涼血通瘀方對(duì)腦缺血大鼠血液系統(tǒng)及腦損傷的影響

涼血通瘀方對(duì)腦缺血大鼠血液系統(tǒng)及腦損傷的影響

蔣寶平田磊1許立

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210023)

摘要〔〕目的探討涼血通瘀方對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血大鼠血液系統(tǒng)及腦損傷的影響。方法采用插線阻斷大鼠腦中動(dòng)脈法制備腦缺血模型，觀察涼血通瘀方低、中、高劑量對(duì)腦缺血模型大鼠的行為學(xué)評(píng)分、腦梗死率，血漿中活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)、纖維蛋白原(FIB)，血清中組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、纖溶酶原激活物抑制因子(PAI)-1、β血小板球蛋白(TG)、血小板因子 (PF)4等指標(biāo)的影響。結(jié)果涼血通瘀方中、高劑量能減輕模型大鼠腦損傷；延長(zhǎng)血漿APTT、PT、TT，降低血漿中FIB含量；增加血清中t-PA含量，降低血清中PAI-1、β-TG、PF4含量。結(jié)論涼血通瘀方能改善腦缺血大鼠凝血-抗凝血-纖溶系統(tǒng)功能，減輕缺血引起的腦損傷。

關(guān)鍵詞〔〕涼血通瘀方；腦缺血；凝血系統(tǒng)

中圖分類號(hào)〔〕R285.5〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(81102885)；江蘇省自然科學(xué)基金(No.BK2007242)；國(guó)家973計(jì)劃(2006CB504807)；江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(2014年)

通訊作者：許立(1964-)，男，教授，主要從事心腦血管與毒理學(xué)研究。

1南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院

第一作者：蔣寶平(1981-)，女，碩士，助理研究員，主要從事心血管藥理研究。

Effects of liangxuetongyu on hematological system and brain injury after cerebral ischemia in rats

JIANG Bao-Ping,TIAN Lei, XU Li.

Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023, Jiangsu, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of liangxuetongyu on hematological system and brain injury after cerebral ischemia in rats.MethodsThe model was reproduced by middle cerebral artery occlusion (MCAO). The following indexes including behavior grade, ratio of cerebral ischemia,the contents of activated partial thromboplastin time(APTT), prothrombin time (PT), thrombin time(TT) and fibrinogen(FIB) content in plasma, contents of tissue-type plasminogen activator(t-PA), plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1), beta-thromboglobulin(β-TG), platelet factor 4(PF4)in serum were evaluated after administrated with liangxuetongyu.ResultsLiangxuetongyu significantly decreased the injury of cerebral ischemia, prolonged APTT,TT,PT and decreased FIB content in plasma, increased t-PA and decreased PAI-1, β-TG, PF4 contents in serum.ConclusionsLiangxuetongyu could improve coagulation and anticoagulant and fibrinolytic system and protect the damaged brain.

【Key words】Liangxuetongyu;Cerebral ischemia; Hematological system

涼血通瘀方由丹皮、赤芍、水牛角等中藥組方而成，是名老中醫(yī)周仲瑛教授經(jīng)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐所得的經(jīng)驗(yàn)方之一。該方具有涼血清熱、化瘀通滯之功效，臨床用以治療缺血性中風(fēng)急性期，取得了較好的療效。本研究觀察涼血通瘀方對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血大鼠血液系統(tǒng)及腦損傷的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD雄性老年大鼠，清潔級(jí)，體重(350±20)g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(浙)2008-0033。

1.2實(shí)驗(yàn)用藥涼血通瘀方含丹皮10 g、赤芍15 g、水牛角30 g、熟大黃10 g、廣地龍10 g，藥材均購(gòu)自亳州市豪門中藥飲片有限公司，生產(chǎn)批號(hào)分別為(130326、131201、100318、130116、130501)，由南京中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室鑒定。藥材先冷水浸泡 2 h，第一次煎2 h，第二次煎1 h，兩次水煎液混合后過(guò)濾，濃縮成含生藥2 g/ml的濃縮藥液，高壓滅菌后冷藏備用。低劑量為藥物臨床常規(guī)用量。

1.3主要試劑紅四氮唑(TTC)(華東師范大學(xué)化工廠，批號(hào)：20090918)；纖溶酶原激活物抑制因子(PAI)-1、β血小板球蛋白(TG)、血小板因子(PF)4、組織型纖溶酶原激活劑(tPA)ELISA試劑盒(南京建成生物研究所，批號(hào)：131127)；活化部分凝血酶原時(shí)間(APTT)試劑盒、纖維蛋白原(FIB)試劑盒；凝血酶原時(shí)間(PT)試劑盒；凝血酶時(shí)間(TT)試劑盒(北京世帝科學(xué)儀器公司，批號(hào)分別為：ST20202、ST20401、ST20102、ST20302)。

