海藻糖對(duì)異氟烷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)APP基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

海藻糖對(duì)異氟烷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)APP基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

張成媛樸美花劉楠苑野馮春生

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院麻醉科，吉林長(zhǎng)春130021)

摘要〔〕目的探討吸入麻醉藥異氟烷對(duì)轉(zhuǎn)APP基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響及海藻糖的干預(yù)保護(hù)作用。方法60只12月齡轉(zhuǎn)APP小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(Control組)、異氟烷組(Iso組)、海藻糖組(Iso+Tre組)，每組20只。Iso+Tre組和Iso組分別于麻醉前30 min腹腔注射海藻糖400 μg/kg或等量生理鹽水，然后給予1.4 %異氟烷吸入麻醉2 h，麻醉后24 h應(yīng)用Morris水迷宮測(cè)試小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，麻醉后6、24 h殺鼠取腦，采用TUNEL染色觀察各組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)Aβ含量，Western印跡法檢測(cè)Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá)變化。結(jié)果與Control組相比，Iso組小鼠總體的平均逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，空間探索時(shí)間明顯縮短(P<0.01)，海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)、Aβ含量、Bax/Bcl-2比值及Caspase-3表達(dá)均明顯增加(P<0.01)；Iso+Tre組與Iso組相比，逃避潛伏期縮短，空間探索時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05)，Aβ含量、Bax/Bcl-2比值及Caspase-3表達(dá)均明顯減少(P<0.01)。結(jié)論海藻糖能夠改善異氟烷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)APP基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的損害，減少海馬神經(jīng)元的凋亡及Aβ的生成。

關(guān)鍵詞〔〕海藻糖；異氟烷；學(xué)習(xí)記憶；β-淀粉樣蛋白；神經(jīng)元凋亡

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R338；R614〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81271215；No.81141065)

通訊作者：馮春生(1971-)，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事麻醉學(xué)研究。

第一作者：張成媛(1984-)，女，在讀碩士，主要從事全麻藥對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能的影響及其機(jī)制研究。

Effects of trehalose on learning and memory impairment induced by isoflurane in APP transgenic mice

ZHANG Cheng-Yuan, PIAO Mei-Hua, LIU Nan,etal.

Department of Anestic, the First Hospital, Jilin University, Changchun 130021, Jilin, China

Abstract【】ObjectiveTo observe the influence of inhalation anesthestic isoflurane on the learning-memory ability of APP transgenic mice and protective effects of trehalose.Methods60 APP transgenic mice at the age of 12 months were divided into control, Iso and Iso+Tre groups. The abilities of learning and memory were investigated by Morris water maze. TUNEL assay was employed to observe the hippocampal neuron apoptosis of the mice in each group. The amount of Aβ was checked by ELISA assay kit and the variations of Bcl-2, Bax, Caspase-3 were examined by Western blot.ResultsIn comparison with those of control group, the mean escape latency of Iso group was prolonged, the spatial exploring time was reduced, apoptotic index, the amount of Aβ, the ratio of Bax/Bcl-2, and the expression of Caspase-3 were increased. Moreover, compared to those of Iso group, escape latency of Iso+Tre was shorter, longer spatial exploring time was longer, the amount of Aβ, ratio of Bax/Bcl-2, and Caspase-3 expression were lower.ConclusionsTrehalose could improve the recovery of the learning and memory of APP transgenic mice after isoflurane anesthesia, the hippocampal neuron apoptosis and the production of Aβ can be inhibited by trehalose.

【Key words】Trehalose; Isoflurane; Learning and memory; Amyloid β-peptide; Neuron apoptosis

一些研究認(rèn)為〔1，2〕，異氟烷等吸入麻醉藥可能引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡，增加β-淀粉樣蛋白(Aβ)的沉積，加重阿爾茨海默病(AD)患者的認(rèn)知功能障礙，成為AD發(fā)生發(fā)展的潛在危險(xiǎn)因素。海藻糖是一種穩(wěn)定的非還原性二糖，因其對(duì)生物分子的特殊保護(hù)作用，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。目前已有報(bào)道認(rèn)為〔3〕，海藻糖能夠減輕Aβ寡聚體的神經(jīng)毒性，抑制細(xì)胞死亡，阻斷和逆轉(zhuǎn)神經(jīng)退行性疾病的病理過(guò)程。本研究以轉(zhuǎn)淀粉樣前體蛋白(APP)基因小鼠作為AD動(dòng)物模型，觀察海藻糖對(duì)吸入麻醉藥異氟烷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)APP小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶功能損害的影響。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組12月齡轉(zhuǎn)APP基因小鼠60只(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，雌雄各半，體重18～22 g，隨機(jī)分為三組(n=20)：空白對(duì)照組(Control組)、異氟烷組(Iso組)、海藻糖組(Iso+Tre組)。

