糖尿病足患者創(chuàng)面肉芽組織中Angiomotin表達(dá)的探討

褚月頡 王鵬華 李代清 于德民

糖尿病足患者創(chuàng)面肉芽組織中Angiomotin表達(dá)的探討

褚月頡 王鵬華 李代清 于德民

目的 測(cè)定Angiomotin（Amot）蛋白在糖尿病足潰瘍患者創(chuàng)面肉芽組織中的表達(dá)，探討高糖及缺血對(duì)Amot表達(dá)的影響及其與潰瘍預(yù)后的關(guān)系。方法 選取天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院糖尿病足病科住院的糖尿病足潰瘍患者，均符合Wagner分級(jí)2～4級(jí)，共28例。根據(jù)潰瘍側(cè)踝肱指數(shù)（ABI）及HbA1c將糖尿病足潰瘍患者分為 4組：A組：ABI≥0.7，HbA1c＜9%；B組：ABI≥0.7，HbA1c≥9%；C組：ABI＜0.7，HbA1c＜9%；D組：ABI＜0.7，HbA1c≥9%，每組7例。以同時(shí)期足部燒傷患者為非糖尿病、非缺血對(duì)照組。取各組患者足潰瘍創(chuàng)面肉芽組織，應(yīng)用Western印跡法測(cè)定Amot蛋白的表達(dá)，每例糖尿病足患者進(jìn)行Wagner分級(jí)診斷并隨訪潰瘍的預(yù)后情況。結(jié)果 比較4組糖尿病足患者年齡、性別、糖尿病病程、并發(fā)癥、腎功能、血脂、超敏C反應(yīng)蛋白，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。與對(duì)照組相比，p80-Amot在B組和D組表達(dá)明顯減少（P均＜0.05）。與A組相比，p80-Amot在B組和D組表達(dá)明顯減少（P均＜0.05）。p130-Amot在各組間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組患者足潰瘍的預(yù)后情況沒(méi)有明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論 高血糖和缺血都會(huì)造成糖尿病足患者創(chuàng)面肉芽組織中Amot蛋白表達(dá)下降，其中高血糖的作用更顯著。Amot蛋白表達(dá)與潰瘍預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)。

Angiomotin；高糖；缺血；糖尿病足；潰瘍預(yù)后

糖尿病足潰瘍是與糖尿病相關(guān)的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，常導(dǎo)致患者疼痛和生活質(zhì)量下降[1]。糖尿病足潰瘍傷口愈合不良的機(jī)制非常復(fù)雜，其中在肉芽組織的形成過(guò)程中，血管新生障礙是導(dǎo)致糖尿病足潰瘍傷口愈合不良的重要原因。Angiomotin（Amot）是2001年發(fā)現(xiàn)的一種血管生成抑素結(jié)合蛋白[2]。其異構(gòu)體p80-Amot和p130-Amot分別在血管生成不同階段發(fā)揮不同作用。體外實(shí)驗(yàn)表明，p80-Amot可增強(qiáng)細(xì)胞遷移并穩(wěn)定管狀結(jié)構(gòu)，而p130-Amot則與肌動(dòng)蛋白相關(guān)并影響細(xì)胞塑形[3]。作為一種調(diào)節(jié)血管新生的蛋白，Amot通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成，在傷口愈合過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]。而Amot表達(dá)失調(diào)可能是糖尿病患者傷口愈合不良的發(fā)病原因。因此本研究測(cè)定了Amot在糖尿病足患者創(chuàng)面肉芽組織中的表達(dá)，旨在評(píng)價(jià)高血糖及缺血對(duì)Amot蛋白表達(dá)的影響，并進(jìn)一步分析其與潰瘍預(yù)后的關(guān)系，從而深入探討其在糖尿病缺血性潰瘍愈合的病理過(guò)程中發(fā)揮的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及分組 選取2011年2月至12月在天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院糖尿病足病科住院的糖尿病足潰瘍患者28例，其中男16例，女12例，平均年齡（63.64±9.59）歲。根據(jù)潰瘍側(cè)下肢缺血情況[踝肱指數(shù)（ABI）]及血糖控制情況（HbA1c）將患者分為 4組，每組 7例，A組：ABI≥0.7，HbA1c＜9%；B組：ABI≥0.7，HbA1c≥9%；C組：ABI＜0.7，HbA1c＜9%；D組：ABI＜0.7，HbA1c≥9%。另選取 7例同時(shí)期在天津武警醫(yī)院燒傷科住院的足部燒傷患者作為非糖尿病、非下肢缺血的對(duì)照組。對(duì)照組患者平均年齡（59.24±11.57）歲，其中男 5例，女2例，7例患者兩次隨機(jī)血糖均＜6mmol/L，患肢ABI均大于1.0。經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 臨床資料采集 各組患者由專業(yè)醫(yī)師進(jìn)行病史詢問(wèn)及體格檢查，并詳細(xì)記錄于病歷中。所有患者入院禁食12h，次日清晨采集肘靜脈血，采用ImxAnalizer全自動(dòng)生化儀測(cè)定尿素氮、肌酐、肝功能、血脂、血流變，用酶放大化學(xué)發(fā)光法測(cè)定HbA1c，采用免疫比濁法，應(yīng)用芬蘭Orion Dianostica公司試劑盒測(cè)定超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP），同時(shí)測(cè)定24 h尿微量白蛋白（UMA），并行ABI、雙下肢血管彩色多普勒、心電圖、眼底鏡檢查?？崭寡菫榛颊咦≡浩陂g用德國(guó)拜耳公司血糖儀測(cè)定的所有空腹血糖的平均值。對(duì)照組患者同時(shí)采集相應(yīng)的臨床資料。

