羅丹明類小分子熒光探針對水中Hg2+檢測的比較研究

呂向菲， 李　婷, 霍霄楠， 胡南江, 閆　蕾,

李國榮1, Ermelinda Bloise4

(1.陜西科技大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院， 陜西 西安　710021； 2.陜西科技大學(xué) 輕工與能源學(xué)院， 陜西 西安　710021； 3.國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心 材料工程發(fā)明審查部, 北京　100096； 4.Department of Engineering for Innovation, University of Salento, Italy Lecce 73100)

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羅丹明類小分子熒光探針對水中Hg2+檢測的比較研究

呂向菲1,4， 李婷1, 霍霄楠1， 胡南江2, 閆蕾3,

李國榮1, Ermelinda Bloise4

(1.陜西科技大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院， 陜西 西安710021； 2.陜西科技大學(xué) 輕工與能源學(xué)院， 陜西 西安710021； 3.國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心 材料工程發(fā)明審查部, 北京100096； 4.Department of Engineering for Innovation, University of Salento, Italy Lecce 73100)

摘要：將羅丹明B(RhB)及羅丹明6G(Rh6G)應(yīng)用于水中Hg2+的熒光猝滅法測定.在KI存在時，Hg2+可與羅丹明類小分子及KI形成多元離子締合物，故在水中可直接利用體系的熒光發(fā)射峰強度測定Hg2+.通過比較兩種羅丹明類熒光探針的檢測特性發(fā)現(xiàn)，兩種羅丹明類小分子都是熒光檢測特性較好的猝滅型探針，其中羅丹明6G由于其分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性大，故靈敏性、線性范圍和選擇性均高于羅丹明B.

關(guān)鍵詞：熒光猝滅； 羅丹明B； 羅丹明6G

0引言

汞離子具有持久性、易遷移性、高毒性和高度的生物富集性等，其進入水體環(huán)境后可借助細菌的作用而形成有機汞，從而進一步危害人類健康.美國國家環(huán)境保護局規(guī)定飲用水中無機汞的最高濃度為2 ppb[1]; ROHS表明歐盟自2006年7月1日起投放歐盟市場的電子電器設(shè)備中不得含有汞；我國對生活飲用水中總汞含量規(guī)定必須小于1 mg/L[2].

據(jù)《2013年上半年全國環(huán)境質(zhì)量狀況》報告顯示：我國當前地下水源面臨嚴重的汞污染， 12個地表水國控斷面出現(xiàn)22次重金屬超標，其中以汞的超標頻次最多[3].因此，尋找高效、廉價、簡潔的汞離子檢測手段已成為重要的研究課題.在各種檢測技術(shù)中，熒光探針檢測法具有便捷、靈敏度高、樣品無損、高效篩選及實時、原位檢測等優(yōu)點，因而成為水中汞離子檢測的熱點研究方法[4].

目前，用于汞離子檢測的熒光探針分子主要有：香豆素、芘、萘類、雙吡啶、方酸菁、氧雜蒽類(包括羅丹明類衍生物和熒光素)等[5-7].其中,羅丹明類熒光探針具有優(yōu)異的光物理特性，借助其分子開環(huán)反應(yīng)前后螺內(nèi)酯到螺內(nèi)酰胺的結(jié)構(gòu)變化，顯示出了極強的熒光現(xiàn)象和顏色變化，成為了主要的檢測探針[8].

大部分用于水體汞離子檢測的熒光探針是以羅丹明B和羅丹明6G為基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)而進行的改性衍生物[9,10].從結(jié)構(gòu)上對不同羅丹明類熒光探針的檢測特性進行比較的研究還比較少，如果選擇結(jié)構(gòu)相似的羅丹明類熒光探針，分析其檢測特性，并從結(jié)構(gòu)角度分析其熒光差異，將有助于設(shè)計出具有更高靈敏度及選擇性的探針分子.

因此，本文選擇羅丹明B和羅丹明6G用于檢測水體中痕量的Hg2+，并在不同條件下比較各自的檢測靈敏度，得到了其分子結(jié)構(gòu)與Hg2+熒光光譜的相關(guān)性，還分析了其可能的原因，這為進一步設(shè)計羅丹明類熒光探針提供了理論依據(jù).

