利格列汀對(duì)2型糖尿病大鼠代謝性內(nèi)毒素血癥的影響

潘道延 沈潔 朱筱 趙德福 陳志 韓亞娟 李文婷 陳遠(yuǎn)程

利格列汀對(duì)2型糖尿病大鼠代謝性內(nèi)毒素血癥的影響

潘道延 沈潔 朱筱 趙德福 陳志 韓亞娟 李文婷 陳遠(yuǎn)程

目的 探討利格列汀對(duì)高脂飲食聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠代謝性內(nèi)毒素血癥的影響。方法 30只健康雄性Sprague-Dawley大鼠按隨機(jī)數(shù)字法選擇10只作為正常對(duì)照組，以正常飼料喂養(yǎng)，其余20只以高脂飼料飼喂8周后，予一次性腹腔注射STZ（35mg/kg）制備2型糖尿病模型。將造模成功大鼠共16只按隨機(jī)數(shù)字法分為利格列汀干預(yù)組（3mg·kg-1·d-1灌胃，n=8）和糖尿病對(duì)照組（等量生理鹽水灌胃，n=8），干預(yù)4周后測(cè)定大鼠空腹血糖、空腹胰島素（FINS）、甘油三酯、總膽固醇、門(mén)靜脈血漿脂多糖、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、二胺氧化酶（DAO）的水平，計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-胰島素敏感指數(shù)（HOMA-ISI）及穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，糖尿病對(duì)照組空腹血糖、FINS、HOMA-IR、甘油三酯、總膽固醇及體重等指標(biāo)明顯升高，ln（HOMA-ISI）明顯降低，而利格列汀干預(yù)組上述指標(biāo)除體重外較糖尿病對(duì)照組均有改善（F=39.18～136.74，P均＜0.01）。糖尿病對(duì)照組門(mén)靜脈血漿脂多糖、TNF-α、IL-6、血漿DAO水平明顯高于正常對(duì)照組，而利格列汀干預(yù)組上述指標(biāo)較糖尿病對(duì)照組有所下降（F=18.13～51.43，P均＜0.05）。結(jié)論 利格列汀可以改善高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠代謝性內(nèi)毒素血癥，并減輕全身系統(tǒng)性炎性反應(yīng)。

利格列汀；2型糖尿?。淮x性內(nèi)毒素血癥；炎癥

代謝性內(nèi)毒素血癥是指血循環(huán)中脂多糖水平較正常高2～3倍的一種低度炎性反應(yīng)狀態(tài)[1]。近年越來(lái)越多的研究表明，由高脂飲食介導(dǎo)的代謝性內(nèi)毒素血癥參與了胰島素抵抗、肥胖及2型糖尿病等的發(fā)生、發(fā)展，降低血漿脂多糖含量可以明顯減輕全身系統(tǒng)性的炎性反應(yīng)并改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)[2-3]。二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制劑作為一種新型降糖藥物，因其可以抑制DPP-4對(duì)胰高血糖素樣肽-1的水解，增加其在體內(nèi)的作用時(shí)間，從而產(chǎn)生降糖作用，但隨著研究的深入，逐漸發(fā)現(xiàn)其除了降糖之外還有其他廣泛的作用，如降血脂、改善炎性反應(yīng)、促進(jìn)傷口愈合等[4-5]。本研究擬觀察新型DPP-4抑制劑利格列汀對(duì)高脂飲食聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠代謝性內(nèi)毒素血癥的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及2型糖尿病模型的建立 30只SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠，體重180～200 g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[批號(hào)為SCXK（粵）2011-0015]。大鼠自由進(jìn)食進(jìn)水，交替照明12 h，墊料每天更換。適應(yīng)性飼喂1周后，按照隨機(jī)數(shù)字法選擇10只作為正常對(duì)照組，予普通飼料喂養(yǎng)。其余20只準(zhǔn)備造模，予高脂飼料喂養(yǎng)。高脂飼料由標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料中添加10%的蔗糖，20%的熟豬油，2%的膽固醇，0.5%的豬膽鹽組成，高脂飼料每天更換。第8周末準(zhǔn)備造模大鼠禁食12 h，腹腔注射小劑量STZ（35mg/kg）進(jìn)行2型糖尿病造模，正常對(duì)照組僅腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h后，所有大鼠禁食12 h后斷尾取血0.5ml，測(cè)空腹血糖、空腹胰島素（FINS），以隨機(jī)血糖≥11.1mmol/L作為2型糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 第8周末造模后，72 h內(nèi)有4只動(dòng)物死亡，剩余16只動(dòng)物存活且隨機(jī)血糖均大于11.1mmol/L，提示造模成功。將成功造模的大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為糖尿病對(duì)照組（n=8）及利格列汀干預(yù)組（n=8）。正常對(duì)照組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料+0.9%生理鹽水3ml·kg-1·d-1灌胃，糖尿病對(duì)照組給予高脂飼料+0.9%生理鹽水3 ml·kg-1·d-1灌胃，利格列汀干預(yù)組給予高脂飼料+1mg/ml利格列汀溶液3ml·kg-1·d-1灌胃，共干預(yù)4周[7]。觀察各組大鼠食欲、毛發(fā)、大小便、行為及整體狀態(tài)情況，根據(jù)大鼠體重調(diào)整給藥劑量。灌胃藥液均每天配制。