1.3方法

1.3.1模型制備Iso+Tre組于麻醉前30 min給予腹腔注射海藻糖(400 μg/kg，稀釋于2 ml生理鹽水中)，Iso組腹腔注射2 ml生理鹽水。將轉(zhuǎn)APP基因小鼠置于自制的麻醉箱中，并連于麻醉機(jī)螺紋管回路中，吸氧濃度60%，氧流量1 L/min，先給予轉(zhuǎn)APP基因小鼠3 %異氟烷進(jìn)行麻醉誘導(dǎo)，待翻正反應(yīng)消失〔約(10±2)min〕后，給予1.4 %異氟烷持續(xù)吸入2 h，Control組不給任何藥物，只吸入含60%氧氣的空氧混合氣體2 h。麻醉過(guò)程中維持小鼠自主呼吸，觀察小鼠皮膚顏色及呼吸頻率，麻醉結(jié)束后置于氧濃度為60 %的環(huán)境中自然蘇醒。

1.3.2行為學(xué)檢測(cè)每組隨機(jī)抽取8只轉(zhuǎn)APP基因小鼠于麻醉后24 h開(kāi)始進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，水池直徑120 cm，高60 cm，水溫(25±1)℃，等分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個(gè)象限，實(shí)驗(yàn)歷時(shí)6 d，第1～5天為定位航行實(shí)驗(yàn)，圓形平臺(tái)直徑6 cm，置放于第Ⅲ象限正中，低于水面1 cm。分別將三組小鼠從4個(gè)象限面向池壁放入水中，入水至登上隱蔽平臺(tái)的時(shí)間為逃避潛伏期，每只小鼠每天于固定時(shí)間段訓(xùn)練4輪，計(jì)算某時(shí)間段的平均逃避潛伏期。第6天將平臺(tái)撤除，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，選定和原平臺(tái)區(qū)域?qū)?yīng)的象限終點(diǎn)為入水點(diǎn)，記錄小鼠120 s內(nèi)在原平臺(tái)所在象限的滯留時(shí)間，即為空間探索時(shí)間。

1.3.3海馬組織切片原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)染色異氟烷麻醉結(jié)束后6 h，每組隨機(jī)抽取6只轉(zhuǎn)APP基因小鼠，灌注固定后殺鼠取腦，石蠟包埋后，在視交叉后1～4 mm處切取10 μm的冠狀位腦片，每隔5片選一片，每只小鼠選用3張腦片，常規(guī)脫蠟水合后加入蛋白酶K，37℃孵育30 min，每個(gè)樣本加入50 μl TUNEL反應(yīng)混合液(50 μl TdT+450 μl熒光素標(biāo)記的dUTP)，陽(yáng)性對(duì)照樣本加入100 μl DNase I反應(yīng)液，陰性對(duì)照樣本中加入50 μl不含TdT酶的反應(yīng)液，加入含HRP的熒光素抗體37℃孵育30 min，選用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染后，400倍顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞，鏡下出現(xiàn)細(xì)胞核呈桔紅色、胞質(zhì)不著色、染色質(zhì)呈塊狀凝聚或裂解成顆粒狀的細(xì)胞，即為陽(yáng)性染色細(xì)胞。

1.3.4ELISA法檢測(cè)Aβ1～42含量麻醉結(jié)束后24 h將每組剩余6只轉(zhuǎn)APP基因小鼠處死，分離海馬組織，取一側(cè)海馬稱(chēng)重后超聲粉碎10～15次，17 000 r/min，4℃離心1 h，取中間層含Aβ的組織液作為ELISA檢測(cè)的樣本，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.5Western印跡檢測(cè)Bcl-2、Bax、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3的表達(dá)取小鼠另一側(cè)海馬，加入細(xì)胞裂解液提取海馬總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，0.5%脫脂奶粉封閉2 h后加入Ⅰ抗，即兔抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3多克隆抗體(1∶1 000)，孵育過(guò)夜，常規(guī)洗膜后與Ⅱ抗即HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(1∶2 000)室溫反應(yīng)1 h，洗膜后采用Image J軟件測(cè)定各條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與相應(yīng)β-actin灰度值的比值作為Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白的表達(dá)水平。

#0是規(guī)模最大的聚類(lèi)，主要研究高端模擬教學(xué)試驗(yàn)、多種教學(xué)法相結(jié)合、團(tuán)隊(duì)合作學(xué)習(xí)在護(hù)理學(xué)基礎(chǔ)教學(xué)中的應(yīng)用價(jià)值與應(yīng)用效果以及病理學(xué)、臨床微生物學(xué)、藥學(xué)等學(xué)科的實(shí)驗(yàn)教學(xué)體系的應(yīng)用、改革與創(chuàng)新；#1主要研究循證護(hù)理、術(shù)后護(hù)理與術(shù)后健康教育、并發(fā)癥、術(shù)中護(hù)理安全及防范措施等；#2主要研究早期糖尿病腎病評(píng)估與診斷以及糖尿病腎病的臨床護(hù)理與治療；#3主要研究植物藥材揮發(fā)油的抗腫瘤作用及其化學(xué)成分的研究；#4主要研究軸掃技術(shù)在CT腹部檢查中的作用以及體層攝影術(shù)在臨床檢查、診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

