香菇中粗多糖含量測定的方法比較

◎何東慧 郭曉燕

（譜尼測試集團股份有限公司，北京 100000）

香菇，又名香菌、花菇、冬菇、香蕈等，俗稱中國蘑菇，是一種重要的食藥用栽培真菌。香菇肉質(zhì)肥厚細(xì)嫩，味道鮮美，香氣獨特，營養(yǎng)豐富，是一種食藥同源的食物，具有很高的營養(yǎng)、藥用和保健價值。隨著人們生活水平的提高，香菇食品、藥品、保健品等制品將日益受到人們的青睞。

多糖是由多個單糖分子縮合、失水而成，是一類分子機構(gòu)復(fù)雜且龐大的糖類物質(zhì)。它包括有淀粉、纖維素、糖元等。一般檢測的粗多糖并不包含所有的多糖，是指從植物、中草藥或真菌中提取的活性多糖，具有水溶性。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到多糖具有極其重要的生物功能。多糖與免疫功能的調(diào)節(jié)、細(xì)胞與細(xì)胞的識別、細(xì)胞間物質(zhì)的轉(zhuǎn)運、癌癥的診斷與治療等都有著密切的關(guān)系，近年來又發(fā)現(xiàn)多糖的糖鏈能控制細(xì)胞的分裂和分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和衰老。

關(guān)于食用菌中粗多糖測定的方法沒有國家標(biāo)準(zhǔn)，只有一個農(nóng)業(yè)部推薦的方法。另外，《保健食品功效成分檢測方法》介紹了幾種粗多糖的測定方法。本文就香菇中粗多糖含量的測定方法：農(nóng)業(yè)部推薦方法和《保健食品功效成分檢測方法》中苯酚-硫酸法進行了一些介紹和討論。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

（1）干香菇；

（2）硫酸；

（3）無水乙醇；

（4）苯酚；

（5）80%乙醇溶液；

（6）葡萄糖，使用前應(yīng)于105℃烘干至恒重；

（7）80%苯酚溶液；

（8）5%苯酚溶液：吸取5mL苯酚溶液（2.1.7），溶于75mL水中，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配；

（9）100mg/L標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液：稱取0.1000g葡萄糖（2.1.6）于100mL燒杯中，加水溶解，定容至1000mL，置4℃冰箱中貯存。

1.2 儀器

紫外可見分光光度計；分析天平，感量為0.001g；超聲提取器；離心機。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗原理

在硫酸作用下，粗多糖先水解為單糖，單糖迅速脫水生成糖醛衍生物，該衍生物與苯酚反應(yīng)生成的溶液在490nm下有特征吸收，以此測定樣品中粗多糖含量。

1.3.2 樣品的提取

方法一：稱取0.5g左右粉碎過20mm孔徑篩的樣品，置于50mL具塞離心管內(nèi)，加5mL水浸潤樣品，然后緩慢加入20mL無水乙醇（即溶液中乙醇的濃度為80%），使用渦旋振蕩器振搖，使混合均勻，于4℃冰箱中靜置4小時以上，在以4000r/min離心5min，棄去上清液。不溶物用10mL乙醇溶液洗滌、離心。用水將上述不溶物轉(zhuǎn)移入圓底燒瓶，加入50mL蒸餾水，裝上磨口的空氣冷凝管，于沸水浴中提取2h。冷卻至室溫，過濾，將上清液轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用水洗滌殘渣2～3次，洗滌液轉(zhuǎn)至容量瓶中，加水定容。此溶液為樣品測定液。

方法二：稱取混合均勻的樣品1.0～2.0g，置于100mL容量瓶中，加水80mL左右，于沸水浴中加熱1小時，冷卻至室溫后補加水至刻度，混勻后過濾，棄去初濾液。準(zhǔn)確吸取5mL濾液置于50mL離心管中，加入無水乙醇20mL，混勻，于4℃冰箱靜置4小時以上，以4000r/min離心5min，棄去上清液，殘渣用80%乙醇溶液10mL洗滌，離心后棄去上清液。殘渣用水溶解并定容至50mL。此溶液為樣品溶液。

