化組織切片，3%H2O2室溫下孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性;抗原行熱修復(fù)處理后加入適當稀釋的一抗，4℃過夜;滴加HRP標記的羊抗兔二抗，37℃孵育20 min;DAB(二氨基聯(lián)苯胺)顯色，蘇木素復(fù)染、鹽酸分化、氨水返藍后封片。同時設(shè)空白對照，滴加PBS替代一抗。顯微鏡下觀察并拍照，Image pro軟件對免疫組化各標本圖像進行光密度檢測。

1．3．2 組織mRNA提取 正常內(nèi)膜組織、在位內(nèi)膜組織和異位內(nèi)膜組織各10例，前兩者中增殖期和分泌期各5例。將組織剪成小塊在液氮中磨成粉末后加入盛有Trizol液的EP管中，室溫放置5 min。加入200 μl氯仿，蓋緊EP管并劇烈搖蕩15 s。12 000 r/min離心10 min，取上層于一新的EP管中，加入500 μl異丙醇，混勻。室溫放置 10 min，12 000 r/min離心10 min。棄上清液，加入1 ml的75%乙醇，渦旋混勻，4℃下12 000 r/min離心5 min。重復(fù)操作一次，棄去上清液，室溫干燥5－10 min。用30 μl DEPC處理過的水將RNA溶解，分光光度計定量。

1．3．3 反轉(zhuǎn)錄及 PCR 反轉(zhuǎn)20 μl體系:200 μl EP中加入4 μl 5X TAKARA反轉(zhuǎn) MIX，加入1 000 ng RNA，無酶水將體系補充至20 μl。Bio-Rad PCR 儀反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。25 μl PCR 體系:12．5 μl SYBGREEN，8．5 μl雙蒸水，上下游引物各1 μl，2 μl cDNA。于RT-PCR儀中40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)部對照。

表1 引物列表Table 1 The primers used in RT-PCR

1．4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用Graphpad prism5及 photoshop7．0對實驗數(shù)據(jù)進行整理并作圖。SPSS19．0統(tǒng)計軟件對各組數(shù)據(jù)進行One-way ANOVA檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 VEGF-C與CCBE1在各內(nèi)膜組織中的表達及分布情況

免疫組化染色顯示，VEGF-C和CCBE1在各內(nèi)膜組織的間質(zhì)細胞與腺上皮細胞中均有表達，且主要定位于細胞質(zhì)(見圖1，2)。

圖1 VEGF-C在各組內(nèi)膜組織的表達Figure 1 The expression and distribution of VEGF-C in different endometria

圖2 CCBE1在各組內(nèi)膜組織的表達Figure 2 The expression and distribution of CCBE1 in different endometria

2．2 VEGF-C在各組織中的表達

免疫組化和RT-PCR結(jié)果均顯示，異位內(nèi)膜組和在位內(nèi)膜組各期中VEGF-C的表達均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05);在位內(nèi)膜組與異位內(nèi)膜組進行比較，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05，見圖3A和B)。在位內(nèi)膜組增殖期和分泌期VEGF-C的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。對照組增殖期和分泌期VEGF-C的表達差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0．05，見圖3C 和 D)。

2．3 CCBE1在各組織中的表達

免疫組化和RT-PCR結(jié)果均顯示，異位內(nèi)膜組中CCBE1的表達明顯高于對照組(P＜0．05)，但低于在位內(nèi)膜組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05);在位內(nèi)膜組中CCBE1表達高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05，見圖4A和B)。在位內(nèi)膜組CCBE1的表達增殖期高于分泌期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05);而對照組增殖期和分泌期CCBE1的表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05，見圖4C和D)。

3 討論

國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜異位癥中VEGF-C可以促進異位內(nèi)膜病灶的形成、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，這一過程中的具體機制認為有兩個方面:促進血管新生［6］和促進淋巴管的生成［7］。CCBE1 作為淋巴管生長因子，雖然研究歷史不長，但備受關(guān)注。在動物實驗和人體組織實驗中發(fā)現(xiàn)，其對于淋巴管的形成有著重要的促進作用。CCBE1的突變或者缺失可以導(dǎo)致淋巴管的發(fā)育異常或者淋巴水腫的等現(xiàn)象［8，9］。

本研究通過免疫組化及RT-PCR方法檢測子宮內(nèi)膜異位癥在位、異位內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜中VEGFC和CCBE1的表達，并初步探討其在子宮內(nèi)膜異位癥的病因—淋巴轉(zhuǎn)移學(xué)說中的意義。結(jié)果發(fā)現(xiàn):VEGF-C在異位內(nèi)膜組和在位內(nèi)膜組中的表達均高于對照組(正常子宮內(nèi)膜)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，前兩者之間無差異;這與國外學(xué)者Takehara等［10］的研究存在差異，他們研究發(fā)現(xiàn)在位內(nèi)膜的VEGF-C表達較對照組下調(diào)，在增殖期和分泌期中VEGF-C的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。CCBE1在異位內(nèi)膜組的表達高于對照組，但低于在位內(nèi)膜組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。研究結(jié)果提示CCBE1和VEGF-C在子宮內(nèi)膜異位癥的在位和異位內(nèi)膜組織中表達均高于對照組，結(jié)合二者的生物學(xué)特性，其可能參與了子宮內(nèi)膜異位癥的病理生理過程。

