前列腺癌中NUCB2和caspase-3的表達(dá)及其相關(guān)性

馬敦惠，張晨麗，張 煦(蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)研究所，蘭州 730000;通訊作者，E-mail:zhangxu64@163．com)

前列腺癌(prostate cancer，PC)是一種男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。在我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，成為嚴(yán)重影響到我國(guó)男性健康的泌尿系惡性腫瘤。血清前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen，PSA)是目前臨床上廣泛應(yīng)用的篩查指標(biāo)，但對(duì)檢測(cè)前列腺癌的敏感性和特異性較低。

20世紀(jì)90年代，Kanai等［1］在小鼠及人細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種EF手型鈣結(jié)合蛋白，并將其命名為核組蛋白(nucleobindin-2，NUCB2)。目前發(fā)現(xiàn)NUCB2具有特殊的結(jié)構(gòu)功能，并且是一種癌癥相關(guān)基因，該基因在胃癌、乳腺癌、前列腺癌、腎透明細(xì)胞癌中被相繼報(bào)道。caspase-3是caspases基因家族成員之一，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵激酶，凋亡執(zhí)行的效應(yīng)分子，在不同的腫瘤組織中表達(dá)也不同。NUCB2和caspase-3在前列腺癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)前列腺癌組織中NUCB2和caspase-3的表達(dá)，探討二者表達(dá)的意義，進(jìn)行相關(guān)性分析。

1 材料與方法

1．1 材料

收集解放軍第一醫(yī)院病理科2007－01～2013－12存檔前列腺石蠟標(biāo)本，其中前列腺癌49例、前列腺上皮內(nèi)瘤變33例［低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(LGPIN)14例、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(HGPIN)19例］、良性前列腺增生15例。兩位資深病理醫(yī)師嚴(yán)格復(fù)審所有標(biāo)本。前列腺癌病例組患者年齡61－86歲，平均年齡75．6歲，≥76歲者26例，＜76歲者23例。前列腺癌病例組患者術(shù)前血清前列腺特異性抗原(PSA)水平2．06－89．62 ng/L，平均值為 29．26 ng/L。所有患者術(shù)前均未行放療、化療。前列腺癌病例組進(jìn)行Gleason評(píng)分，其中Gleason評(píng)分為≤5分(高分化)12例，Gleason評(píng)分為6－7分(中分化)16例，Gleason評(píng)分為8－10分(低分化)21例。對(duì)前列腺癌病例組進(jìn)行隨訪，5年內(nèi)死亡19例，5年以上存活30例。所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋后3 nm連續(xù)切片。

1．2 主要試劑

兔抗人NUCB2(nucleobindin2)多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ生物技術(shù)公司;小鼠抗人CPP32(caspase-3)單克隆抗體，SP免疫組化染色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，DAB顯色試劑購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)公司。

1．3 方法

采用免疫組化SP法，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。對(duì)于NUCB2及caspase-3抗體抗原修復(fù)分別采用檸檬酸緩沖液(pH6．0)高壓鍋熱修復(fù)和EDTA(pH8．0)高壓鍋熱修復(fù)。兔抗人NUCB2多克隆抗體，稀釋度為1∶50。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，經(jīng)酒精、二甲苯脫水透明，最后中性樹膠封片。

1．4 結(jié)果判定

NUCB2和caspase-3蛋白陽(yáng)性細(xì)胞染色表現(xiàn)為細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)棕黃色或棕褐色顆粒。根據(jù)每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞染色深度和陽(yáng)性細(xì)胞率分別進(jìn)行分級(jí)計(jì)分。不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，6%－25%為1分，26%－50%為2分，51%－75%為3分，＞75%為4分。然后將染色深度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)兩者得分相乘，0分為陰性(－)，≥1分為陽(yáng)性(+)。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。NUCB2和caspase-3在前列腺癌、前列腺上皮內(nèi)瘤變及良性前列腺增生組織中的表達(dá)差異采用χ2檢驗(yàn)，NUCB2和caspase-3在前列腺癌組織中的表達(dá)相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。以α=0．05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Kaplan-Meier法分析NUCB2表達(dá)與生存期的關(guān)系。

2 結(jié)果

2．1 NUCB2、caspase-3在前列腺癌、前列腺上皮內(nèi)瘤變及良性前列腺增生組織中的表達(dá)