1.3 糖尿病足臨床分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 采用Wagner分級(jí)法：0級(jí)，有發(fā)生足潰瘍危險(xiǎn)因素，目前無(wú)潰瘍；1級(jí)，表淺潰瘍，無(wú)感染；2級(jí)，較深潰瘍，常合并軟組織炎，無(wú)膿腫或骨的感染；3級(jí)，深部潰瘍，有膿腫或骨髓炎；4級(jí)，局限性壞疽；5級(jí)，全足壞疽[5]。

1.4 治療經(jīng)過(guò) 28例糖尿病足潰瘍患者入院后均選用胰島素控制血糖，下肢缺血患者給予前列腺素E1（凱時(shí)）改善血運(yùn)，神經(jīng)病變患者給予神經(jīng)妥樂(lè)平營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)。根據(jù)足分泌物培養(yǎng)的藥敏結(jié)果，結(jié)合臨床癥狀選用1～2種敏感抗生素控制感染。足潰瘍傷口每日用中藥敷料換藥，并根據(jù)創(chuàng)面情況進(jìn)行必要的清創(chuàng)及竇道沖洗治療。經(jīng)上述綜合治療后，病情仍無(wú)法控制甚至繼續(xù)惡化的患者及時(shí)進(jìn)行截趾（肢）手術(shù)，術(shù)后延續(xù)上述治療至創(chuàng)面愈合。對(duì)照組給予敏感抗生素控制感染，足潰瘍予換藥、清創(chuàng)及竇道沖洗治療。

1.5 Western印跡測(cè)定Amot蛋白的表達(dá) 分別提取各組患者足潰瘍傷口肉芽組織總蛋白，取等量蛋白（50μg）上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳（美國(guó)Bio-Rad公司），轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4℃過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h，洗膜，顯影。GAPDH為內(nèi)參，Amot一抗工作濃度為1∶100，GAPDH一抗及Amot二抗工作濃度為1∶5 000，GAPDH二抗工作濃度為1∶4 000。X光片經(jīng)圖像掃描儀進(jìn)行灰度掃描，以Amot與GAPDH的灰度比值表示Amot蛋白表達(dá)的相對(duì)值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患者臨床資料的比較 各組患者年齡、性別、糖尿病病程、各種合并癥情況、血脂、腎功能以及反映感染情況的hs-CRP差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。A組、C組空腹血糖和HbA1c低于B組、D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。A組、B組ABI高于C組、D組，A組、B組彩色多普勒所測(cè)量的雙下肢動(dòng)脈最大狹窄率低于C組、D組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

2.2 各組糖尿病足潰瘍患者Wagner分級(jí)情況 各組糖尿病足潰瘍患者中除A組、C組各有1例Wagner2級(jí)患者外，其余均為Wagner3級(jí)、4級(jí)患者（表2），表明入選病例足潰瘍程度較重，多數(shù)合并感染與局限性壞疽。

