不同程度間歇性低氧對大鼠不同腦區(qū)Bax、Bcl-2表達的影響

不同程度間歇性低氧對大鼠不同腦區(qū)Bax、Bcl-2表達的影響

趙雅寧王紅陽1李琳1馬素慧

(河北聯合大學康復醫(yī)學院，河北唐山063000)

摘要〔〕目的觀察不同程度間歇性低氧后大鼠不同腦區(qū)Bax、Bcl-2表達變化，探討阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)神經損傷機制。方法30只雄性SD大鼠隨機分成對照組、輕度間歇低氧組、重度間歇低氧組各10只。對照組暴露于空氣中，間歇低氧組分別暴露于不同低氧條件下(100 ml/L和50 ml/L，暴露時間每天8 h，持續(xù)時間2 w和8 w)。光鏡觀察額葉皮質、紋狀體、海馬區(qū)和小腦神經細胞結構變化，免疫組化檢測上述區(qū)域Bax、Bcl-2表達變化。結果與對照組比較，隨低氧時間的延長，兩組間歇性低氧組大鼠額葉皮質、紋狀體、海馬區(qū)和小腦神經細胞區(qū)死亡神經元密度增高；Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05)；上述變化在重度間歇性低氧組最為顯著(P<0.05)；輕度間歇性低氧組各腦區(qū)死亡神經元密度、Bcl-2/Bax比值變化差異顯著，以額葉皮質和海馬最明顯(P<0.05)；重度間歇性低氧組各腦區(qū)死亡神經元密度、Bcl-2/Bax比值變化差異顯著，以皮質、海馬和紋狀體區(qū)最明顯。結論間歇性低氧可引起不同腦區(qū)Bcl-2和Bax差異性表達、神經細胞差異性丟失；皮質、海馬和紋狀體對間歇性低氧損傷更敏感。

關鍵詞〔〕低氧；凋亡；Bcl-2；Bax

中圖分類號〔〕R563.3〔

基金項目：河北省科技廳資助項目(No. 09276103D-11)

通訊作者：王紅陽(1958-)，女，教授，博士，主要從事呼吸病學研究。

1河北聯合大學附屬醫(yī)院

第一作者：趙雅寧(1974-)，女，博士，副教授，主要從事呼吸病學研究。

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS) 患者睡眠時反復出現不同程度的低氧血癥和(或)高碳酸血癥，最終引起全身多系統(tǒng)、多器官的漸進性損害。臨床資料顯示OSAHS可造成患者警覺、執(zhí)行能力和運動協(xié)調方面的認知障礙，而智能、語言障礙屬于相對較輕〔1,2〕。在整個認知形成過程中，腦內各個腦區(qū)發(fā)揮的作用并不相同，如額葉和基底節(jié)與人類高級認知即執(zhí)行功能密切相關；紋狀體主要對運動和技巧進行協(xié)調。本研究在參考其他學者慢性間歇性缺氧模型基礎上，利用實時氧監(jiān)測的反饋信號模擬臨床呼吸暫停事件的真實狀態(tài)，研究不同間歇性低氧狀態(tài)下不同腦區(qū)腦組織形態(tài)、Bax、Bcl-2表達。

1材料和方法

1.1實驗動物、試劑及儀器雄性SD大鼠60只〔(北京維通利華公司，合格證SCXK(京)2002-003)〕，體質量310～350 g；Bax和Bcl-2試劑盒購自中杉生物有限公司(北京)；測氧儀(建德市梅城電化分析儀器廠)；低氧控制程序(天津醫(yī)科大學總醫(yī)院呼吸科)；純氮(天津六方氣體高科技有限公司)；低氧艙(天津醫(yī)科大學研制)。

