發(fā)酵時(shí)間和料水比對(duì)豆粕發(fā)酵的影響

詹湉湉，柯芙容，陳慶達(dá)，張少華，許麗惠，王全溪，王長(zhǎng)康

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州350002;2.晉江市綠色保健蛋品有限公司，福建 晉江362200)

隨著畜禽養(yǎng)殖規(guī)模的快速發(fā)展，對(duì)豆粕的需求越來越大.但豆粕中含有胰蛋白酶抑制劑、植物血球凝集素、脲酶、大豆抗原蛋白、低聚糖和植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子，大大降低了豆粕的利用率[1].如何提高豆粕的利用率是急需解決的重大問題.去除豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子的方法主要有物理、化學(xué)和生物學(xué)方法.物理法主要采用高溫膨化，效果好，但能源消耗大、成本高;化學(xué)法主要采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑處理豆粕，雖有一定效果，但易使化學(xué)物質(zhì)殘留，污染環(huán)境，且工藝較復(fù)雜，而且營(yíng)養(yǎng)成分易被破壞，導(dǎo)致豆粕營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低;生物學(xué)方法主要采用生物育種和生物學(xué)技術(shù)對(duì)豆粕進(jìn)行處理，目前在國(guó)內(nèi)外研究較多[2－3].

采用微生物發(fā)酵豆粕，已被證明是一種有效降低和去除抗?fàn)I養(yǎng)因子的方法[4－5].發(fā)酵豆粕是利用現(xiàn)代生物工程技術(shù)生產(chǎn)的低抗?fàn)I養(yǎng)因子[6]的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料，將大分子蛋白質(zhì)酶解成多肽、小肽及游離氨基酸[7]，同時(shí)含有大量的益生菌、乳酸菌及未知生長(zhǎng)因子等物質(zhì)[8].影響豆粕發(fā)酵的因素很多，而國(guó)內(nèi)外關(guān)于豆粕發(fā)酵適宜菌種的選擇及發(fā)酵工藝參數(shù)的研究才剛起步[9－10]，且目前研究報(bào)道多為單一菌種或混合菌種對(duì)發(fā)酵豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子的影響，在發(fā)酵豆粕營(yíng)養(yǎng)特性上的研究不多.為了進(jìn)一步研究混合菌種發(fā)酵對(duì)豆粕品質(zhì)的影響，本試驗(yàn)采用凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌混合菌種發(fā)酵豆粕，研究發(fā)酵時(shí)間和料水比對(duì)發(fā)酵豆粕營(yíng)養(yǎng)成分的影響，確定豆粕適宜的發(fā)酵參數(shù)，旨在為微生物發(fā)酵豆粕的研究與應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)酵劑由福建廈門洛東生物環(huán)?？萍加邢薰咎峁心Y(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌，總活菌數(shù)為1×109cfu·g－1.其中，凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)為2×108cfu·g－1，枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為5×108cfu·g－1，酵母菌活菌數(shù)為3 ×108cfu·g－1.

豆粕購(gòu)于廈門中禾實(shí)業(yè)有限公司，粗蛋白質(zhì)含量為43.13%，水分含量為12.17%.

發(fā)酵豆粕基礎(chǔ)配方組成:100 kg豆粕+1 kg玉米+水+20 g菌種.

1.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化

試驗(yàn)采用單因素處理，由發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化和發(fā)酵水分優(yōu)化兩部分組成，兩個(gè)發(fā)酵過程均需要密封，發(fā)酵袋保持一定的高度，室溫為35℃左右.

1.2.1 發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化 試驗(yàn)設(shè)兩個(gè)水平，每個(gè)水平3個(gè)重復(fù)，在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基上，室溫厭氧分別發(fā)酵48和72 h.

1.2.2 發(fā)酵水分優(yōu)化 試驗(yàn)設(shè)3個(gè)水平，每個(gè)水平3個(gè)重復(fù)，在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基上，加水量分別為40、55和 70 kg，即料水比分別為 1∶0.40、1∶0.55 和 1∶0.70，室溫下厭氧發(fā)酵 72 h.發(fā)酵 72 h 后，測(cè)得發(fā)酵豆粕中的含水量分別為 37.85% 、44.27% 和 49.19%.

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定 水分和粗蛋白質(zhì)含量按常規(guī)方法[11]測(cè)定;游離氨基酸含量采用甲醛滴定法[12]測(cè)定;酸溶性蛋白質(zhì)含量采用三氯乙酸(TCA)法[13]測(cè)定;單寧酸溶性蛋白質(zhì)含量采用單寧沉淀法[12]測(cè)定.