1.3 主要試劑 STZ、二胺氧化酶（DAO）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，檸檬酸、檸檬酸鈉、生理鹽水等均由實(shí)驗(yàn)室提供。利格列汀片（5mg/片）由勃林格殷格翰公司饋贈(zèng)。顯色基質(zhì)鱟試劑盒購(gòu)于廈門(mén)鱟實(shí)驗(yàn)廠有限公司，大鼠胰島素、腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-6采用美國(guó)Linco公司的ELISA試劑盒檢測(cè)。

1.4 樣本采集 12周末，末次給藥后，所有大鼠空腹過(guò)夜，稱量體重。以10%水合氯醛，0.35ml/100 g腹腔注射進(jìn)行麻醉，經(jīng)門(mén)靜脈取血分別置于EDTA-K2抗凝管及無(wú)熱原的肝素抗凝管中，4℃離心（3 500 r/min，r=8.6 cm）15min，取上清，-20℃保存，用于各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.5 指標(biāo)檢測(cè) 空腹血糖、甘油三酯、總膽固醇采用日立7600全自動(dòng)生化儀檢測(cè)；ELISA法檢測(cè)血漿胰島素，計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-胰島素敏感指數(shù)（HOMA-ISI）、穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）。公式計(jì)算：HOMA-ISI=1/（空腹血糖×FINS）；HOMA-IR=（空腹血糖×FINS）/22.5（空腹血糖單位為mmol/L；FINS單位為m IU/L）。利用鱟試劑采用基質(zhì)顯色偶氮法嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)熱原操作檢測(cè)血漿脂多糖含量；ELISA檢測(cè)血漿TNF-α、IL-6及DAO水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 6作圖，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)，若資料符合正態(tài)性、方差齊，多樣本均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)多樣本均數(shù)比較采用近似F檢驗(yàn)的Welch法；組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)的Tamhane'sT2法；HOMA-ISI取自然對(duì)數(shù)納入統(tǒng)計(jì)分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較 造模及藥物干預(yù)過(guò)程中，正常對(duì)照組活動(dòng)正常，毛發(fā)整齊。糖尿病對(duì)照組活動(dòng)減少，精神萎靡，多尿且毛發(fā)暗淡凌亂，利格列汀干預(yù)組與糖尿病對(duì)照組相比，尿量減少，毛發(fā)相對(duì)整齊。

2.2 各組體重、血糖及胰島素等指標(biāo)比較 與正常對(duì)照組相比，糖尿病對(duì)照組及利格列汀干預(yù)組體重、空腹血糖、FINS、HOMA-IR均明顯升高（P均＜0.05），而 ln（HOMA-ISI）明顯降低（P＜0.01）；與糖尿病對(duì)照組相比，利格列汀干預(yù)組空腹血糖、FINS、HOMAIR 顯著降低（P 均＜0.01），而 ln（HOMA-ISI）明顯升高（P＜0.01），體重?zé)o明顯變化，見(jiàn)表1。

2.3 各組血脂變化情況 與正常對(duì)照組相比，糖尿病對(duì)照組及利格列汀干預(yù)組血漿甘油三酯及總膽固醇水平均明顯升高（P均＜0.05）；與糖尿病對(duì)照組相比，利格列汀干預(yù)組甘油三酯及總膽固醇水平均明顯改善（P均＜0.01），見(jiàn)表2。