1實驗部分

1.1試劑和藥品

羅丹明B和羅丹明6G(北京百靈威科技有限公司);Tris、碘化鉀(廣東光華化學(xué)有限公司);磷酸、抗壞血酸、氯化汞和硝酸鉛(天津市天力化學(xué)試劑有限公司);鹽酸(天津市福晨化學(xué)試劑廠);氯化銅、氯化鋅(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑研發(fā)中心)；去離子水(利用優(yōu)普超純水UPH-Ⅱ-5/10/20T系統(tǒng)制備得到,電導(dǎo)率為18.2 MΩ·cm).

1.2實驗儀器

紫外-可見光譜儀Cary 300型(美國通用公司)；恒溫水浴箱(上海蘭科股份有限公司)；熒光分光光度計F4600型(日本日立高新技術(shù)公司)；電子天平 BS224S型(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司).

1.3實驗方法

(1)Hg2+儲備液：稱取0.006 8 g的氯化汞用pH為7.40的tris-HCl溶液定容于50 mL的容量瓶中，得到5×10-4mol/L的HgCl2溶液.

(2)羅丹明6G儲備液：稱取0.24 g的羅丹明6G，用二次去離子水定容于100 mL容量瓶中，即為5×10-4mol/L的羅丹明6G溶液.

(3)碘化鉀-抗壞血酸( KI-VC )混合溶液：取分析純碘化鉀20 g、抗壞血酸2 g溶解后，定容至100 mL容量瓶中.

(4)1.33 mol/L H3PO4溶液：用移液管移取9.1 mL濃磷酸用二次去離子水定容于100 mL容量瓶.

(5)羅丹明6G對Hg2+的檢測：在25 mL容量瓶中，首先加入適量汞離子儲備液，再加入5 mL 1.33 mol/L磷酸溶液, 稀釋至10 mL，依次加入1 mL碘化鉀-抗壞血酸( KI-VC )混合溶液、0.5 mL 5×10-4mol/L 羅丹明6G溶液，混合均勻用tris-HCl溶液稀釋至25 mL，于發(fā)射波長處測其熒光強度.

羅丹明B檢測汞離子方法與上述步驟類似.

(6)干擾離子的檢測：于25 ℃下羅丹明6G(羅丹B)-Hg2+(10-6mol/L)體系中加入Zn2+、Cu2+、Cd2+、Pb2+等作為干擾離子，考察兩種探針的抗干擾能力.配制方法為(以羅丹明6G為例，羅丹明B類似)：在25 mL容量瓶中依次加入羅丹明6G溶液、5 mL 1.33 mol/L磷酸溶液、1 mL碘化鉀-抗壞血酸( KI-VC )混合溶液、HgCl2溶液，搖勻后再加入干擾離子(干擾離子濃度為:Cu2+，10-5mol/L;Zn2+，10-4mol/L；Cd2+，10-4mol/L;Pb2+,10-4mol/L )，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻后檢測體系熒光光譜.

實際水體中Hg2+的檢測，與上述方法類似，不同的地方是將HgCl2換成實際水樣.

2結(jié)果與討論

2.1羅丹明B與羅丹明6G的光譜特性

圖1與圖2分別是25 ℃下1×10-5mol/L 羅丹明B與羅丹明6G的紫外可見吸收和熒光發(fā)射檢測圖.由圖1～2可知，羅丹明B的紫外-可見最大吸收峰位于483 nm；羅丹明6G的紫外-可見最大吸收峰位于526.5 nm.在熒光檢測過程中，為了比較兩者的光譜特性，選擇400 nm 的紫外光作為激發(fā)光，得到了兩種探針的熒光發(fā)射光譜.羅丹明B的熒光發(fā)射特征峰為591.2 nm；羅丹明6G的熒光發(fā)射特征峰為558.2 nm.經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，相同條件下羅丹明6G的熒光發(fā)射峰強度明顯高于羅丹明B，這表明在后續(xù)的檢測過程中，羅丹明6G熒光探針更靈敏.且兩種探針的紫外-可見吸收光譜與熒光發(fā)射光譜呈鏡像，說明它們均具有很好的熒光檢測特性.

