NDRG2對肝星形細胞活化及TGF-β1/Smad通路的影響

楊建棟，高建軍，韓坤娜，李明霞，田志堅，楊 斌，孫 綱(解放軍第210醫(yī)院普通外科，大連 116021，通訊作者，E-mail:dljfj210@sohu．com)

肝纖維化是肝臟損傷修復的結果，特別是持續(xù)的慢性損傷，如病毒感染、藥物毒性、代謝障礙或免疫系統(tǒng)攻擊等因素是肝纖維化形成的主要原因［1］。肝纖維化是可逆的病理性過程。大多數(shù)肝纖維化進程緩慢，當發(fā)展到肝硬化時，則同時伴有假小葉形成，血流動力學改變以及肝衰竭風險的增加［2－4］。

研究發(fā)現(xiàn)，肝星形細胞(hepatic stellate cells，HSCs)在正常時主要貯存視黃醇，但在肝纖維化時活化成為具有增殖性、收縮性、成纖維性樣的細胞，分泌Ⅰ型膠原，表達活化蛋白α-SMA，導致肝纖維化［1］。因此抑制HSCs的活化被認為是治療肝纖維化的關鍵。而TGF-β1/Smad通路是HSCs活化的最主要細胞通路［5］。

NDRG2(GenBank Accession No．AF159092)是NDRG(N-Myc downstream-regulated gene)家族的一員，該家族包括4個成員:NDRG1-4。NDRG2蛋白分布在細胞胞質中，參與了細胞生長和分化等重要分子事件［6－8］。最近研究表明NDRG2與肝臟的組織器官形成有關。它在鼠和人的肝臟中高表達，且其表達水平同肝臟的發(fā)育密切相關［9，10］。在肝臟再生過程中，NDRG2起到雙向調控的作用，在肝再生早期，NDRG2表達下降，促進肝細胞分裂增殖;在肝再生后期，NDRG2表達升高促進再生肝細胞分化成熟［11］。作為抑癌基因［12］，NDRG2 在肝癌的發(fā)生形成過程中同樣發(fā)揮著重要作用?？傊?，上述研究表明NDRG2參與了肝臟許多重要的生理病理過程的調控。然而，NDRG2在肝纖維化過程中的具體作用未見報道。特別是有基因芯片結果提示NDRG2在DMN誘導的大鼠肝纖維化過程中表達降低［13］，更加說明NDRG2可能在此過程中發(fā)揮作用。本實驗通過檢測NDRG2在HSCs中的表達及其在HSCs活化過程中的變化，進而分析NDRG2對HSCs活化的調控，闡明NDRG2調控HSCs活化的分子機制。

1 材料與方法

1．1 材料

人肝星形細胞系LX-2由Scott Friedman教授(西奈山醫(yī)學院，美國)惠贈;DMEM完全培養(yǎng)基，10%胎牛血清購自 Invitrogen公司;表達大鼠NDRG2(AdNDRG2)或β－半乳糖苷酶(AdLacZ)的腺病毒載體購自本源正陽公司(中國);NC膜購自Amersham Biosciences公司;鼠抗NDRG2單克隆抗體購自Abnova公司;兔抗α-SMA多克隆抗體購自Abcam公司;兔抗Smad3單克隆抗體購自Cell Signaling公司;鼠抗β-actin單克隆抗體，F(xiàn)ITC標記羊抗鼠二抗，CY3標記羊抗兔二抗購自博士德公司(中國);DAPI購自Roche公司;TGF-β1細胞因子購自Pepro Tech公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1．2 細胞培養(yǎng)

LX-2細胞用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，在5%CO2飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1．3 腺病毒轉染

將LX-2細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，在37℃，5%CO2濃度的孵箱中培養(yǎng)，使細胞達到70%－80%的融合。用無血清培養(yǎng)液制備500 μl/孔腺病毒混合液，其中每孔含有40MOI的腺病毒，室溫放置20 min，加500 μl無血清培養(yǎng)液至腺病毒混合液中混勻后，棄去舊的培養(yǎng)液，將混合液小心滴加至細胞上輕輕混勻使腺病毒感染細胞。37℃，5%CO2濃度的孵箱中培養(yǎng)2 h，撤去混合液，加入完全培養(yǎng)液2 ml，繼續(xù)培養(yǎng)，在感染后48 h收集細胞。

1．4 TGF-β1處理 LX-2 細胞

將LX-2細胞接種于100 mm培養(yǎng)皿中，待細胞處于對數(shù)生長期，達到70%－80%融合時，撤去含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，給予1×PBS稀釋的0．2%BSA孵育48 h(即血清饑餓處理)。之后給予1 ×PBS 稀釋的 TGF-β1(2．5 ng/ml)處理24 h，利用TGF-β1促進LX-2細胞活化。

1．5 細胞免疫熒光

①將細胞接種于24孔板中，待細胞處于對數(shù)生長期，達到70%－80%融合時收集細胞;② 1×PBS輕洗3次，4%多聚甲醛4℃固定15 min;③1×PBS洗5 min×3次，含1%BSA的0．1%Trition X－100室溫1 h封閉抗原;④ 1×PBS洗5 min×3次，一抗(NDRG2抗體 1∶500稀釋，α-SMA抗體1∶400稀釋)4℃孵育過夜;⑤ 1×PBS洗5 min×3次，二抗(FITC標記的羊抗鼠 IgG 1∶1 000稀釋，CY3標記的羊抗兔IgG 1∶1 000稀釋)室溫孵育2 h;⑥1×PBS洗 5 min×3次，DAPI(1 μg/ml)孵育5 min染核;⑦ 1×PBS洗5 min×3次，倒置熒光鏡下觀察，拍照。

