石斛蘭葉片再生體系的建立

馮 瑩，賴鐘雄

(1.泉州師范學院資源與環(huán)境學院，福建 泉州362000;2.福建農林大學園藝植物生物工程研究所，福建福州350002)

石斛蘭(Dendrobium species.)是蘭科石斛屬多年生植物，屬于“四大洋蘭”之一，除了具有藥用價值外，還具有較高的觀賞價值[1].自然條件下，石斛蘭分株能力弱，繁殖速度慢，不能滿足市場和消費者的需求.1960年法國人Morel[2]利用莖尖組織培養(yǎng)無病毒植株，創(chuàng)立石斛無性繁殖技術，隨后，石斛蘭的研究備受關注[3－19，24－25]，馮瑩等[3]以石斛蘭原球莖為材料，利用外源激素和糖優(yōu)化原球莖的生長，為石斛蘭遺傳轉化提供了良好的受體材料.以石斛蘭原球莖為受體材料采用甘露醇預處理提高遺傳轉化效率[4]，并獲得轉化ACS反義基因的轉基因植株[5].目前，石斛蘭離體培養(yǎng)研究主要從以莖段或莖尖為材料建立再生體系[6－10]、成熟或未成熟種胚為材料建立再生體系[12，13]、壯苗生根優(yōu)化[14，15]、原球莖增殖優(yōu)化[3，16，17]等方面開展，而以葉片外植體進行石斛蘭離體再生體系建立的報道較少[18，19].此外，石斛蘭葉片再生體系建立為石斛蘭遺傳轉化、受體系統(tǒng)優(yōu)化等相關研究奠定堅實的基礎.本文以葉片為材料研究了石斛蘭離體再生途徑的建立，旨在解決葉片難誘導原球莖問題和提高石斛蘭的再生能力，為保護瀕危植物資源和基因工程研究提供有效的參考價值.

1 材料與方法

1.1 材料

石斛蘭(Dendrobium spp.)葉片.

1.2 外植體消毒

將葉片置于流水中沖洗30 min，75%酒精浸30 s后，用0.1%升汞消毒8 min，最后用無菌水沖洗3次，獲得無菌外植體.

1.3 方法

1.3.1 原球莖誘導 分別將無菌葉片切割成 0.5 cm×(0.3－0.5)cm 小塊接種于 KC+6-BA(2.0、4.0、6.0 mg·L－1)+NAA(0.5、1.0 mg·L－1)培養(yǎng)基中，30 d 后統(tǒng)計原球莖的誘導率.各組合接種 5 瓶，每瓶接 5 片葉片切割的葉塊，各處理重復3次.

1.3.2 原球莖增殖與分化 以原球莖為材料，原球莖切割成0.2－0.5 mm3的小塊培養(yǎng)于不同培養(yǎng)基(表1)中.培養(yǎng)25 d后觀察原球莖生長狀態(tài)并統(tǒng)計原球莖增殖倍數和分化率.各組合6瓶，每瓶接入35－40個原球莖，各處理重復3次.

表1 石斛蘭原球莖增殖與分化1)Table 1 Propogation and differentiation of PLBs in Dendrobium spp.

針對KC+2 mg·L－16-BA+0.5 mg·L－1NAA培養(yǎng)基中添加不同天然附加物(液體椰子汁、椰乳勻漿物、香蕉勻漿物、蘋果勻漿物、馬鈴薯勻漿物、活性炭，其中除附加物活性炭的濃度為1.0 g·L－1外，其余濃度均為100.0 g·L－1)進行試驗.各組合6瓶，每瓶接入35－40個原球莖，各處理重復3次.

1.3.3 壯苗和生根 以苗高為0.5 cm的石斛蘭無根小苗為材料，以1/2MS(大量元素減半，其余各元素不變，以下均同)為基本培養(yǎng)基，添加NAA、6-BA和添加物，按L9(34)(其中NAA為因素1，3水平分別為1.0、1.5、2.0 mg·L－1;6-BA 為因素 2，3 水平分別為 0.0、0.2、0.4 mg·L－1，天然附加物為因素 3，3 水平分別為無添加物、100.00 g·L－1香蕉勻漿物、1.0 g·L－1活性炭)進行正交設計試驗確定適宜的壯苗生根培養(yǎng)基.每瓶接4株，各組合8瓶，各處理重復3次.培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計苗高和根數量及長度，并觀察苗的生長狀況.

1.3.4 移栽基質的篩選 選取苗高約2.0 cm且長勢一致的小苗為材料，以水草、松樹皮(移栽前將其碾成小塊后，用水充分浸泡，并每隔1 d換1次水)、棕樹皮(移栽前一段時間用水充分浸泡)、稻谷殼為移栽基質.移栽前將試管苗在自然條件下煉苗30 d后，洗去根部的培養(yǎng)基，用500 mg·L－1的多菌靈浸泡小苗5 min后，種植于不同移栽基質中，置于大棚中培養(yǎng)，每種處理30株小苗，30 d后統(tǒng)計其成活率.