圖1　羅丹明B的紫外可見吸收與熒光發(fā)射光譜圖

圖2　羅丹明6G的紫外可見吸收與熒光發(fā)射光譜圖

2.2不同溫度下熒光探針對Hg2+的檢測比較

文獻[11]表明，溫度會影響羅丹明熒光檢測體系的熒光強度.因此，選擇了1×10-5mol/L羅丹明探針檢測1×10-6mol/L Hg2+體系作為對象，分別測定了該系統(tǒng)在水浴溫度為15 ℃、20 ℃、25 ℃和30 ℃下，兩種不同體系熒光發(fā)射峰的強度變化，分別如圖3和圖4所示.由圖3～4可知，羅丹明B-Hg2+體系熒光強度先降低后升高，在25 ℃時的熒光強度最低;而羅丹明6G-Hg2+體系的熒光強度隨溫度一直降低，在30 ℃時的熒光強度最低.該結(jié)果說明，在研究者所在的西安地區(qū)全年大部分溫度范圍內(nèi)都可利用羅丹明類分子進行Hg2+的檢測，對于羅丹明B分子在夏季具有更靈敏的檢測特性，而對羅丹明6G分子在春秋兩季的檢測性更高.

圖3　溫度對羅丹明B檢測Hg2+熒光強度的影響

圖4　溫度對羅丹明6G檢測Hg2+熒光強度的影響

2.3檢出限及線性范圍比較

選擇在25 ℃下，繪制汞離子標準曲線，測定了Hg2+濃度從1×10-8mol/L到1×10-5mol/L范圍內(nèi)，羅丹明B及羅丹明6G識別體系熒光強度的變化圖，其結(jié)果見圖5及圖6所示.

由圖5可知，在25 ℃下，Hg2+濃度在0～0.000 001 mol/L范圍內(nèi)，羅丹明B的熒光強度均與Hg2+濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2為0.983 1;由圖6可知，在25 ℃下，Hg2+濃度在0～0.000 01 mol/L范圍內(nèi)，羅丹明6G的熒光強度均與Hg2+濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2為0.991 9.這表明兩種探針都可用于水體痕量Hg2+的檢測，且羅丹明6G的檢測精度更高.

同時，通過擬合直線斜率發(fā)現(xiàn)，兩種探針都屬熒光猝滅型探針，根據(jù)文獻[12]的計算方法，可知羅丹明B和羅丹明6G對Hg2+的檢出下限分別為6.9×10-8mol/L 和1.2×10-9mol/L.

(a)Hg2+濃度(沿箭頭方向依次是a：0 mol/L；b：10-8 mol/L；c：10-7 mol/L；d：10-6 mol/L；e：10-5 mol/L；f：10-4 mol/L)

(b)羅丹明B檢測Hg2+擬合直線圖圖5　羅丹明B檢測Hg2+體系的熒光強度變化圖

(a)Hg2+濃度(沿箭頭方向依次是a：0 mol/L;b：10-8 mol/L;c：10-7 mol/L;d：10-6 mol/L;e：10-5 mol/L;f：10-4 mol/L)

(b)羅丹明6G檢測Hg2+擬合直線圖圖6　羅丹明6G檢測Hg2+體系的熒光強度變化圖

2.4干擾離子對不同體系熒光檢測結(jié)果比較

為了比較兩種探針對Hg2+識別的選擇性，選擇了Zn2+、 Cu2+、Pb2+及Cd2+等作為干擾離子，測試了25 ℃下兩種探針對混合體系中Hg2+的熒光檢測圖.在測試體系中，羅丹明B(羅丹明6G)濃度為1×10-5mol/L、Hg2+濃度為1×10-6mol/L、干擾離子濃度為1×10-5mol/L，其檢測結(jié)果分別如圖7和圖8所示.

由圖7～8可知，兩種探針對Hg2+的響應(yīng)性均較好，當體系中僅有Hg2+存在時，羅丹明B檢測體系熒光強度為1 271；而羅丹明6G檢測體系熒光強度為1 871.當體系中引入干擾離子后，羅丹明B檢測體系熒光強度迅速下降，僅為619；而羅丹明6G檢測體系熒光強度變化不大，仍高達1 854，這說明羅丹明6G比羅丹明B的抗干擾能力強，即羅丹明6G的選擇性更高.

