沉默G250基因對腎癌786-0細胞移植瘤Skp2表達的影響

沉默G250基因對腎癌786-0細胞移植瘤Skp2表達的影響

趙俊峰肖耀軍1姜耀東2趙善超2楊旭凱3鄭少斌2

(河南省中醫(yī)院河南中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院泌尿外科，河南鄭州450002)

摘要〔〕目的探討沉默G250基因對腎癌786-0細胞移植瘤S期激酶相關蛋白2(Skp2)表達的影響。方法構建靶向G250的siRNA表達質粒pshRNA-G250并轉染腎癌786-0細胞，12只BALB/c裸鼠分為陰性對照組和干擾成瘤組，干擾成瘤組每只裸鼠皮下接種5×106個G250基因沉默后的腎癌786-0細胞(786-0/si-G250-b)，以轉染空質粒的細胞(786-0/si-G250-0)為對照。成瘤3 w后，處死裸鼠后切取瘤塊，采用組織芯片技術及免疫組化SP法檢測Skp2的表達。結果5×106個細胞皮下接種BALB/c裸鼠3 w后均成瘤，Skp2在陰性對照組和干擾成瘤組裸鼠的腫瘤組織中表達率分別為83.33%(5/6)和16.67%(1/6)，兩者有顯著性差異(P=0.04)。結論G250基因表達沉默抑制了腎癌細胞移植瘤Skp2的表達。

關鍵詞〔〕G250基因；S期激酶相關蛋白2；腫瘤相關抗原；RNA干擾；腎細胞癌；體內

中圖分類號〔〕R737.11〔

基金項目：鄭州市科技攻關項目(No.109TGS486-9)

通訊作者：楊旭凱(1970-),男,副主任醫(yī)師,主要從事腎癌的基礎及臨床研究。

1廣東省武警醫(yī)院泌尿外科

2南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院泌尿外科

3蘭州軍區(qū)總醫(yī)院泌尿外科

第一作者：趙俊峰(1966-)，男，主任醫(yī)師，主要從事腎臟腫瘤的RNA干擾以及臨床方面的研究。

腎癌是老年人常見的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制至今不清，多數(shù)研究顯示G250(又稱MN/CAⅨ)基因可誘導細胞惡性表型〔1〕，并參與了腎臟腫瘤細胞的生長與轉移。也有研究顯示S期激酶相關蛋白2(Skp2)對腎臟腫瘤的形成有一定影響〔2〕。本研究在成功構建腎癌相關抗原G250 siRNA表達載體〔3〕和完成G250基因沉默后裸鼠成瘤體內實驗〔4〕的基礎上，利用RNA干擾(RNAi)技術阻斷G250基因表達，觀察了G250基因沉默對腎癌786-0細胞體內成瘤及生長的影響。

1材料和方法

1.1材料與試劑人腎透明細胞癌786-0細胞株(以下稱腎癌786-0細胞)及大腸桿菌(DH5α)由南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院泌尿外科保存。4～6 w的12只BALB/c裸鼠為SPF級，體重15～20 g，雌雄各半，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，在南方醫(yī)院SPF實驗動物中心飼養(yǎng)。OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基及RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(GIBCO公司)，lipofectamineTM2000(Invitrogen 公司)，G418及DEPC(Sigma公司)，空質粒pRNAT-U6.1/Neo (GenScript公司)，限制性內切酶BamHⅠ、Hind Ⅲ、KpnⅠ、T4 DNA連接酶、T4磷酸化酶、質粒提取試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)(Promega公司)、鼠抗人Skp2 mAb、SP試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑(中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2方法