1.4 培養(yǎng)條件與數據分析

培養(yǎng)基中添加 20 g·L－1白糖、6 g·L－1瓊脂，pH 為 5.4，光照強度 1500 lx，光照時間 12 h·d－1，培養(yǎng)溫度25±1℃.

誘導率=誘導出原球莖的葉片塊數/總塊數×100%;增殖倍數=(轉接瓶數－原有瓶數)/原有瓶數;分化率(%)=分化成苗的原球莖總數/總原球莖數量×100%.用DPS軟件分析數據，小寫字母(a，b)表示差異顯著性檢測水平為0.05;大寫字母(A，B)表示差異顯著性檢測水平為0.01.

2 結果與分析

2.1 不同激素組合對原球莖誘導的影響

葉片切割成小塊后培養(yǎng)于培養(yǎng)基Ⅲ(KC+4.0 mg·L－16-BA+1.0 mg·L－1NAA)中誘導原球莖的效果好，其誘導率為11.99%，與其他組合呈極顯著性差異(圖1);原球莖主要是由葉片基部或葉尖部位誘導而來(圖2－A).6-BA濃度為4.0 mg·L－1時易誘導原球莖，其濃度過高或過低時均不利于原球莖誘導;6.0 mg·L－16-BA培養(yǎng)時，葉片容易褐化死亡.

圖1 葉片對原球莖的誘導率Fig.1 Rate of induced protocorm from leaves

2.2 不同培養(yǎng)基種類對原球莖增殖和分化的影響

不同培養(yǎng)基種類對原球莖增殖和分化具有不同的影響，從表1中可以看出:石斛蘭原球莖在KC+2.0 mg·L－16-BA+0.5 mg·L－1NAA培養(yǎng)基中增殖倍數較高，原球莖能不斷地自身繁殖，分化率低(圖2－B).而 1/2MS+0.5 mg·L－16-BA 培養(yǎng)基中原球莖增殖倍數是 KC+2.0 mg·L－16-BA+0.5 mg·L－1NAA 培養(yǎng)基中的0.53倍，原球莖顆粒分化快(圖2－C).1/2MS基本培養(yǎng)基培養(yǎng)的原球莖易分化，生長較快;KC基本培養(yǎng)基培養(yǎng)的原球莖分化慢，繁殖能力較好.因此，原球莖增殖的最佳培養(yǎng)基為KC+2.0 mg·L－16-BA+0.5 mg·L－1NAA，而分化培養(yǎng)基為 1/2MS+0.5 mg·L－16-BA.

圖2 石斛蘭的植株再生Fig.2 The regeneration of plantlets in Dendrobium spp.

2.3 不同添加物對原球莖增殖的影響

無附加物培養(yǎng)基中原球莖繁殖能力與其它附加物的呈顯著性差異(表2).不同添加物對原球莖增殖的影響不同，椰子汁和椰乳對原球莖的生長表現出明顯地不同，椰子汁培養(yǎng)基中原球莖增殖倍數是椰乳勻漿物的1.55倍，椰乳勻漿物培養(yǎng)基中原球莖易分化成苗;香蕉勻漿物培養(yǎng)基中原球莖生長緩慢，培養(yǎng)20 d開始出現黃色菌;蘋果勻漿物培養(yǎng)基中原球莖表現出2種狀態(tài):1種為淺黃色，原球莖較大，表面有粉末狀的物質形成，該物質無生長能力;2種為墨綠色，原球莖容易分化.馬鈴薯勻漿物培養(yǎng)基中原球莖易分化，且易生長菌類物質.活性炭培養(yǎng)基中原球莖生長緩慢，分化程度低.因此，采用無附加物的KC+2.0 mg·L－16-BA+0.5 mg·L－1NAA培養(yǎng)基適宜于原球莖的繁殖.

表2 天然附加物對石斛蘭增殖和生長的影響1)Table 2 Effects of natural additives on propogation and growth of PLBs in Dendrobium spp.

2.4 不同培養(yǎng)基種類對石斛蘭壯苗生根的影響

根據表3可知，小苗在1/2MS+1.0 mg·L－1NAA培養(yǎng)基上苗高和根長與其他組合達到極顯著性差異.經正交方差分析表明:各因素影響生根的效果依次為天然附加物＞NAA＞6-BA;影響壯苗培養(yǎng)的效果依次為 6-BA＞NAA＞天然附加物.NAA 濃度為 1.0 mg·L－1時對生根培養(yǎng)的效果最好，優(yōu)于 1.5 mg·L－1和 2.0 mg·L－1.6-BA不同濃度水平對壯苗及生根均無顯著性差異.