2結(jié)果

2.1Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

2.2.1定位航行試驗(yàn)隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，各組小鼠平均逃避潛伏期均呈逐漸縮短趨勢(shì)。第1天至第4天，Iso組平均逃避潛伏期〔(72.69±12.15)s〕與Control組〔(51.23±10.29)〕s相比明顯延長(zhǎng)(P<0.01)；Iso+Tre組〔(55.06±12.35)s〕與Iso組相比逃避潛伏期縮短(P<0.05)；第5天3組小鼠逃避潛伏期均無(wú)明顯差異(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1　各組轉(zhuǎn)APP基因小鼠平均逃避潛伏期趨勢(shì)圖

2.1.2空間探索實(shí)驗(yàn)Iso組空間探索時(shí)間〔(28.85±5.41)s〕比Control組〔(41.25±8.32)s〕明顯縮短(P<0.01)；Iso+Tre組〔(38.01±7.51)s〕與Iso組比較，空間探索時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.01)；Iso+Tre組與Control組相比無(wú)明顯差異(P<0.05)。

2.2TUNEL染色結(jié)果海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)(AI)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)+陰性細(xì)胞數(shù))×100 %。Iso組陽(yáng)性細(xì)胞較多，細(xì)胞核呈橘紅色，胞質(zhì)不著色，染色質(zhì)呈塊狀凝聚或裂解成顆粒狀，使圓形核致密深染或見(jiàn)多個(gè)細(xì)小顆粒聚集，Iso組神經(jīng)元凋亡指數(shù)(0.713%±0.041%)明顯高于Control組(0.159%±0.065%)(P<0.01)，Iso+Tre組神經(jīng)元凋亡指數(shù)(0.287%±0.094%)比Iso組明顯降低(P<0.01)，但與對(duì)照組相比仍有差異(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2　各組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡

2.3ELISA檢測(cè)結(jié)果Iso組Aβ1～42含量〔(9 908.18±1 103.44)pmol/g腦組織〕明顯高于Control組〔(7 858.21±1 003.12)pmol/g腦組織〕(P<0.01)；Iso+Tre組〔(8 025.41±668.75)pmol/g腦組織〕與Iso組相比較，Aβ1～42含量明顯下降(P<0.01)，與Control組比較無(wú)明顯差異(P<0.05)。

2.4Western印跡檢測(cè)結(jié)果與Control組相比，Iso組小鼠海馬組織Caspase-3 、Bax基因表達(dá)顯著增強(qiáng)，Bax/Bcl-2比值升高，Bcl-2基因表達(dá)減少(P<0.01)；Iso+Tre組比Iso組小鼠海馬組織Caspase-3、Bax基因表達(dá)明顯減少，Bax/ Bcl-2比值降低，Bcl-2基因表達(dá)增加(P<0.01)，但與Control組相比仍有差異(P<0.01)。見(jiàn)表2，圖3。

組別Bcl-2BaxCaspase-3Bax/Bcl-2Control組1.141±0.2510.104±0.0230.152±0.0240.089±0.029Iso組0.325±0.0521)1.302±0.2111)1.125±0.2211)4.112±0.0241)Iso+Tre組0.711±0.1541)2)0.412±0.0531)2)0.534±0.0751)2)0.578±0.0221)2)

與Control組比較：1)P<0.01；與Iso組比較：2)P<0.01

圖3　各組小鼠海馬組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)

3討論

轉(zhuǎn)APP基因小鼠是目前應(yīng)用最廣泛的AD動(dòng)物模型之一，其相關(guān)的病理改變與人類(lèi)相似，過(guò)度表達(dá)突變的人類(lèi)APP基因，導(dǎo)致Aβ1～42沉積、斑塊形成，9月齡即可表現(xiàn)出認(rèn)知功能下降，可用于排除手術(shù)等環(huán)境因素的干擾，單獨(dú)討論麻醉對(duì)AD病理過(guò)程的影響〔4〕。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是評(píng)估嚙齒類(lèi)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的重要手段之一，考察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的空間定向和定位能力，對(duì)海馬結(jié)構(gòu)受損尤其敏感。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明異氟烷能夠損害小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，這種損害的程度可能隨著時(shí)間推移減弱，提示異氟烷麻醉可能對(duì)轉(zhuǎn)APP基因小鼠的遠(yuǎn)期認(rèn)知功能有所影響；而麻醉前給予海藻糖能夠明顯縮短異氟烷麻醉后小鼠的逃避潛伏期，延長(zhǎng)其空間探索時(shí)間，表明使用海藻糖干預(yù)能在短時(shí)間內(nèi)阻止異氟烷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)APP基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能損害。