表1 3組大鼠體重、血糖、胰島素及胰島素抵抗情況比較（±s）

表1 3組大鼠體重、血糖、胰島素及胰島素抵抗情況比較（±s）

注：與正常對(duì)照組相比，a P＜0.01，b P＜0.05；與糖尿病對(duì)照組相比，c P＜0.01；FPG：空腹血糖；FINS：空腹胰島素；HOMA-IR：穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-胰島素抵抗指數(shù)；ln（HOMA-ISI）：穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-胰島素敏感指數(shù)的自然對(duì)數(shù)

表2 3組大鼠血脂變化（±s）

表2 3組大鼠血脂變化（±s）

注：與正常對(duì)照組相比，a P＜0.01，c P＜0.05；與糖尿病對(duì)照組相比，b P＜0.01；TG：甘油三酯；TC：總膽固醇

2.4 各組血漿脂多糖、TNF-α、IL-6及DAO的含量變化 與正常對(duì)照組相比，糖尿病對(duì)照組及利格列汀干預(yù)組大鼠門(mén)靜脈血漿脂多糖、TNF-α、IL-6及DAO水平均明顯升高（P均＜0.05）；與糖尿病對(duì)照組相比，利格列汀干預(yù)后，大鼠門(mén)靜脈血漿脂多糖、TNF-α及IL-6、DAO水平均有所下降（P均＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 3組大鼠血漿脂多糖、TNF-α、IL-6及DAO含量變化（±s）

表3 3組大鼠血漿脂多糖、TNF-α、IL-6及DAO含量變化（±s）

注：與正常對(duì)照組相比，a P＜0.01 ，b P ＜0.05；與糖尿病對(duì)照組相比，c P＜0.01，d P＜0.05；LPS：脂多糖；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-6：白細(xì)胞介素-6；DAO：二胺氧化酶

3 討論

本研究提示，通過(guò)高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ進(jìn)行2型糖尿病造模，可以觀察到糖尿病對(duì)照組和利格列汀干預(yù)組空腹血糖、胰島素、甘油三酯及總膽固醇水平均較正常對(duì)照組有不同程度的上升，HOMA-IR明顯上升，HOMA-ISI有所下降，提示胰島素抵抗明顯增加。同時(shí)，兩組血漿脂多糖水平也較正常對(duì)照組明顯升高，即發(fā)生了“代謝性內(nèi)毒素血癥”。隨著研究的深入，腸道菌群目前已被認(rèn)為是人體的“內(nèi)分泌”器官，與胰島素抵抗、肥胖及2型糖尿病等代謝性疾病均有著密切的聯(lián)系。而脂多糖作為革蘭陰性菌的細(xì)胞壁成分，也被認(rèn)為是腸道菌群和機(jī)體發(fā)揮相互作用的一項(xiàng)極其重要的環(huán)節(jié)。脂多糖在引起腸道局部炎性反應(yīng)的同時(shí)，進(jìn)入血循環(huán)，與巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞表面的Toll樣受體4及白細(xì)胞分化抗原14結(jié)合，釋放大量炎性因子。本研究中，高脂飲食干預(yù)后大鼠血循環(huán)中炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的水平明顯上升，造成全身系統(tǒng)性炎性反應(yīng)，而這一類代謝性低度炎性反應(yīng)也被證實(shí)是胰島素抵抗、肥胖及2型糖尿病等代謝性疾病發(fā)生、發(fā)展中的一項(xiàng)重要因素[2，8-9]。

但目前關(guān)于高脂飲食介導(dǎo)代謝性內(nèi)毒素血癥的機(jī)制尚存在爭(zhēng)議，主要包括以下幾個(gè)方面：有研究表明，脂多糖可以混入乳糜微粒中，隨著乳糜微粒一起被吸收進(jìn)入血循環(huán)；高脂飲食可以導(dǎo)致乳糜微粒在腸上皮細(xì)胞間堆積，造成腸道緊密連接損傷；另外，高脂飲食介導(dǎo)的局部腸道炎性反應(yīng)也可以損傷腸道機(jī)械屏障，使細(xì)菌代謝產(chǎn)物如脂多糖的通透性增加[10-11]。同樣，高脂飲食介導(dǎo)的腸道菌群改變也被認(rèn)為是導(dǎo)致代謝性內(nèi)毒素血癥的發(fā)病機(jī)制之一，通過(guò)使用抗生素或益生元來(lái)調(diào)節(jié)腸道菌群后，血清脂多糖水平也有所下降[12]。