多肽和寡肽含量通過計(jì)算得出.多肽含量=酸溶性蛋白質(zhì)含量－游離氨基酸含量;寡肽含量=單寧酸溶性蛋白質(zhì)含量－游離氨基酸含量.

1.3.2 pH測(cè)定 pH采用玻璃電極pHS-3C型pH計(jì)測(cè)定.

pH測(cè)定的具體步驟:準(zhǔn)確稱取1 g樣品和9 g蒸餾水(采用移液槍準(zhǔn)確移取9 mL蒸餾水)，振蕩、搖勻后用pH計(jì)測(cè)定.

1.3.3 活菌含量的測(cè)定 活菌總數(shù)采用稀釋平板計(jì)數(shù)法[14]測(cè)定.

1.4 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2003軟件處理后，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析.其中，發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化的數(shù)據(jù)采用成組樣本T檢驗(yàn)，發(fā)酵水分優(yōu)化的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析.差異顯著后進(jìn)行LSD多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵豆粕品質(zhì)的影響

2.1.1 對(duì)常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的影響 從發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵豆粕常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的影響(表1)可以看出，發(fā)酵72 h組與發(fā)酵48 h組相比，其游離氨基酸+寡肽和(游離氨基酸+寡肽)/粗蛋白質(zhì)極顯著提高(P＜0.01)，其他指標(biāo)均有提高，但差異不顯著(P＞0.05).可見，發(fā)酵72 h的效果比發(fā)酵48 h的效果好.

2.1.2 對(duì)pH和活菌數(shù)的影響 從發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵豆粕pH和活菌數(shù)的影響(表2)可以看出，發(fā)酵72 h組與發(fā)酵48 h組相比，其pH極顯著降低(P＜0.01)，而活菌數(shù)未出現(xiàn)明顯變化(P＞0.05).可見，發(fā)酵72 h的效果比發(fā)酵48 h的效果好.

表1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵豆粕常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分(絕干物質(zhì)基礎(chǔ))的影響1)Table 1 Effects of fermentation time on nutritional composition of soybean meal(dry matter basis) %

2.2 料水比對(duì)發(fā)酵豆粕品質(zhì)的影響

2.2.1 對(duì)常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的影響 從料水比對(duì)發(fā)酵豆粕常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的影響(表3)可以看出，與料水比為1∶0.40 組相比，料水比為1∶0.55 組的游離氨基酸、寡肽、游離氨基酸+寡肽和(游離氨基酸+寡肽)/粗蛋白質(zhì)極顯著提高(P＜0.01)，寡肽/粗蛋白質(zhì)顯著提高(P ＜0.05).與料水比為 1∶0.40 和1∶0.55組相比，料水比為 1∶0.70 組的游離氨基酸/粗蛋白質(zhì)、寡肽、寡肽/粗蛋白質(zhì)和(游離氨基酸+寡肽)/粗蛋白質(zhì)極顯著提高(P＜0.01);游離氨基酸顯著高于料水比為 1∶0.40 組(P ＜0.05)，與料水比為 1∶0.55 組的差異不顯著(P ＞0.05);多肽和多肽/粗蛋白質(zhì)極顯著高于料水比為1∶0.40 組(P ＜0.01)，與料水比為 1∶0.55 組的差異不顯著(P ＞0.05);游離氨基酸 +寡肽極顯著高于料水比為1∶0.40 組(P ＜0.01)，顯著高于料水比為1∶0.55 組(P ＜0.05).

表2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵豆粕pH和活菌數(shù)的影響1)Table 2 Effects of fermentation time of soybean meal on pH and viable counts

表3 料水比對(duì)發(fā)酵豆粕常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分(絕干物質(zhì)基礎(chǔ))的影響1)Table 3 Effects of material-water ratio on the nutritional composition of soybean meal(dry matter basis) %

2.2.2 對(duì)pH和活菌數(shù)的影響 從料水比對(duì)發(fā)酵豆粕pH和活菌數(shù)的影響(表4)可以看出:與料水比為 1∶0.40 組相比，料水比為 1∶0.70 和 1∶0.55 組的pH極顯著降低(P＜0.01)，活菌數(shù)顯著提高(P＜0.01);與料水比為 1∶0.55 組相比，料水比為 1∶0.70組的pH極顯著降低(P＜0.01).可見，料水比為1∶0.70的發(fā)酵效果最優(yōu).