AD的病理改變包括老年斑形成、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)元減少等，細(xì)胞凋亡是引起神經(jīng)元減少的重要原因。海馬結(jié)構(gòu)在學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中起至關(guān)重要的作用，也是AD患者最早、最易受損的部位，海馬神經(jīng)元凋亡破壞了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的完整性，是AD發(fā)病的重要機(jī)制〔5〕。Bcl-2家族和Caspase在線(xiàn)粒體凋亡通路中具有重要意義。Bcl-2家族分為兩類(lèi)，一類(lèi)是抗凋亡基因，代表基因是Bcl-2基因；一類(lèi)為促凋亡基因，代表基因?yàn)锽ax基因〔6，7〕。Bcl-2蛋白能與Bax蛋白形成Bcl-2-Bax異源二聚體，抑制Bax的作用，保護(hù)細(xì)胞不進(jìn)入凋亡程序，因此觀察Bcl-2與Bax的比值比二者的絕對(duì)量更有意義。常用吸入麻醉藥異氟烷具有潛在的神經(jīng)毒性作用，有研究證實(shí)其通過(guò)對(duì)Bcl-2和Bax的差異性影響，導(dǎo)致Caspase-3的表達(dá)和活性改變，進(jìn)而引起腦神經(jīng)凋亡〔8〕。此外，Bcl-2家族蛋白能和線(xiàn)粒體膜上的其他孔蛋白相互作用，形成一個(gè)無(wú)選擇性的通透性轉(zhuǎn)換孔(PTP)。Zhang等〔9〕的研究發(fā)現(xiàn)，異氟烷能夠通過(guò)增加活性氧類(lèi)物質(zhì)的產(chǎn)生，誘導(dǎo)線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔打開(kāi)，導(dǎo)致線(xiàn)粒體被破壞，線(xiàn)粒體膜蛋白含量減少，降低ATP的水平，進(jìn)一步引起Caspase家族激活以及細(xì)胞凋亡，最終產(chǎn)生學(xué)習(xí)和記憶功能的損害。

Aβ是老年斑的核心成分，最近有研究證實(shí)，在表現(xiàn)出明顯的認(rèn)知功能障礙或癡呆癥狀之前的10～15年，即可發(fā)生Aβ蛋白水平升高、聚集和形成斑塊等一系列早期病理改變〔10〕。Aβ由APP經(jīng)β分泌酶和γ分泌酶作用后生成，有Aβ1～40和Aβ1～42兩種形式，Aβ1～40含量較多，可見(jiàn)于正常老年人及AD患者；Aβ1～42主要見(jiàn)于AD患者腦中，更易于聚集，具有很強(qiáng)神經(jīng)毒性〔11〕。Aβ1～42的異常聚集形成淀粉樣斑塊是各種原因誘發(fā)AD的共同通路，與Aβ1～40相比，患者腦脊液中Aβ1～42濃度的改變更能反映AD的嚴(yán)重程度〔12〕。Aβ寡聚體通過(guò)激活小膠質(zhì)細(xì)胞，釋放補(bǔ)體、細(xì)胞因子、自由基等免疫分子，從而造成神經(jīng)元功能損害〔13〕。此外，體外試驗(yàn)證實(shí)，Aβ1～42能夠引起B(yǎng)ax/Bcl-2比值升高，決定細(xì)胞受誘導(dǎo)后更傾向于凋亡〔14〕。結(jié)果表明長(zhǎng)時(shí)間吸入異氟烷麻醉使轉(zhuǎn)APP基因小鼠腦內(nèi)Aβ1～42含量明顯升高，加速AD模型小鼠的神經(jīng)退行性改變，這與Perucho等〔2〕的研究結(jié)果相類(lèi)似。

海藻糖是一種安全的天然糖類(lèi)，對(duì)生物分子具有特異性保護(hù)作用，目前未見(jiàn)與劑量相關(guān)的不良反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，麻醉前給予海藻糖干預(yù)，能夠有效拮抗異氟烷引起的轉(zhuǎn)APP基因小鼠海馬結(jié)構(gòu)的病理改變，作用于線(xiàn)粒體凋亡通路，抑制Bcl-2、Bax、Caspase-3的活化，減少神經(jīng)元凋亡并能降低海馬Aβ的含量，從而有效改善轉(zhuǎn)APP基因小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能，為尋找更加安全有效的麻醉方案提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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〔2013-12-02修回〕

(編輯袁左鳴)