表3 培養(yǎng)基對石斛蘭壯苗生根的影響1)Table 3 Effects of different media on the growth of roots in Dendrobium spp.

無根的小苗在1/2MS+1.0 mg·L－1NAA培養(yǎng)基中不僅高、粗壯，而且根系發(fā)達(表4，圖2－D)，植物長勢很好(圖2－E).不同附加物對石斛苗生根的效果影響效果依次為無附加物＞香蕉＞活性炭，香蕉勻漿物培養(yǎng)基中苗長勢好，根較粗壯，但根系不發(fā)達，培養(yǎng)20 d后易出現黃色菌，苗生長緩慢，甚至逐漸枯萎死亡.活性炭培養(yǎng)基中苗長勢一般，根生長勢差，部分為乳白色，生活力較差，甚至有10%苗在培養(yǎng)90 d后仍然沒有著生根.

表4 培養(yǎng)基對石斛蘭小苗生長的影響1)Table 4 Effects of different media on the growth of plantlets in Dendrobium spp.

2.5 移栽基質對石斛蘭移栽成活的影響

石斛蘭經過煉苗移栽于各種基質的成活率和生長勢圖3中分析:在大棚內移栽石斛蘭試管苗時，最好的移栽基質為棕樹皮，成活率達到93.33%，苗長勢好，生長快(圖2－F).稻谷殼移栽基質中苗成活率低，長勢差，移栽后13 d苗開始出現較為嚴重的腐爛現象.松樹皮移栽基質中苗生長較為緩慢，而水草移栽基質中苗的生長較快.

3 討論

圖3 移栽基質對石斛蘭移栽成活率的影響Fig.3 Effects of different transferring media on the survival rate of Dendrobium spp.

葉片作為外植體是比較理想的材料來源，取材不受季節(jié)限制而且數量多.本研究以石斛蘭葉片為材料誘導原球莖，其誘導率為11.99%.這可能是由于成熟幼葉對誘導反應極弱，這與王懷宇[20]的報道一致.如何有效地提高葉片外植體的原球莖誘導率有待于進一步研究.

基本培養(yǎng)基的選擇是高效石斛蘭離體培養(yǎng)的基礎.研究中發(fā)現KC基本培養(yǎng)基適宜于石斛蘭葉片原球莖誘導及其繁殖，而1/2MS基本培養(yǎng)基適宜于原球莖分化和壯苗生根培養(yǎng).這可能是由于1/2MS、KC基本培養(yǎng)基中均含有和，植物生長時所需要的N源由供給，活性幾乎完全受到抑制[21]，1/2MS基本培養(yǎng)基中含量比KC基本培養(yǎng)基高，高濃度的能抑制細胞生長[22].

植物生長調節(jié)劑對石斛蘭原球莖誘導和繁殖、苗分化和生長均有影響.6-BA低濃度有利于原球莖分化，高濃度對成苗起著抑制的作用.這與馮瑩[3]、王國梅等[16]的研究報道一致.NAA有利于提高原球莖誘導率和苗生根.本研究中發(fā)現單獨使用NAA對生根效果優(yōu)于6-BA和NAA配合使用.這可能是由于6-BA、NAA分別屬于細胞分裂素和生長素類，體現2類激素對植物生長的生理作用.適宜濃度的激素促進細胞分裂，促進細胞對營養(yǎng)物質(無機鹽、糖、水等)的吸收，或激素被吸收后，作為信使，與激素受體結合，調節(jié)相關基因表達[23]，進而引起一系列生理生化反應，啟動基部細胞的生長，促使細胞不斷分生.

天然附加物對石斛蘭原球莖和苗的生長具有一定影響.天然附加物不利于原球莖和苗生長，這可能是由于天然附加物中含有糖，提高培養(yǎng)基的滲透壓，影響其對生長物質的吸收.香蕉、馬鈴薯、蘋果勻漿物不利于原球莖生長，與蔣林等[17]的報道一致.這可能由于勻漿物含有大量糖類物質或抑制原球莖生長的有機物質.這與李璐等[15]的報道不一致，可能是由于香蕉勻漿物使用的方式及其濃度不同.李小軍等[24]指出香蕉上清夜有利原球莖生長，而沉淀物抑制其生長.活性炭不利于原球莖生長，與Nihar et al[25]的報道一致.這可能是由于活性炭具有吸附作用，吸附有害物質的同時也將培養(yǎng)基中能夠促進石斛蘭小苗生長的有用成分吸附，造成原球莖和苗生長緩慢.

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