比較兩者的分子結(jié)構(gòu)(如圖9所示)可發(fā)現(xiàn)，羅丹明6G與羅丹明B分子中的苯環(huán)之間有附加的氧橋，分子結(jié)構(gòu)剛性均較強，兩者均具有一定的熒光檢測特性.從外圍取代基結(jié)構(gòu)分析，與羅丹明6G相比，羅丹明B分子中多出了一個羧基，羧基是強極性基團，提高了整個分子在水中的溶解性及與金屬陽離子的作用位點，同時，也增加了羅丹明B與陽離子間的結(jié)合機會，因此，其在水中的抗干擾能力較差;從探針分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性分析，與羅丹明B相比，羅丹明6G分子的苯環(huán)外圍存在給電子的甲基，在檢測過程中使苯環(huán)活化，能量升高更易與目標分子發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，因此，其分子檢測的準確性更高.

圖7　羅丹明B對混合體系中Hg2+的熒光檢測圖

圖8　羅丹明6G對混合體系中Hg2+的熒光檢測圖

圖9　羅丹明B及羅丹明6G的分子結(jié)構(gòu)圖

2.5實際水樣中Hg2+測量結(jié)果比較

在25 ℃下,利用兩種探針檢測自來水樣中的Hg2+，其結(jié)果如圖10所示.由圖10可知，羅丹明B 和羅丹明6G檢測體系的最大熒光發(fā)射峰處的強度分別為890.6和885.5.根據(jù)25 ℃條件下兩種探針熒光發(fā)射峰強度與汞離子濃度變化的線性關(guān)系，將其帶入擬合直線方程中，乘以稀釋倍數(shù)后，分別求得自來水中Hg2+濃度分別為9.69×10-6mol/L和3.25×10-5mol/L.

從上面的計算可知，兩種羅丹明類熒光探針檢測出的汞離子濃度不同，但是從前述的討論可知，羅丹明6G具有較高的靈敏性和選擇性及線性范圍.所以，可認為羅丹明6G檢測汞離子的濃度為3.25×10-5mol/L是較準確的.由于羅丹明B在實際檢測中易受到其它離子的干擾，其選擇性較差，故其檢測結(jié)果比實際值小.

圖10　兩種探針分子對自來水中Hg2+的檢測圖

3結(jié)論

羅丹明B與羅丹明6G對水中Hg2+都具有極好的熒光檢測特性.兩種探針都屬熒光猝滅型探針，受溫度影響較大.其中，羅丹明6G對Hg2+檢測的線性范圍、檢出限及選擇性均高于羅丹明B.因此，在實際水樣Hg2+的熒光檢測中，羅丹明6G探針的準確性更高.

從其結(jié)構(gòu)上分析可知，羅丹明6G分子中存在給電子的甲基，在檢測過程中使苯環(huán)活化，能量升高更易與檢測離子發(fā)生開環(huán)反應(yīng).所以，在今后的探針改性中，為了提高探針分子的準確性，要適當控制探針分子的極性，盡量減少羧基、羥基等強極性基團對羅丹明類分子的取代，而應(yīng)選擇在其外圍修飾給電子基團.

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Comparison of detection for Hg2+in water

by rhodamine fluorescence probes

LV Xiang-fei1,4, LI Ting1, HUO Xiao-nan1, HU Nan-jiang2, YAN Lei3,

LI Guo-rong1, Ermelinda Bloise4

(1.College of Resources and Environment, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China; 2.College of Light Industry and Energy, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China; 3.Material Engineering Invention Examination Department, Patent Examination Cooperation Center of the Patent Office, SIPO, Beijing 100096, China; 4.Department of Engineering for Innovation, University of Salento, Lecce 73100, Italy)

Abstract:The rhodamine B and rhodamine 6G were applied to the determine of Hg2+in water by quenching-fluorescence.After the addition of KI,Hg2+could produce multi-ionic associated substance with rhodamine probes,which was used to detect the Hg2+in water solution through the intensity of fluorescence emission peak in system.By comparision of the detection performance based two probes,the results indicated that two rhodamine moleculers were quenching fluorescence probes and the rhodamine 6G showed higher sensitivity,linearity and selectivity than rhodamine B,due to its steady structure.

Key words:fluorescence quenching; rhodamine B; rhodamine 6G

中圖分類號：O657.3

文獻標志碼：A

文章編號：1000-5811(2015)05-0034-06

作者簡介:呂向菲(1984-)，女，陜西臨潼人，講師，博士，研究方向：熒光探針對水中重金屬離子的檢測

基金項目：陜西省科技廳自然科學(xué)基金項目(2013JQ2026)； 國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201310708013)； 陜西科技大學(xué)學(xué)術(shù)骨干培育計劃項目(XSG(4)012)

收稿日期:*2015-06-18