線性方程為y=9.418 4x+0.008 3，R2=0.999 6

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

方法一：分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖工作溶液置于20mL具塞玻璃試管中，用蒸餾水補至1.0mL。向試液中加入1.0mL苯酚溶液，然后快速加入5.0mL硫酸（與液面垂直加入，勿接觸試管壁，以便與反應(yīng)液充分混合），靜置10min。使用渦旋振蕩器使反應(yīng)液充分混合，然后將試管放置于30℃水浴中反應(yīng)20min，490nm測吸光值。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

方法二：吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖工作液的體積及試劑加入量同方法一，試劑加入后，置于沸水浴中加熱15min，冷卻后，同樣在490nm測吸光值。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 測定

分別吸取方法一和方法二的樣品溶液1mL于20mL具塞試管中，分別按1.3.3步驟操作，測定吸光度。同時做空白試驗。

1.3.5 結(jié)果計算

樣品中粗多糖含量按下面兩個公式計算。

方法一：

其中：X—樣品中粗多糖含量，g/100g；

C1—方法一中從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品定容液中含糖量，mg；

C2—方法二中從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品定容液中含糖量，mg；

m1—方法一中樣品質(zhì)量，g；

m2—方法二中樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照上述方法要求，分別繪制方法一和方法二的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)序列分別見表1和表2，曲線線性圖見圖1和圖2。從圖1和圖2看出，方法二的線性要比方法一線性好。

表1 方法一葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)序列表

圖1 方法一葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

線性方程為y=9.139 7x+0.002 3，R2=0.996 4

表2 方法二葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)序列表

圖2 方法二葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 兩種方法的精密度分析

按照上述兩種方法分別測定同一個干香菇樣品，測定結(jié)果見表3。通過數(shù)據(jù)比較得出，兩種方法測定結(jié)果比較接近，但方法二的精密度較高。

2.3 兩種方法的準(zhǔn)確度分析

分別對兩種方法進行加標(biāo)回收實驗，實驗數(shù)據(jù)見表4。由于加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液為單糖溶液，再加入乙醇進行分離時，葡萄糖很容易被分離出去，故標(biāo)品均在顯色前加入，所以兩種方法的準(zhǔn)確度都很好。

表3 樣品測定結(jié)果

表4 樣品加標(biāo)回收實驗

2.4 兩種測定法的比較

從分析結(jié)果來看，兩種方法測定結(jié)果沒有明顯的差異。下面對這兩種方法的區(qū)別、優(yōu)缺點分別進行分析。

表5 兩種測定方法的區(qū)別

2.4.1 兩種測定方法的區(qū)別

兩種測定方法的區(qū)別見表5。

2.4.2 兩種方法優(yōu)缺點

兩種方法的優(yōu)缺點見下表6。

表6 兩種方法優(yōu)缺點

3 結(jié)論

香菇中粗多糖的測定方法比較簡單，但實際操作過程比較麻煩，要注意的方面很多。比色法測定多糖并非特異性反應(yīng)，方法靈敏度高，在測定過程中會出現(xiàn)偏差較大的結(jié)果，主要是操作不夠嚴(yán)謹(jǐn)所致，反復(fù)沉淀、洗滌、棄上清液、樣液的轉(zhuǎn)移等都是造成測定結(jié)果偏差的原因。在操作過程中要多思考，控制好操作過程，這樣才能得到較好的實驗結(jié)果。

[1]王國佳,曹紅.香菇多糖的研究進展[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報,2011(5):451-455.

[2]李月梅.香菇的研究現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J].微生物學(xué)通報,2005(4):149-152.

[3]張軍霞,胡喜巧.香菇多糖幾種提取方法的比較[J].河南科技學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版,2008(1):45-49.

[4]郭金龍,陳有君.苯酚-硫酸法的改進發(fā)展[J].食品科學(xué),2008(12):555-558.

[5]王超,張曜武.苯酚-硫酸法測定杏鮑菇多糖方法的研究[J].天津化工,2011(6).

[6]白鴻.保健食品功效成分檢測方法[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2011.

[7]耿安靜,陳健.香菇精多糖乙醇沉淀規(guī)律的研究[J].食品科學(xué), 2010(4):99-102.

[8]閆巧娟,韓魯佳,江正強,等.黃芪多糖分子量的分布研究[J].食品科學(xué),2004(8):27-31.