1.2.1siRNA靶序列的設計和質粒的構建G250 mRNA的全長序列從NCBI基因庫(Genebank登錄號:AJ010588)檢索得出。應用Primer express軟件按照siRNA的設計原則尋找含21個堿基的特異性序列。在前期實驗的基礎上，選擇最有效的G250的siRNA片段，靶位點293～313，根據(jù)pRNAT-U6.1/Neo質粒的結構，設計出特異性干擾片段的核苷酸序列：5′-GGATCCCATTTAGGCTTAACTTCAGGTATTGATATCCGTACCTGAAGTT AAGCCTAAATTTTTTTCCAAAAGCTT-3′，5′-AAGCTTTTGGAAA AAAATTTAGGCTTAACTTCAGGTACGGATATCAATACCTGAAGT TAAGCCTAAATGGGATCC-3′。序列送由南京金思特公司合成。將退火后shRNA寡核酸雙鏈和pRNAT-U6.1/Neo酶切產物按3∶1混合，T4DNA連接酶27℃連接過夜，轉化感受態(tài)DH5α。然后提取待測的重組質粒。酶切鑒定正確后取1 ml轉化菌液，送金思特公司測序。

1.2.2siRNA轉染及建立穩(wěn)定干擾G250基因抗性單克隆腎癌786-0細胞培養(yǎng)時，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI1640。轉染前24 h，傳代至24孔板，每孔1.5×105個細胞。用LipofectamineTM2000進行轉染。轉染后6 h換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，加入選擇性培養(yǎng)基進行篩選，根據(jù)G418對腎癌786-0細胞在14 d內的殺滅效果，選擇600 μg/ml作為篩選濃度。篩選培養(yǎng)2 w后可見抗性克隆長出，挑取單克隆轉入24孔板逐漸擴大培養(yǎng)，4 w左右可獲得穩(wěn)定干擾抗性單克隆。

1.2.3實驗分組和建立腫瘤動物模型將皮下注射轉染空質粒的腎癌細胞的(786-0/si-G250-0)裸鼠作為對照組，轉染RNA干擾片斷細胞(786-0/si-G250-b)的為實驗組，每組6只。對數(shù)生長期的786-0/si-G250-0和786-0/si-G250-b細胞經(jīng)胰酶消化，離心收集，計數(shù)后分別重懸于無血清RPMI 1640培養(yǎng)基中，配制成每0.1 ml含5×106個腫瘤細胞的懸液，用1 ml注射器將0.1 ml細胞懸液皮下注射于BALB/c裸鼠背部皮下，每一個部位注射5×106個細胞的懸液。

1.2.4腫瘤生長情況監(jiān)測自腫瘤細胞注射第10日起，每天觀察裸鼠成瘤情況，待腫瘤出現(xiàn)后每3 d用毫米游標卡尺測量腫瘤的長、寬、高最大垂直直徑(mm)，分別以a、b、c表示，依據(jù)腫瘤體積計算公式：V(mm3)=a×b×c/2〔5〕。在成瘤后的第3周處死裸鼠，切取腫瘤組織備用。

1.2.5組織芯片的制作

1.2.5.1制作組織蠟塊切取腫瘤組織，約1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm。用10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水石蠟包埋。對所有標本組織蠟塊常規(guī)切片、蘇木素-伊紅HE染色并作形態(tài)學觀察，選擇有代表性的腫瘤區(qū)域，在相應位置進行標記。

1.2.5.2制作包含120個點的組織芯片使用組織微陣列儀(MTA-1)制作受體空白蠟塊。大小2.0 cm×2.0 cm×1.0 cm，設計12×10點組織陣列。每個微陣列蠟塊包含120個標本。根據(jù)各標本HE染色切片標記的部位。用直徑為0.6 mm的供體針在蠟塊相應部位取樣。每例標本選定2個不同取樣位點，將供體組織芯放入受體蠟塊，組織芯間距0.4 mm。在組織樣本填入蠟孔時記錄每個樣本在二維陣列中的具體位置。并在一定位置上標記出組織微陣列的方位。置入烤箱低溫烘烤約1 h，封蠟，冷卻，制成兩個組織微陣列蠟塊。再以4 μm厚切片，裱于載玻片，制成組織芯片備用。

1.2.6免疫組化檢測SP免疫組化染色方法嚴格按SP試劑盒說明書操作。DAB溶液顯色。用已知乳腺癌標本作陽性對照，用TBS代替一抗作陰性對照。

1.2.7結果判定參考Langner等〔6〕的經(jīng)驗制定判定標準：Skp2在胞核或胞核胞質中均表達為陽性，僅在胞質中表達為陰性。隨機取5個高倍視野，計算每個高倍視野中陽性細胞數(shù)占腫瘤細胞總數(shù)的百分比，最后計算5個高倍視野的平均百分比。Skp2陽性細胞數(shù)<10%為陰性(-)，>10%為陽性(+)。結果判定由兩人共同完成，取二者平均值。