NUCB2主要表達(dá)于腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色至棕褐色(見圖1)。NUCB2在BPH、LGPIN、HGPIN 及PC 組陽(yáng)性率分別為 13．3%，14．3%，15．8%及73．5%。NUCB2在PC組中的陽(yáng)性率明顯高于BPH組、LGPIN組和HGPIN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05，見表 1)。

caspase-3主要表達(dá)于腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)或基底層細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色至棕褐色顆粒狀，也有個(gè)別表達(dá)于胞核上(見圖2)。caspase-3在BPH、LGPIN、HGPIN 及PC 組陽(yáng)性率分別為77．3%，64．3%，42．1%及32．7%。caspase-3在PC組中的陽(yáng)性率明顯低于BPH組、LGPIN組和HGPIN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05，見表1)。

圖1 NUCB2在前列腺癌中的表達(dá)(SP，×200)Figure 1 NUCB2 expression in prostate cancer(SP，×200)

圖2 Caspase-3在前列腺癌中的表達(dá)(SP，×200)Figure 2 Caspase-3 expression in prostate cancer(SP，×200)

2．2 NUCB2和caspase-3的表達(dá)與前列腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

在前列腺癌組織中，NUCB2表達(dá)與患者年齡無(wú)關(guān)(P＞0．05);與Gleason評(píng)分和術(shù)前血清PSA值有關(guān)，隨著Gleason評(píng)分的增高，NUCB2的表達(dá)率也增高，同樣隨著術(shù)前血清PSA值的增加，NUCB2的表達(dá)率也增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。＜5年生存期病例的NUCB2表達(dá)陽(yáng)性率高于≥5年生存期病例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，見表2)。caspase-3表達(dá)與患者年齡、Gleason評(píng)分及術(shù)前血清PSA值均無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。＜5年生存期病例的caspase-3表達(dá)陽(yáng)性率低于≥5年生存期病例，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05，見表2)。

2．3 NUCB2與caspase-3在高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組和高分化前列腺癌組中的表達(dá)

NUCB2在高分化PC組中陽(yáng)性表達(dá)率高于HGPIN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，見表3)。

表1 NUCB2與caspase-3在各組中的表達(dá) 例(%)Table 1 Expression of NUCB2 and caspase-3 in each group cases(%)

表2 NUCB2與caspase-3的表達(dá)與PC臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 2 Relationship of expression of NUCB2 and caspase-3 with the clinicopathological factors in prostate cancer

表3 NUCB2與caspase-3在HGPIN組和高分化PC組中的表達(dá)Table 3 Expression of NUCB2 and caspase-3 in patients with HGPIN and high differentiation of prostate cancer

2．4 NUCB2表達(dá)與PC預(yù)后的關(guān)系

預(yù)后分析顯示，本組NUCB2陽(yáng)性表達(dá)36例，陰性表達(dá)13例，陽(yáng)性和陰性患者間術(shù)后生存差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0．001，見圖3)。本組caspase-3陽(yáng)性表達(dá)16例，陰性表達(dá)33例，陽(yáng)性和陰性患者間術(shù)后生存差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05，見圖4)。

2．5 前列腺癌中NUCB2與caspase-3表達(dá)的相關(guān)性

NUCB2、caspase-3在前列腺癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(P ＜0．001，見表4)。

圖3 NUCB2表達(dá)與PC術(shù)后生存曲線Figure 3 NUCB2 expression and postoperative survival curves of PC patients

圖4 caspase-3表達(dá)與PC術(shù)后生存曲線Figure 4 caspase-3 expression and postoperative survival curves of PC patients

表4 NUCB2、caspase-3在前列腺癌組織中表達(dá)的關(guān)系Table 4 Correlation between the expression of NUCB2 and caspase-3 in prostate cancer

3 討論

前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤之一，隨著我國(guó)人口老齡化、飲食結(jié)構(gòu)的改變及前列腺癌診治水平的提高等因素的影響，在我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率逐年上升。因此，對(duì)于前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及診治已經(jīng)成為一個(gè)重要的課題。

NUCB2基因是一種新的腫瘤相關(guān)基因，在胃癌、乳腺癌、前列腺癌及腎透明細(xì)胞癌中被相繼報(bào)道［3－6］。Kalnina 等［3］采用 RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示胃癌組織中NUCB2 mRNA水平下調(diào)。Suzuki等［4］研究發(fā)現(xiàn)NUCB2與乳腺癌的復(fù)發(fā)和不良預(yù)后密切相關(guān)，被認(rèn)為是一種有效的預(yù)后因素。Qi等［6］發(fā)現(xiàn)腎透明細(xì)胞癌組織中NUCB2表達(dá)水平明顯高于相鄰的非癌變組織。有研究發(fā)現(xiàn)NUCB2在前列腺癌中有高表達(dá)，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶連反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中NUCB2 mRNA明顯增高［5］。