1.4動(dòng)物分組、造模及給藥大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、涼血通瘀方高、中、低劑量組。采用線拴法復(fù)制大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型〔1〕，假手術(shù)組大鼠除不插尼龍線外其余步驟同其他組。假手術(shù)組、模型組均給予蒸餾水，涼血通瘀方高、中、低劑量組分別給予10.0、5.0、2.5 g(生藥)/kg。各組分別于造模前預(yù)先連續(xù)灌胃給藥7 d，造模前1 h和造模后23 h分別再給藥1次，給藥容積均為5 ml/kg。24 h后，動(dòng)物麻醉，取血，部分抗凝取血漿，部分不抗凝離心分離血清，并處死動(dòng)物取腦進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1行為學(xué)評(píng)分分別于大鼠手術(shù)后4 h和24 h，參照5級(jí)評(píng)分法〔2〕，對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，0分：無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

1.5.2腦梗死率、腦指數(shù)及腦含水量測(cè)定手術(shù)后24 h取腦并切片，采用三苯甲基四唑氮(TTC)染色法進(jìn)行梗死區(qū)染色，分離梗死區(qū)域并稱重，計(jì)算梗死率。另取動(dòng)物取腦，稱濕重，烘干至恒重(約48 h)，即干重，計(jì)算腦指數(shù)和腦含水量。梗死率(%)=〔梗死區(qū)重(g)/腦濕重(g)〕×100 %，腦指數(shù)=〔腦濕重(g)/體重(g)〕×100，腦含水量(%)=〔腦濕重(g)-腦干重(g)〕/腦濕重(g)×100%。

1.5.3凝血指標(biāo)取各組動(dòng)物血漿，按試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)APTT、PT、TT、FIB。

1.5.4血清中tPA、PAI-1、β-TG、PF4檢測(cè)取各組動(dòng)物血清，按ELISA試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)tPA、PAI-1、β-TG、PF4。

2結(jié)果

2.1對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血大鼠腦損傷的影響與假手術(shù)組比較，腦缺血模型大鼠4、24 h神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯增加(P<0.01)，腦梗死率、腦指數(shù)和腦含水量均明顯升高(P<0.05，P<0.01)；涼血通瘀方高、中劑量能明顯降低腦缺血大鼠模型4、24 h神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及腦指數(shù)(P<0.05，P<0.01)；涼血通瘀方高劑量能拮抗腦缺血引起的腦梗死率升高(P<0.05)；涼血通瘀方有降低腦含水量的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血大鼠血漿中APTT、PT、TT、FIB的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血漿中APTT、PT和TT均明顯縮短，F(xiàn)IB含量明顯升高(P<0.05，P<0.01)；涼血通瘀方高劑量可明顯減緩腦缺血大鼠血漿中APTT、PT和TT的縮短及FIB含量的增加(P<0.05，P<0.01)；中劑量亦可減輕腦缺血大鼠血漿中APTT和TT的縮短及FIB含量的升高(P<0.05)；低劑量可對(duì)抗腦缺血引起的大鼠血漿中TT縮短(P<0.05)。見表2。

組別神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分4h24h腦梗死率(%)腦指數(shù)腦含水量(%)假手術(shù)組0.25±0.460.13±0.350.00±0.000.40±0.0279.66±1.39模型組3.38±0.522)2.88±0.352)7.82±5.442)0.45±0.021)82.69±2.352)涼血通瘀方低劑量組2.75±0.712.50±0.535.05±2.540.42±0.0381.18±2.09涼血通瘀方中劑量組2.63±0.523)2.38±0.523)4.69±2.990.42±0.023)80.93±2.06涼血通瘀方高劑量組2.38±0.744)2.13±0.354)2.89±2.103)0.41±0.024)80.82±1.81

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

組別APTT(s)PT(s)TT(s)FIB(g/L)假手術(shù)組41.3±4.121.8±0.445.8±1.31.68±0.17模型組36.4±4.51)17.5±0.72)35.4±2.12)2.20±0.252)涼血通瘀方低劑量組39.7±1.817.7±1.338.5±3.63)2.01±0.09涼血通瘀方中劑量組40.3±2.33)18.2±0.940.0±5.73)1.98±0.103)涼血通瘀方高劑量組40.6±2.73)19.7±1.24)42.1±4.24)1.96±0.113)

2.3對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血大鼠血清中tPA、PAI-1含量的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中tPA含量明顯降低、PAI-1含量明顯升高(P<0.01)；涼血通瘀方中、高劑量均能明顯升高腦缺血大鼠血清中tPA含量，且明顯降低PAI-1含量(P<0.01)。見表3。