圖3 VEGF-C在各組內(nèi)膜組織中的表達Figure 3 The expression of VEGF-C in different endometria

圖4 CCBE1在各組內(nèi)膜組織中的表達Figure 4 The expression of CCBE1 in different endometria

Bos等通過對CCBE1基因缺失的大鼠模型觀察發(fā)現(xiàn)，CCBE1其自身對淋巴管生成的作用不大，但能夠顯著增強VEGF-C的表達，進而促進淋巴管生成，并且其作用機制與VEGFR-3磷酸化狀態(tài)修飾無關(guān)［11］。結(jié)合Bos等的研究結(jié)果，我們認為淋巴管生成因子CCBE1和VEGF-C除了本身具備的促進淋巴管生成作用，參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展的病理生理機制外，CCBE1還可以使VEGF-C的促淋巴管生成的作用明顯增強，發(fā)揮更大的效應(yīng)。在位內(nèi)膜的表達高于異位內(nèi)膜，這也與郎景和等提出的“在位內(nèi)膜決定論”相符合，間接印證了在位內(nèi)膜的分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、組織病理學(xué)等的特殊性質(zhì)，將對逆流至子宮腔以外的內(nèi)膜形成子宮內(nèi)膜異位癥起決定作用［12，13］。在位內(nèi)膜組中增殖期的 CCBE1的表達高于分泌期，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示子宮內(nèi)膜異位癥CCBE1的表達可能與卵巢激素的分泌有關(guān)，呈激素依賴性。異位內(nèi)膜組織隨著卵巢周期的變化而發(fā)生增殖期和分泌期的改變，但其并不與在位內(nèi)膜的改變同步，多表現(xiàn)為增殖期改變，且分泌期標本過少，所以本研究未進行對比。

有研究表明，CCBE1和VEGF-C的結(jié)合有誘導(dǎo)淋巴管的生成和促進腫瘤細胞淋巴轉(zhuǎn)移的作用［5］。動物實驗也表明，CCBE1的突變或者缺失可以導(dǎo)致淋巴管的發(fā)育異?；蛘吡馨退[的等現(xiàn)象，且能夠顯著增強 VEGF-C的表達，進而促進淋巴管生成［9，10］。本實驗通過對 CCBE1 和 VEGF-C 在子宮內(nèi)膜異位癥組織中的表達檢測，從淋巴轉(zhuǎn)移學(xué)說進一步探索子宮內(nèi)膜異位癥的病理生理過程。隨著醫(yī)學(xué)科技的發(fā)展及人們對子宮內(nèi)膜異位癥認識的不斷深入，抑制淋巴管的新生和淋巴轉(zhuǎn)移可能成為子宮內(nèi)膜異位癥臨床治療的新方向。

［1］狄文．子宮內(nèi)膜異位癥與子宮腺肌病［M］//謝幸，茍文麗．婦產(chǎn)科學(xué)．8版，北京:人民衛(wèi)生出版社，2013:P268－269．

［2］Kvaskoff M，Mu F，Terry KL，et al．Endometriosis:a high-risk population for major chronic diseases［J］．Hum Reprod Update，2015．21(4):500－516．

［3］Mavrelos D，Saridogan E．Treatment of endometriosis in women desiring fertility［J］．J Obstet Gynaecol India，2015，65(1):11－16．

［4］Goralczyk B，Smolarz B，Romanowicz H，et al．Single nucleotide polymorphisms of VEGF gene in endometriosis［J］．Pol Merkur Lekarski，2012，32(189):151－153．

［5］李文媛，劉艷翠，尹國華，等．喉癌中膠原和鈣結(jié)合EGF域1的表達與VEGF-C和淋巴管生成及預(yù)后的關(guān)系［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，33(9):1160－1164．

［6］郎景和．關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥的再認識及其意義［J］．中國工程科學(xué)，2009，11(10):137－142．

［7］蔣紅清，李亞里，陳浩，等．血管內(nèi)皮生長因子C和受體3在子宮內(nèi)膜異位癥的表達及意義［J］．軍醫(yī)進修學(xué)院學(xué)報，2007，28(2):99－101．

［8］Alders M，Mendola A，Ades L，et al．Evaluation of clinical manifestations in patients with severe lymphedema with and without CCBE1 mutations［J］．Mol Syndromol，2013，4(3):107－113．

［9］Hogan BM，Bos FL，Bussmann J，et al．CCBE1 is required for embryonic lymphangiogenesis and venous sprouting［J］．Nat Genet，2009，41(4):396－398．

［10］Takehara M，Ueda M，Yamashita Y，et al．Vascular endothelial growth factor A and C gene expression in endometriosis［J］．Hum Pathol，2004，35(11):1369－1375．

［11］Bos F L，Caunt M，Peterson-Maduro J，et al．CCBE1 is essential for mammalian lymphatic vascular development and enhances the lymphangiogenic effect of vascular endothelial growth factor-C in vivo［J］．Circ Res，2011，109(5):486－491．

［12］張珂銘，王歡．子宮內(nèi)膜異位癥致病機制研究進展［J］．重慶醫(yī)學(xué)，2011，40(2):192－194．

［13］仝佳麗．子宮內(nèi)膜異位癥的在位內(nèi)膜病變研究進展［J］．現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2010，19(6):465－467．