研究觀察到高脂飲食干預(yù)后，糖尿病對(duì)照組和利格列汀干預(yù)組血漿DAO水平較正常對(duì)照組明顯上升，而DAO主要存在于哺乳動(dòng)物小腸黏膜或絨毛上層，在其他組織中則較少。當(dāng)小腸黏膜屏障功能受損時(shí)，細(xì)胞釋放DAO增加，DAO進(jìn)入腸細(xì)胞間隙、淋巴管和血流，使血漿DAO升高，血漿DAO水平可以作為探討腸道機(jī)械屏障功能損傷和修復(fù)的理想指標(biāo)[13]。提示可能通過(guò)損傷腸道黏膜屏障使腸道通透性增加。

本研究使用利格列汀干預(yù)2型糖尿病大鼠，觀察到利格列汀干預(yù)組對(duì)比糖尿病對(duì)照組，不僅血糖、胰島素、血脂水平有所降低，HOMA-ISI及HOMA-IR等指標(biāo)也均有所改善。同時(shí)，利格列汀還可以明顯降低2型糖尿病大鼠血漿脂多糖水平，明顯改善“代謝性內(nèi)毒素血癥”，并可以降低血漿中TNF-α、IL-6等炎性因子的表達(dá)，減輕全身系統(tǒng)性炎性反應(yīng)，也可以降低血漿DAO水平，顯示利格列汀可以減輕高脂飲食介導(dǎo)的腸道損傷。利格列汀作為新型DPP-4抑制劑，較其他同類藥物具有作用時(shí)間長(zhǎng)、抑制DPP-4效果強(qiáng)等特點(diǎn)。研究逐漸發(fā)現(xiàn)DPP-4抑制劑除了抑制體內(nèi)DPP-4對(duì)胰高血糖素樣肽-1的水解，還可以抑制DPP-4對(duì)葡萄糖依賴性促胰島素多肽、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1等的降解，降低腸道來(lái)源的血清中富含甘油三酯的脂蛋白水平，發(fā)揮更多降糖之外的作用[14-15]。因此，本研究觀察到的利格列汀可以緩解高脂飲食介導(dǎo)的腸道損傷，減少腸道脂多糖進(jìn)入血循環(huán)，可能與其發(fā)揮降糖之外的作用相關(guān)，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，利格列汀對(duì)2型糖尿病大鼠代謝性內(nèi)毒素血癥有一定的改善作用，可減輕全身系統(tǒng)性炎性反應(yīng)，這可能與其可以減輕腸道損傷有關(guān)。

［1］CaniPD，Amar J，IglesiasMA，etal.Metabolic endotoxemia initiates obesity and insulin resistance[J].Diabetes，2007，56（7）：1761-1772.

［2］Cani PD，Osto M，Geurts L，et al.Involvement of gutmicrobiota in the developmentof low-grade inflammation and type2 diabetes associated with obesity[J].GutMicrobes，2012，3（4）：279-288.

［3］Cani PD，Bibiloni R，Knauf C，et al.Changes in gut microbiota control metabolic endotoxemia inflammation in high-fat dietinduced obesity and diabetes in mice[J].Diabetes，2008，57（6）：1470-1481.

［4］Kern M，Kl?ting N，Niessen HG，et al.Linagliptin improves insulin sensitivity and hepatic steatosis in diet-induced obesity[J].PLoSOne，2012，7（6）：e38744.

［5］Schürmann C，Linke A，Engelmann-Pilger K，et al.The dipeptidyl peptidase-4 inhibitor linagliptin attenuates inflammation and accelerates epithelialization in wounds of diabetic ob/ob mice[J].JPharmacol Exp Ther，2012，342（1）：71-80.

［6］Davidson EP，Coppey LJ，Holmes A，et al.Effect of inhibition of angiotensin converting enzyme and/or neutral endopeptidase on vascular and neural complications in high fat fed/low dose streptozotocin-diabetic rats[J].Eur JPharmacol，2012，677（1-3）：180-187.

［7］Thomas L，Eckhardt M，Langkopf E，et al.（R）-8-（3-aminopiperidin-1-yl）-7-but-2-ynyl-3-methyl-1-（4-methyl-quinazolin-2-ylmethyl）-3，7-dihydro-purine-2，6-dione（BI 1356），a novel xanthine-based dipeptidyl peptidase 4 inhibitor，has a superior potency and longer duration of action compared with other dipeptidyl peptidase-4 inhibitors[J].J Pharmacol Exp Ther，2008，325（1）：175-182.