2.4對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血大鼠血清中β-TG、PF4含量的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中β-TG、PF4含量明顯升高(P<0.01)；涼血通瘀方中、高劑量均能明顯降低腦缺血大鼠血清中的β-TG、PF4含量(P<0.01，P<0.05)，低劑量可明顯降低腦缺血大鼠血清中的PF4含量(P<0.05)。見表4。

組別tPA(pg/ml)PAI-1(pg/ml)假手術(shù)組251.28±67.2745.56±7.27模型組107.39±21.291)68.85±9.331)涼血通瘀方低劑量組139.67±47.1860.71±18.13涼血通瘀方中劑量組146.09±38.093)54.49±11.583)涼血通瘀方高劑量組207.97±37.894)45.35±10.664)

組別β-TG(pg/ml)PF4(pg/ml)假手術(shù)組24.31±2.8631.42±5.42模型組51.26±11.281)99.41±10.741)涼血通瘀方低劑量組46.13±8.6981.88±14.133)涼血通瘀方中劑量組40.21±9.173)76.68±17.504)涼血通瘀方高劑量組31.76±7.544)58.93±8.854)

3討論

機(jī)體在正常生理狀態(tài)下，血液的凝血-抗凝-纖溶系統(tǒng)始終保持著動(dòng)態(tài)平衡。血栓前狀態(tài)(PTS)是指由多種因素引起血液系統(tǒng)功能的失調(diào)及障礙，是一種有血栓形成傾向但尚未形成血栓的病理過(guò)程〔1～3〕。PTS與眾多疾病的形成有關(guān)，若PTS出現(xiàn)在腦部，即會(huì)導(dǎo)致缺血性中風(fēng)。有研究表明缺血性中風(fēng)實(shí)為血凝脈內(nèi)之瘀血，阻塞腦脈，其發(fā)病本質(zhì)為血瘀〔4〕。因此能否改善血液流變學(xué)系統(tǒng)是評(píng)價(jià)治療腦缺血藥物療效的重要因素之一。也是中醫(yī)或西醫(yī)治療缺血性中風(fēng)的共同治則。

PTS形成的主要原因是多種血液學(xué)指標(biāo)異常。血液流速減慢、黏度增加是PTS形成的主要原因之一。APTT、PT、TT、FIB是評(píng)價(jià)PTS的綜合性指標(biāo)，t-PA、PAI-1、PF4、β-TG是評(píng)價(jià)PTS的特異性診斷指標(biāo)〔5，6〕。大量研究表明，缺血性中風(fēng)與這些指標(biāo)密切相關(guān)〔7～9〕。APTT反映了機(jī)體內(nèi)源性凝血是否正常；PT是外源性凝血系統(tǒng)的篩選指標(biāo)；FIB 可引起紅細(xì)胞聚集，促進(jìn)血小板活化形成血栓；TT反映了血漿中FIB的反應(yīng)性，TT縮短可見于機(jī)體的纖溶活力降低，血漿FIB含量增加。因此，APTT、PT、TT縮短，F(xiàn)IB含量增加表明血液呈高凝狀態(tài)〔10，11〕。纖溶系統(tǒng)是體內(nèi)預(yù)防血栓形成的重要保護(hù)機(jī)制，機(jī)體凝血及纖溶系統(tǒng)功能與PAI-1和t-PA的水平有關(guān)〔12〕。t-PA可以選擇性作用于纖溶酶原，激活纖溶酶原生成纖溶酶，促使血栓溶解。PAI-1作為一種重要的纖溶酶原激活物抑制劑，是血液呈高凝狀態(tài)的顯著標(biāo)志〔13〕。PAI-1一旦被激活，即可與t-PA結(jié)合，使t-PA失去活性，從而抑制纖溶系統(tǒng)的活性。因此，t-PA活性降低、PAI-1活性升高，可使血液纖溶系統(tǒng)的功能下降，血栓形成；反之則血栓溶解〔14〕。β-TG和PF4是血小板α顆粒分泌的兩種特異性蛋白質(zhì)〔15〕，反映血小板的釋放功能，兩者含量增加說(shuō)明血小板功能增強(qiáng)，含量降低，表明血小板功能減弱〔10〕。

本研究結(jié)果說(shuō)明涼血通瘀方具有涼血通瘀，熄風(fēng)通絡(luò)之功效，它能通過(guò)改善凝血-抗凝血-纖溶系統(tǒng)、抑制血小板激活，發(fā)揮治療和保護(hù)腦缺血損傷作用。

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〔2013-11-07修回〕

(編輯袁左鳴)