1．6 Western blot

RIPA 裂解液［0．05 mol/L Tris-HCl(pH 7．4)，0．15 mol/L NaCl，1%NP-40，1 mmol/L EDTA，使用前加入蛋白酶抑制劑］提取細胞蛋白。BCA法測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳后將蛋白轉至NC膜上。一抗(鼠抗NDRG2單克隆抗體，兔抗α-SMA多克隆抗體，兔抗Smad3單克隆抗體，鼠抗β-actin單克隆抗體)用適當稀釋的相應抗體，二抗為HRP標記的種屬匹配的二抗。增強化學發(fā)光劑顯色。

1．7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2．1 NDRG2在LX-2的胞質中表達

間接免疫熒光的結果證實NDRG2在LX-2的胞質中表達，胞核中未見表達。HSCs活化指標α-SMA在LX-2的胞質中也有表達(見圖1)，證實LX-2是半活化狀態(tài)的HSCs細胞。

圖1 NDRG2和α-SMA在LX-2細胞中的表達和分布 (×400)Figure 1 The expression and distribution of NDRG2 and α-SMA in LX-2 cells(×400)

2．2 NDRG2在LX-2活化過程中表達下降

連續(xù)貼壁培養(yǎng)可以活化HSCs細胞。我們將培養(yǎng)的LX-2細胞用胰酶消化下來，重新在100 mm皿中培養(yǎng)，在接下來的12 d中，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，隨著LX-2細胞的活化，α-SMA表達逐漸增高，而NDRG2的表達隨之降低(見圖2A)。TGF-β1可以刺激HSCs細胞活化，在這個過程中，NDRG2的表達隨著LX-2活化而下降(見圖2B)，說明NDRG2與LX-2活化呈負相關。

圖2 NDRG2在LX-2活化過程中表達降低Figure 2 NDRG2 was decreased during LX-2 activation

2．3 上調LX-2細胞中NDRG2可以抑制其活化

為了檢測NDRG2對HSCs細胞活化的影響，我們利用表達NDRG2(AdNDRG2)或β－半乳糖苷酶(AdLacZ)的腺病毒感染LX-2細胞，Western blot結果顯示，與對照組AdLacZ相比，AdNDRG2能夠上調LX-2細胞中NDRG2的蛋白水平(見圖3A)。接下來，我們給予LX-2細胞TGF-β1和腺病毒處理并檢測其活化情況，結果顯示TGF-β1能夠促進LX-2細胞的活化，而NDRG2可以抑制TGF-β1介導的LX-2細胞活化(見圖3B)。

圖3 NDRG2抑制LX-2細胞的活化Figure 3 NDRG2 inhibited LX-2 cell activation

2．4 NDRG2抑制Smad3的表達

我們利用TGF-β1促進LX-2活化的同時給予腺病毒處理，Western blot檢測顯示LX-2活化后，TGF-β1/Smad通路中 Smad3的蛋白表達增加，但NDRG2能夠抑制Smad3的蛋白表達(見圖4)，證實NDRG2抑制LX-2活化的作用是通過抑制TGF-β1/Smad通路實現(xiàn)的。

3 討論

圖4 NDRG2抑制Smad3的表達Figure 4 NDRG2 inhibited Smad3 expression

HSCs在連續(xù)貼壁培養(yǎng)或TGF-β1刺激的情況下可以進一步活化，這是HSCs經(jīng)典的活化模型。我們實驗采用的人肝星形細胞系LX-2是永生化的HSCs細胞系。它能夠表達活化指標α-SMA，并能在上述兩種模型中進一步活化，因此可以被看作是半活化狀態(tài)的HSCs［14］。我們首先發(fā)現(xiàn) NDRG2表達在LX-2細胞的胞質中，在兩種活化模型上都觀察到隨著LX-2細胞的活化，α-SMA表達逐漸增高，而NDRG2表達則逐漸降低，說明NDRG2與LX-2細胞的活化呈負相關。以往的研究表明，NDRG2能夠抑制細胞增殖，促進細胞分化。而HSCs的活化過程，其實就是靜息的HSCs細胞增殖，轉分化為能夠分泌細胞外基質的肌成纖維細胞的過程。因此，我們的研究又一次證實了NDRG2與細胞增殖分化的關系。在HSCs的活化過程中NDRG2表達的下調，可能是HSCs增殖，去分化的始動因素或伴隨結果。

為了說明這個問題，我們利用腺病毒上調了LX-2細胞中NDRG2的水平，結果發(fā)現(xiàn)NDRG2可以抑制由TGF-β1刺激所致的LX-2細胞活化，這表明NDRG2在LX-2細胞活化過程中發(fā)揮始動因素，其作用可能是通過拮抗TGF-β1實現(xiàn)的。TGF-β1調控HSCs活化的信號主要是通過其胞內(nèi)分子Smad2/3傳遞的。我們的實驗發(fā)現(xiàn)，NDRG2拮抗TGF-β1的作用是通過抑制Smad3的表達實現(xiàn)的。這些結果將有待于進一步在動物體內(nèi)實驗驗證。

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