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NUCB2在前列腺癌組中的表達(dá)明顯高于良性前列腺增生組和前列腺上皮內(nèi)瘤變組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，NUCB2在前列腺癌組織中的高表達(dá)與Zhang等［7］的研究結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)顯示，在PC組中NUCB2表達(dá)與年齡無(wú)關(guān)，與腫瘤的Gleason分級(jí)、術(shù)前血清PSA相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，血清PSA是用于前列腺癌的常用篩查指標(biāo)，隨著術(shù)前血清PSA值的增加，NUCB2蛋白的表達(dá)率增高。Gleason評(píng)分能反應(yīng)出前列腺癌的分化程度及生物學(xué)行為，隨著Gleason分級(jí)的增加，前列腺癌分化越差，NUCB2表達(dá)率越高，提示NUCB2表達(dá)可能與PC的進(jìn)展、分化有關(guān)。NUCB2在＜5年與≥5年生存期病例中的表達(dá)差異，提示NUCB2的異常表達(dá)可能與前列腺癌的預(yù)后有關(guān)。HGPIN目前認(rèn)為是一種癌前病變，其組織學(xué)形態(tài)與生物學(xué)行為與PC相似并有關(guān)聯(lián)，尤其是與高分化前列腺癌。本組實(shí)驗(yàn)顯示在高分化PC組中NUCB2陽(yáng)性表達(dá)率高于HGPIN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示其可能可以用于二者的鑒別診斷。

細(xì)胞凋亡即程序性細(xì)胞死亡，是一種自然死亡過(guò)程，目前研究認(rèn)為，許多惡性腫瘤的發(fā)生與凋亡失衡密切相關(guān)。天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶(caspases)在細(xì)胞凋亡中起重要的作用，其中caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵激酶以及主要的效應(yīng)分子。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)在人類癌癥患者中，caspase-3 與腫瘤的復(fù)發(fā)和死亡相關(guān)［8］。Sohn 等［9］研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌組織中caspase-3的陽(yáng)性表達(dá)率為27．5%，并且caspase-3的陽(yáng)性表達(dá)與 Gleason分級(jí)無(wú)相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示，caspase-3蛋白主要在細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)，呈顆粒狀，僅個(gè)別在細(xì)胞核表達(dá)。caspase-3在前列腺癌組中的表達(dá)明顯低于良性前列腺增生組和前列腺上皮內(nèi)瘤變組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。caspase-3 在 PC 組陽(yáng)性率為 32．7%，但caspase-3在PC中的表達(dá)與患者年齡、Gleason分級(jí)、術(shù)前血清PSA水平均無(wú)關(guān)，提示caspase-3可能與PC的發(fā)生有關(guān)，caspase-3在前列腺癌組織中的表達(dá)明顯低于非癌性前列腺組織，提示caspase-3在前列腺癌細(xì)胞凋亡機(jī)制中有重要作用。這與一些研究結(jié)果相似，O’Neill等［10］研究結(jié)果顯示caspase-3在前列腺增生組織中的表達(dá)明顯高于前列腺癌組織，并提出caspase-3的表達(dá)改變是雄激素阻斷的一種凋亡抵抗機(jī)制。

NUCB2是一種新近發(fā)現(xiàn)的與惡性腫瘤相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)，并且具有其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域及相應(yīng)的功能;caspase-3作為caspases家族中的重要成員在人體細(xì)胞凋亡中起著至關(guān)重要的作用。Valencia等［11］研究發(fā)現(xiàn)，NUCB1與NUCB2是與Ca2+相互作用的多功能蛋白。凋亡發(fā)生過(guò)程中重要的效應(yīng)分子半胱氨酸蛋白酶(caspases)能對(duì)Nucleobindins(包括nucb1和nucb2)進(jìn)行裂解，并且caspases切割位點(diǎn)準(zhǔn)確定位于其中的一個(gè)鈣離子結(jié)合EF-hand結(jié)構(gòu)。并通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)合成斑馬魚NUCB2，發(fā)現(xiàn)其能有效地、明確地被斑馬魚 caspase-3裂解，也能被人csapase-3裂解。本實(shí)驗(yàn)采用Spearman相關(guān)分析顯示，在前列腺癌組織中NUCB2表達(dá)與caspase-3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，NUCB2隨著前列腺癌的發(fā)生表達(dá)增強(qiáng)，caspase-3隨著前列腺癌的發(fā)生表達(dá)降低，由此可以提示NUCB2的高表達(dá)引起caspase-3的減少，影響細(xì)胞凋亡失衡，NUCB2與caspase-3兩者間存在一種相互作用機(jī)制在前列腺癌中發(fā)揮作用。目前NUCB2與caspase-3之間的相互關(guān)系以及生物學(xué)功能方面的研究還比較少，尤其是在腫瘤中的相互作用機(jī)制，仍需要大量病例展開進(jìn)一步的研究。

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