1.3統(tǒng)計學方法應用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件進行χ2檢驗及方差分析。

2結果

2.1G250基因表達沉默對腎癌786-0細胞體內成瘤的影響將786-0/si-G250-0和786-0/si-G250-b細胞接種6只裸鼠均成瘤，成瘤率分別為100%。實驗組的成瘤時間(15±2.4)d較對照組延長〔(11±1.5)d〕(t=3.381，P=0.007)，說明G250基因表達水平降低后腎癌786-0細胞在動物體內的成瘤能力受到抑制。

2.2兩組腎細胞癌組織中Skp2的表達成瘤3 w后，處死裸鼠，切取腫塊用組織芯片技術及免疫組化SP法檢測Skp2的表達，Skp2主要在細胞核中表達，在細胞質中也有部分表達。陽性染色呈現(xiàn)粗大棕黃色顆粒，見圖1。Skp2在對照和實驗組裸鼠的腫瘤組織中表達率分別為83.33%(5/6)和16.67%(1/6)差異顯著(P=0.04)。

實驗組

對照組

圖1兩組裸鼠腫瘤組織中Skp2表達(DAB，×400)3討論

腎腫瘤是泌尿系最常見的惡性腫瘤，死亡率高〔7〕。2013年美國統(tǒng)計新發(fā)腎腫瘤占所有新發(fā)實體腫瘤的3%〔8〕。腎癌的發(fā)生發(fā)展與多種癌基因及抑癌基因的異常激活、表達有關。G250基因表達在腎透明細胞癌發(fā)病中的作用尚不明確，研究顯示G250基因可能是一種癌基因，而且對腫瘤轉移有促進作用〔9〕。為進一步了解該基因在腎癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，在成功設計構建、篩選及鑒定G250基因有效siRNA干擾序列基礎上，通過人工誘導RNA干擾(RNAi)技術實現(xiàn)了對G250基因持續(xù)穩(wěn)定的抑制，觀察到G250基因表達沉默后，腎癌786-0細胞成瘤時間較對照組明顯延長，同一時期腫瘤體積較對照組明顯減小，說明G250基因沉默能有效抑制腎癌786-0細胞裸鼠皮下移植瘤的生長，不僅進一步證實G250基因在促進細胞增殖、轉化方面有重要的作用〔10〕，也提示該基因的作用可能比目前了解的要多，需要進一步探討。

惡性腫瘤的發(fā)生也與細胞周期調控機制出現(xiàn)紊亂從而導致細胞的失控性生長有關。而細胞周期主要由正負調控因子調控。其中細胞周期負性調控因子能夠抑制多種G1期cyclin-CDK激酶活性，使細胞不能通過G1期，從而防止細胞過度增殖形成腫瘤，其缺失與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展有關。Skp2是一種泛素-蛋白酶體途徑的底物識別序列。能特異作用于磷酸化的細胞周期負性調控因子，可使其通過泛素-蛋白酶體途徑降解〔2〕。本研究提示在腎細胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中，Skp2的高表達可能提示細胞周期負性調控因子的降解減少，這時細胞異常增殖不能得到有效抑制〔11〕，從而促進了腎細胞癌的發(fā)生和發(fā)展。因此，Skp2蛋白表達水平對判斷腎細胞癌的發(fā)展和預后也可能具有重要意義。

由于觀察到G250基因表達沉默后，體內腫瘤細胞成瘤能力明顯下降，造成腫瘤生長速度減慢，說明本文設計的小分子干擾RNA在體內穩(wěn)定的發(fā)揮了作用，導致G250基因沉默，同時Skp2也出現(xiàn)表達降低，不僅證實了siRNA技術的持久、高度特異和高效的抑制靶基因表達的優(yōu)勢〔12〕，也提示G250和Skp2在腎腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能有更多的作用。

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〔2013-11-15修回〕

(編輯袁左鳴)