1.2動物分組和模型制備30只雄性SD大鼠隨機分成對照組、輕度間歇低氧組(暴露低氧條件100 ml/L，輕度組)和重度間歇低氧組(暴露低氧條件50 ml/L，重度組)各10只。間歇低氧組每天8:00～16:00將實驗動物置于模型艙內，向艙內循環(huán)充入氮氣和空氣，每次循環(huán)2 min，連續(xù)給予氮氣30 s，分別維持艙內氧濃度最低至10%和5%(100 ml/L和50 ml/L)，隨后均復氧至氧濃度21%。對照組持續(xù)充入壓縮空氣。用數字測氧儀監(jiān)測艙內氧濃度變化，使艙內氧濃度維持在各自的氧濃度內，使其氧濃度波動范圍在±0.5%以內。實驗結束將實驗動物取出，送入常規(guī)飼養(yǎng)箱內自由飲水與攝食，生活環(huán)境及飼養(yǎng)條件相同。各組每天實驗8 h,實驗持續(xù)時間為2、8 w。對照組暴露于正?？諝庵?；分別在實驗第2、8 w進行所設指標檢測。

1.3腦組織形態(tài)結構觀察光鏡(H-E染色)：各組個時間點5只動物，在規(guī)定時間點以戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg),用40 g/L多聚甲醛經左心室灌注固定后取腦,后固定24 h ,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋，切片,片厚5 μm。切片二經甲苯脫蠟,梯度乙醇降至水, 蘇木精-伊紅染色。每只鼠連續(xù)3張冠狀背側海馬切片，采用圖像分析儀(美國Bio-Rad公司)計數正常神經元，取均值。

1.4免疫組織化學法檢測Bax和Bcl-2常規(guī)麻醉動物，開胸、暴露心，4%多聚甲醛行心灌流，斷頭取腦，在視交叉后1、6 mm處冠狀面切開，取中間塊入4%多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋，切片(片厚5 μm)。切片常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鹽微波修復，分別滴加Bax或Bcl-2抗體(1∶200)， 濕盒中4 ℃過夜，IgG抗體-HRP多聚體(PV 二步法)，37 ℃溫箱 30 min，DAB 顯色，脫水、透明、封片。以 PBS代替一抗作陰性對照。鏡下觀察并攝片。陽性率的定量分析: 每個標本取 4張切片，每張切片在海馬隨機選取 4 個視野，用Motic Med 6.0數碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)分析其積分光密度(IOD)值的大小來表示,并作為分析對象進行比較。

1.5統(tǒng)計學處理應用SPSS17.0軟件進行方差分析。

2結果

2.1病理結果光鏡：對照組額葉皮質、紋狀體、海馬區(qū)和小腦神經細胞形態(tài)基本結構正常，排列整齊致密，偶見變性壞死的神經元；輕度和重度間歇性低氧組中，隨缺氧時間延長神經元結構出現明顯損傷改變，表現為細胞變性水腫和死亡形態(tài)的神經細胞。與對照組比較，兩組間歇低氧組額葉皮質、紋狀體、海馬區(qū)和小腦區(qū)死亡神經元密度隨缺氧時間延長明顯增加(P<0.05)；重度組和輕度組比較，腦區(qū)存死亡經元密度進一步增加(P<0.05)；輕度組各腦死亡活神經元密度比較差異有統(tǒng)計學意義，以額葉皮質和海馬區(qū)最明顯；重度組各腦區(qū)死亡神經元密度比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，以額葉皮質、海馬區(qū)和紋狀體最明顯。見表1。

組別額葉區(qū)海馬區(qū)紋狀體小腦區(qū)對照組2w1.36±0.581.38±0.581.43±0.581.42±0.568w1.42±0.581.37±0.571.41±0.481.36±0.58輕度組2w4.60±1.601)5.50±1.871)2.97±0.761)3)2.78±0.691)3)8w7.68±2.731)9.95±3.861)5.36±1.541)3)4.48±1.701)3)重度組2w9.03±2.781)2)10.56±3.231)2)8.48±2.731)2)3)6.36±1.581)2)3)4)8w12.85±3.961)2)13.70±3.361)2)12.10±4.101)2)3)9.42±2.821)2)3)4)

與對照組對應時間點比較:1)P<0.05；與輕度組對應時間點比較:2)P<0.05；與同組同時間點額葉區(qū)比較:3)P<0.05；與同組同時間點紋狀體比較:4)P<0.05，下表同