表1 各組糖尿病足患者臨床資料的比較（±s）

表1 各組糖尿病足患者臨床資料的比較（±s）

注：A組：ABI≥0.7，HbA1c＜9%；B 組：ABI≥0.7，HbA1c≥9%；C 組：ABI＜0.7，HbA1c＜9%；D 組：ABI＜0.7，HbA1c≥9%；ABI：踝肱指數(shù)；hs-CRP：超敏C反應(yīng)蛋白；與B組相比，a P＜0.01，與C組相比，b P＜0.01，與D組相比，c P＜0.01

表2 各組糖尿病足患者Wagner分級(jí)情況[n（%）]

2.3 各組患者足潰瘍傷口肉芽組織中Amot蛋白表達(dá)情況 與對(duì)照組相比，p80-Amot在B組、D組中表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。在各組糖尿病足潰瘍患者中，與A組相比，p80-Amot在B組、D組患者中表達(dá)也明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。而p130-Amot在各組間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 Amot蛋白在各組患者足潰瘍傷口肉芽組織中表達(dá)的差異

2.4 各組患者預(yù)后情況 各組足潰瘍患者預(yù)后情況見表3。其中約有2/3的患者經(jīng)治療后，足潰瘍創(chuàng)面愈合出院。約有1/3的患者經(jīng)上述治療后，潰瘍創(chuàng)面仍未愈合，門診繼續(xù)換藥治療。C組有1例缺血嚴(yán)重的患者，創(chuàng)面長(zhǎng)期不愈，患肢疼痛難忍而行高位截肢手術(shù)。各組患者預(yù)后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.833，P=0.077）。

表3 各組患者預(yù)后情況[n（%）]

3 討論

目前國(guó)內(nèi)、外還沒(méi)有更多關(guān)于Amot與傷口愈合方面的研究。鑒于Amot在促進(jìn)血管新生過(guò)程中所起的重要作用，推測(cè)其在肉芽組織的形成過(guò)程中也是重要的促進(jìn)因子。

本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組患者p80-Amot和p130-Amot表達(dá)量最多，在糖尿病足潰瘍的各組患者中，A組表達(dá)量最多，而D組表達(dá)量最少。表明高糖和缺血均可能會(huì)引起Amot蛋白表達(dá)的下降，從而影響肉芽組織中新生血管的形成，進(jìn)而造成潰瘍傷口難以愈合。與對(duì)照組及A組相比，p80-Amot在血糖控制差的兩組糖尿病足患者中的表達(dá)顯著減少，表明高濃度的葡萄糖較缺血對(duì)p80-Amot蛋白表達(dá)的影響更大。而p130-Amot在各組間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析原因，可能是由于p130-Amot與p80-Amot在血管新生的不同階段分別發(fā)揮不同的作用所致。有研究表明，p80-Amot可以增強(qiáng)細(xì)胞的遷移并穩(wěn)定管狀結(jié)構(gòu)，而p130-Amot則與肌動(dòng)蛋白相關(guān)并影響細(xì)胞的塑形[6]。Ernkvist等[6]研究分析了兩種Amot異構(gòu)體在小鼠胚胎視網(wǎng)膜血管生成過(guò)程中的表達(dá)，顯示p80-Amot主要在細(xì)胞遷移階段表達(dá)，而p130-Amot則主要在管狀結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和成熟階段表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了二者相互作用，共同調(diào)節(jié)血管新生。本試驗(yàn)中，各組患者肉芽組織的取材時(shí)間主要掌握在肉芽組織生長(zhǎng)的早期階段。此時(shí)，足潰瘍局部的感染情況已經(jīng)基本得到控制，壞死組織被清除，肉芽組織新鮮豐富。而這一時(shí)期正是血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及上皮細(xì)胞大量募集到傷口周圍，形成新生血管的時(shí)期。因此，在細(xì)胞遷移階段表達(dá)的p80-Amot可能在此期發(fā)揮更主要的作用，表達(dá)量也更高。因此，高糖和缺血對(duì)它的影響可能會(huì)更大。而p130-Amot則主要在血管形成的后期表達(dá)。所以，在本研究中雖然也發(fā)現(xiàn)了高糖和缺血使得p130-Amot表達(dá)下降，但差異并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步印證了Amot的兩種拓?fù)洚悩?gòu)體在血管新生的不同階段各自發(fā)揮不同的作用。