［8］Cani PD.Gut microbiota and obesity：lessons from the microbiome[J].Brief Funct Genomics，2013，12（4）：381-387.

［9］McNelis JC，Olefsky JM.Macrophages，immunity，and metabolic disease[J].Immunity，2014，41（1）：36-48.

［10］Ghoshal S，Witta J，Zhong J，etal.Chylomicrons promote intestinal absorption of lipopolysaccharides[J].J Lipid Res，2009，50（1）：90-97.

［11］Shen W，Gaskins HR，McIntosh MK.Influence of dietary fat on intestinalmicrobes，inflammation，barrier function and metabolic outcomes[J].JNutr Biochem，2014，25（3）：270-280.

［12］Wang JH，Bose S，Kim GC，et al.Flos Lonicera ameliorates obesity and associated endotoxemia in rats through modulation of gut permeability and intestinal microbiota[J].PLoS One，2014，9（1）：e86117.

［13］Luk GD，Bayless TM，Baylin SB.Plasma postheparin diamine oxidase.Sensitive provocative test for quantitating length of acute intestinalmucosal injury in the rat[J].JClin Invest，1983，71（5）：1308-1315.

［14］Matikainen N，M?ntt?ri S，Schweizer A，etal.Vildagliptin therapy reduces postprandial intestinal triglyceride-rich lipoprotein particles in patients with type 2 diabetes[J].Diabetologia，2006，49（9）：2049-2057.

［15］Zhao Y，Yang L，Zhou Z.Dipeptidyl peptidase-4 inhibitors：multitarget drugs，not only antidiabetes drugs[J].JDiabetes，2014，6（1）：21-29.

Effects of linagliptin on metabolic endotoxem ia in type 2 diabetic rats

Pan Daoyan，Shen Jie，Zhu Xiao，Zhao Defu，Chen Zhi，Han Yajuan，LiWenting，Chen Yuancheng.Department of Endocrinology and Metabolism，The Third Affiliated Hospitalof Southern Medical University，Guangzhou 510630，China

Shen Jie，Email：shenjiedr@163.com

Objective To investigate the effects of linagliptin onmetabolic endotoxemia in ratswith type 2 diabetesmellitus（T2DM）induced by high fat feeding and low dose streptozotocin（STZ）.M ethods Ten of the 30 healthymale Sprague-Dawley rats were selected as normal control group according to random number and

basic diet，whereas the other 20 rats were fed with high-fat diet for 8 weeks and then treated with STZ intraperitoneal injection（35mg/kg）once to induce T2DM.Diabetes was successfully induced in 16 ratswhich were then randomly divided into linagliptin treatmentgroup（3mg·kg-1·d-1gavage，n=8） and T2DM control group（equivalent normal saline，n=8）according to random number.Four weeks later，fasting blood glucose，fasting blood insulin（FINS），triglyceride，totalcholesterol，portalblood plasma lipopolysaccharide（LPS），tumornecrosis factor-α（TNF-α），interleukin 6（IL-6）and diamine oxidase（DAO）weremeasured.Homeostasismodel assessment-insulin sensitive index（HOMA-ISI）and homeostasismodel assessment-insulin resistance index（HOMA-IR）were calculated.Results Compared with normal control group，the levelsof fasting blood glucose，F(xiàn)INS，HOMA-IR，triglyceride，total cholesteroland body weightwere all significantly increased in T2DM control group，whereas the ln（HOMA-ISI）was signifi-cantly reduced；compared with T2DM group，indexesmentioned above except body weightwere all improved in linagliptin treatment group（F=39.18-136.74，all P ＜0.01）；compared with normal control group，the levels of portal blood plasma LPS，TNF-α，IL-6 and plasma DAO increased in T2DM control group，but indexes mentioned abovewerealldecreased in linagliptin treatmentgroup（F=18.13-51.43，all P＜0.05）.Conclusion Linagliptin can improve themetabolic endotoxemia in ratswith T2DM induced by high fat feeding and STZ，and attenuatesystemic inflammation response.

Linagliptin；Type2 diabetesmellitus；Metabolic endotoxemia；Inflammation

（Int JEndocrinol Metab，2015，35：230-233）

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2015.04.004

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011B010500027）；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（S2013010016045）

510630 廣州，南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科

沈潔，Email:shenjiedr@163.com

2015-02-13）