2.2Bax和Bcl-2免疫組織化學結果顯微鏡下觀察Bax、Bcl-2陽性細胞呈棕黃色，胞質著色；對照組額葉皮質、紋狀體、海馬區(qū)和小腦偶見陽性細胞出現；輕度和重度組中，隨缺氧時間延長Bax和Bcl-2均表達增高。與對照組比較，間歇低氧組額葉皮質、紋狀體、海馬區(qū)和小腦區(qū)Bcl-2/Bax比值均增加，但隨缺氧時間延長明顯降低(P<0.05)；重度組和輕度組比較，腦區(qū)Bcl-2/Bax比值進一步降低(P<0.05)；輕度組各腦區(qū)Bcl-2/ Bax比值比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，以額葉皮質和海馬區(qū)最明顯；重度組各腦區(qū)Bcl-2/ Bax比值比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，以額葉皮質、海馬區(qū)和紋狀體最明顯(表2)。

組別額葉皮質海馬區(qū)紋狀體小腦區(qū) 對照組2w0.242±0.0300.25±0.0420.232±0.0510.223±0.0628w0.233±0.060.243±0.0710.244±0.0620.234±0.052 輕度組2w3.791±1.1241)3.670±1.3641)5.936±1.1281)3)7.423±1.1461)3)8w2.689±0.8261)2.382±0.8431)4.048±1.0061)3)5.366±1.1081)3) 重度組2w2.399±0.7621)2)2.147±0.5861)2)3.408±0.3121)2)3)5.415±0.8251)2)3)4)8w1.592±0.4901)2)1.382±0.6261)2)2.208±0.3721)2)3)3.842±0.6731)2)3)4)

3討論

以往的研究多是針對腦內某一部位損傷后患者出現某種認知障礙的變化，實際上，認知形成過程中不同腦區(qū)相互協(xié)調，相互影響。例如額葉處于額葉-紋狀體環(huán)路的調控中心，其損傷后患者解決問題的技巧最容易受到影響和損傷，而基底節(jié)通過輸出核(蒼白球、丘腦底核、黑質網狀結構)經腹外側丘腦傳送信息至運動皮質，完成一般軀體調控、動眼調控、邊緣調控和前額葉調控等功能，其損傷后亦可出現認知活動中的信息加工困難〔3～5〕。本研究結果提示一方面間歇低氧對神經組織的損傷大腦皮層大于小腦等其他部位，同時不同程度間歇性低氧誘導不同腦區(qū)神經細胞死亡程度是不同的，這可能是OSAHS患者存在不同程度和性質的認知功能障礙的主要原因之一。

Bcl-2/bax是Bcl-2家族中一對重要因子，二者比值的變化是決定細胞凋亡敏感性的變阻器〔6〕。研究已經證實Bax與線粒體ANT作用使MPTP開放、線粒體膜的通透性增加、Cytc釋放、細胞凋亡，而Bcl-2通過調節(jié)線粒體內外膜之間基質的pH值，增加質子流出，提高鈣離子緩沖力，穩(wěn)定線粒體膜結構，維持線粒體跨膜電位來抑制細胞凋亡〔7，8〕。此外Bcl-2表達可引起細胞核谷胱苷肽(GSH)的積聚，導致核內氧化還原平衡的改變，保持缺氧/復氧細胞線粒體成分完整，促進ATP再生，抑制細胞凋亡〔9〕。本研究結果提示間歇性低氧早期，抗凋亡的保護性作用占優(yōu)勢;而隨時間延長和程度的加重,兩者比值下降,神經元受損程度也逐漸加重,趨于死亡，本研究推測不同腦區(qū)Bcl-2和Bax蛋白含量增加以及兩者比值失衡，導致不同腦區(qū)神經元發(fā)生凋亡、丟失，存活神經元密度降低的機制之一。

總之，本實驗證實了不同程度間歇性低氧導致額葉皮質、海馬區(qū)，紋狀體和小腦部位神經細胞丟失，Bcl-2和Bax參與間歇性低氧神經損傷過程；Bcl-2和Bax在不同腦區(qū)差異表達和不同腦區(qū)神經細胞丟失的差異性可能在一定程度上解釋了OSAHS患者認知功能損害的原因。

4參考文獻

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〔2012-03-15修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)