在糖尿病足潰瘍的各組患者間進(jìn)一步分析Amot蛋白表達(dá)與潰瘍預(yù)后的關(guān)系，各組患者足潰瘍的預(yù)后情況并沒(méi)有明顯的差異。分析原因，可能為：（1）影響潰瘍愈合的因素十分復(fù)雜，其中最重要的因素為感染。（2）Amot蛋白僅在傷口愈合過(guò)程中的某一個(gè)階段發(fā)揮作用，而其他諸多的蛋白因子，如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子的變化也會(huì)影響到傷口的愈合。本研究中只測(cè)定了Amot蛋白的表達(dá)情況，并未檢測(cè)其他的蛋白因子。因此試驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有顯示出Amot蛋白表達(dá)的差異與潰瘍愈合的相關(guān)性。由此可見，糖尿病足潰瘍難以愈合的機(jī)制非常復(fù)雜，還需進(jìn)一步探索。

［1］Cornell S，DorseyVJ.Diabetes pharmacotherapy in 2012：considerations inmedication selection[J].Postgrad Med，2012，124（4）：84-94.

［2］Troyanovsky B，Levchenko T，M?nsson G，et al.Angiomotin：an angiostatin binding protein that regulates endothelial cell migration and tube formation[J].JCell Biol，2001，152（6）：1247-1254.

［3］Bratt A，Birot O，Sinha I，et al.Angiomotin regulates endothelial cell-cell junctions and cell motility[J].JBiol Chem，2005，280（41）：34859-34869.

［4］Roy S，Khanna S，Rink C，et al.Characterization of the acute temporal changes in excisional murine cutaneous wound inflammation by screening of the wound-edge transcriptome[J].Physiol Genomics，2008，34（2）：162-184.

［5］許樟榮.糖尿病足病變?cè)\斷和治療[J].中國(guó)糖尿病雜志，2001，9（3）：180-183.

［6］Ernkvist M，Birot O，Sinha I，et al.Differential roles of p80-and p130-angiomotin in theswitch betweenmigration and stabilization of endothelial cells[J].Biochim Biophys Acta，2008，1783（3）：429-437.

Angiomotin expression in wound granulation tissues from patients w ith diabetic foot

Chu Yuejie*，Wang Penghua，Li Daiqing，Yu Demin.*Department of Diabetes Mellitus，Tianjin Chinese Medicine Research Institute Affiliated Hospital，Tianjin 300120，China

Wang Penghua，Email:wph200000@163.com

Objective To determine the expression of Angiomotin（Amot）in wound granulation tissues from patients with diabetic foot，and investigate the effects of high glucose and ischemia on the expression of Amot and the relationship between Amot expression and ulcer prognosis.M ethods Twenty-eight diabetic inpatients with foot ulcers（Wagner's 2-4 grade）from the Departmentof Diabetic Foot in the Metabolic Diseases Hospital of Tianjin Medical University，were divided into four groups according to theiranklebrachialindex（ABI）andHbA1c：group A：ABI≥0.7，HbA1c＜9%；group B：ABI≥0.7，HbA1c≥9%；group C：ABI＜0.7，HbA1c＜9%and group D：ABI＜0.7，HbA1c≥9%，with 7 cases in each group.Patients with foot burns at the same time were included as non-diabetic and non-ischemic control group.Wound granulation tissues were sampled from these patients.Western blotwas used to determine the expression of Amot.Wagner'sgradewasassessed in each patientwith diabetic footand the patientswere followed up for the evaluation of ulcer prognosis.Results The age，gender，course of diabetes，complications，renal function，blood lipid，and sensitive C reactive protein were compared，but no significant difference were found between four diabetic foot groups（allP＞0.05）.Compared with control group，expression of p80-Amot in group B and group D were significantly reduced （allP＜ 0.05）.Compared with group A，expression of p80-Amot in group B and group D were also significantly reduced（allP＜ 0.05）.Therewas no significant difference in expression ofp130-Amotbetween groups（P＞0.05）.Therewasalso no significantdifference in ulcerprognosisbetween groups（P＞0.05）.Conclusions High glucoseand ischemia decrease the expression of Amot in wound granulation tissues in patients with diabetic foot，and high glucose has a more potent effect.There is no significant relationship between Amotexpression and ulcer prognosis.

Angiomotin；High glucose；Ischemia；Diabetic foot；Ulcerprognosis

（Int JEndocrinolMetab，2015，35：226-229）

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2015.04.003

天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（10JCZDJC19800）；天津市衛(wèi)生局科技基金（09KZ87）

300120 天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院糖尿病科（褚月頡）；300070 天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院，衛(wèi)生部激素與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（王鵬華，李代清，于德民）

王鵬華，Email:wph200000@163.com

2014-12-01）