酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）與高效液相色譜（HPLC）法檢測糧谷中黃曲霉毒素B1方法比較

◎高延偉

（延安市食品質(zhì)量安全檢驗檢測中心，陜西 延安 716000）

黃曲霉毒素（AFT）是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物 質(zhì)，被世衛(wèi)組織癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為1類致癌物，在20余種黃曲霉毒素中尤以黃曲霉毒素B1（AFB1）最為危險。AFB1主要污染花生和玉米等糧谷食品，目前檢測方法主要為酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）以及高效液相色譜法（HPLC）。ELISA法操作簡便快捷，但重復(fù)性較差，且易出現(xiàn)假陰性結(jié)果；HPLC法定量準(zhǔn)確，重復(fù)性較好，但進(jìn)樣前需衍生，前處理相對復(fù)雜。本文分別采用ELISA和HPLC法檢測當(dāng)?shù)丶Z谷食品中AFB1，并對檢測結(jié)果進(jìn)行比較，比較這兩種檢測方法各自的優(yōu)缺點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇，色譜純；氯化鈉、冰乙酸、三氟乙酸，分析純。

AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，含量99.0%，美國RomerLabs公司。

ELISA試劑盒，美國Helica公司，配套相應(yīng)的反應(yīng)試劑。

MycoSepTM228 MFC多功能凈化柱，美國RomerLabs公司。

實驗用水均為美國Milli-Q實驗室超純水系統(tǒng)制備，滿足GB/T6682-2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》中一級水要求。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀，附熒光檢測器，日本島津公司。

Bio-Rad 1000 PCR儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 方 法

1.3.1 ELISA方法

稱取20.0 g充分粉碎的樣品于250 mL具塞錐形瓶中，加入100 mL甲醇-水（70+30）溶液后振搖30 min，經(jīng)微纖維濾紙過濾過濾，收集濾液。

從恒溫箱中取出ELISA試劑盒，室溫下平衡30 min；加入200 μL酶標(biāo)記物和100 μL標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品提取液于稀釋微孔中，吹吸混勻；轉(zhuǎn)移100 μL稀釋液至包被抗體的微孔中，室溫下孵育15 min；吸取250 μL蒸餾水洗板三次后，加入100 μL發(fā)色劑，充分混勻后暗處孵育5 min；加入100 μL停止液，在450 nm處測量吸光度值。

1.3.2 HPLC方法

稱取25.0 g充分粉碎的樣品于250 mL具塞錐形瓶中，加入125 mL乙腈-水（84+16）溶液和5 g氯化鈉，振蕩30 min，經(jīng)微纖維濾紙過濾，收集濾液。

移取6 mL濾液經(jīng)MFC多功能凈化柱凈化后取1 mL凈化液60 ℃下氮氣吹干，加入500 μL衍生劑，密封混勻30 s，65 ℃衍生8 min。將衍生后的溶液在60 ℃下氮吹至干，加入200 μL乙腈-水（17+83）溶液溶解，漩渦混勻30 s，3000 r/min離心15 min，取上清液供HPLC分析。

HPLC測定條件：色譜柱：SHISEIDO C18，3.0 mm×150 mm，5 μm；柱溫30 ℃；流動相：乙腈-水（17+83），0.8 mL/min；進(jìn)樣量：25 μL；熒光檢測器：激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 回收率及重現(xiàn)性

取未檢出AFB1的陰性樣品為空白對照，分別加入三個水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3方法分別采用ELISA和HPLC法進(jìn)行檢驗并計算回收率；同時對各加標(biāo)水平進(jìn)行6次平行試驗，計算重現(xiàn)性，結(jié)果見表1。

由表1可以看出HPLC較ELISA法回收率略高，重現(xiàn)性較好，檢測結(jié)果更加穩(wěn)定，說明對于樣品定量分析，HPLC法檢測結(jié)果更為可靠。

2.2 ELISA與HPLC法檢驗結(jié)果比較

分別用ELISA和HPLC法檢測20份樣品中AFB1含量并計算相對偏差，結(jié)果見表2。

表1 回收率及重現(xiàn)驗結(jié)果

表2 樣品檢測結(jié)果

由表2可以看出，ELISA和HPLC法檢測結(jié)果差異不大，但ELISA法易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

2.3 ELISA與HPLC法前處理時間比較

以處理12個樣品為例，分別記錄兩種檢測方法所需時間。ELISA法提取樣品30 min，孵育15 min，洗板3 min，顯色5 min，酶標(biāo)儀測定2 min，整個檢測過程約55 min，平均耗時約4.58 min/樣；HPLC法樣品提取30 min，凈化0.5 min，衍生8 min，兩次氮氣吹干約30 min，HPLC檢測15 min/樣，整個過程約249 min，平均耗時20.75 min/樣。由此可知，ELISA較HPLC法更加方便快捷，適用于大批量樣品的初篩。

3 結(jié)論

本文將ELISA和HPLC法比較后發(fā)現(xiàn)ELISA法快速、便捷，HPLC法重復(fù)性性好，定量準(zhǔn)確。在日常檢測工作中，兩種檢測方法可結(jié)合使用，可根據(jù)樣品量等選擇檢驗方法，當(dāng)樣品量較大時可先用ELISA法初篩，篩選出AFB1結(jié)果可疑的樣品再用HPLC法確認(rèn)。

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