表4 料水比對(duì)發(fā)酵豆粕pH和活菌數(shù)的影響1)Table 4 Effects of material-water ratio of soybean meal on pH and viable counts

3 討論

3.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵豆粕品質(zhì)的影響

發(fā)酵終點(diǎn)對(duì)提高產(chǎn)物的生產(chǎn)率有非常重要的意義.在發(fā)酵過程中，產(chǎn)物的濃度是變化的，一般產(chǎn)物高峰生長(zhǎng)階段時(shí)間越長(zhǎng)，生產(chǎn)率就越高，但到一定時(shí)間后生產(chǎn)率提高緩慢，甚至下降.因此無論是獲得菌體還是代謝產(chǎn)物，微生物發(fā)酵都有一個(gè)最佳時(shí)間.時(shí)間過短，不足以獲得所需的產(chǎn)量以及優(yōu)質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)品;時(shí)間過長(zhǎng)，由于環(huán)境已不利于菌體生長(zhǎng)，往往造成菌體自溶，產(chǎn)量下降，同時(shí)增加生產(chǎn)成本.本試驗(yàn)結(jié)果顯示，發(fā)酵72 h組的游離氨基酸+寡肽和(游離氨基酸+寡肽)/粗蛋白質(zhì)極顯著高于發(fā)酵48 h組，pH極顯著低于發(fā)酵48 h組.表明凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌混合菌種發(fā)酵豆粕的最佳時(shí)間為72 h，與李文立等[15]和莫重文等[16]的研究結(jié)果一致.同樣，朱曦等[9]研究表明，發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí)，豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子能有效地被去除;朱平軍等[17]研究也表明，最佳發(fā)酵時(shí)間為72 h，黑曲霉發(fā)酵豆粕中的酸溶蛋白質(zhì)含量由發(fā)酵前的1.75%提高到13.62%.以上研究結(jié)果均表明發(fā)酵72 h的效果好，這可能是因?yàn)殡S著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，豆粕發(fā)酵更加徹底.本試驗(yàn)結(jié)果與邢力等[18]和胡瑞等[19]的“48 h為最適發(fā)酵時(shí)間”研究結(jié)果不同.由于影響豆粕發(fā)酵的因素很多，而且評(píng)定指標(biāo)也不盡相同，因此研究結(jié)果也存在一定的差異，尤其是在菌種選擇、發(fā)酵的工藝參數(shù)以及對(duì)豆粕營(yíng)養(yǎng)價(jià)值影響的研究結(jié)果差異較大.可見，發(fā)酵時(shí)間一定要根據(jù)不同的菌種、工藝條件和產(chǎn)物，通過試驗(yàn)來確定.

3.2 料水比對(duì)發(fā)酵豆粕品質(zhì)的影響

固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的含水量是決定固態(tài)發(fā)酵成功與否的關(guān)鍵因素之一.基質(zhì)含水量高，容易導(dǎo)致基質(zhì)多孔性降低，減少基質(zhì)內(nèi)氣體，但能增加營(yíng)養(yǎng)成分和菌體的流動(dòng)性;而含水量低，造成基質(zhì)膨脹程度低，菌體生長(zhǎng)受抑制，酶產(chǎn)量下降.基質(zhì)含水量不僅影響微生物的生長(zhǎng)，還影響發(fā)酵系統(tǒng)中氧氣的供應(yīng)、氣體交換等活動(dòng)，關(guān)系到發(fā)酵的成敗.本試驗(yàn)綜合各項(xiàng)指標(biāo)可得，采用凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌混合菌種發(fā)酵豆粕的最佳料水比為1∶0.70.這一研究結(jié)果與王德培等[20]的研究結(jié)果類似，與王平[21]和高愛琴等[22]的“最佳發(fā)酵料水比為1∶0.6和3∶2”研究結(jié)果也相近.本試驗(yàn)結(jié)果表明:料水比為1∶0.70組的游離氨基酸和活菌數(shù)顯著高于料水比為1∶0.40組;游離氨基酸/粗蛋白質(zhì)、寡肽、寡肽/粗蛋白質(zhì)和(游離氨基酸+寡肽)/粗蛋白質(zhì)極顯著高于料水比為 1∶0.40 和1∶0.55 組;pH 極顯著低于料水比為 1∶0.40 和 1∶0.55 組;多肽、多肽/粗蛋白質(zhì)和游離氨基酸+寡肽極顯著高于料水比為1∶0.40組，高于料水比為1∶0.55組(差異不顯著).朱曦等[9]研究表明:料水比為1∶(0.8－1.0)時(shí)，豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子能有效被去除;此外，胡瑞等[19]研究表明:發(fā)酵后，料水比為1∶0.6組除揮發(fā)性鹽基氮含量外，其他指標(biāo)均優(yōu)于料水比為1∶0.40組，但揮發(fā)性鹽基氮含量偏高，因此選擇1∶0.40為最適發(fā)酵料水比.陳炳鈿等[23]研究表明，最佳發(fā)酵工藝條件為:地衣芽孢桿菌、釀酒酵母和嗜酸乳桿菌的配比為(2∶1∶1)×109，接種量為10%，含水量為45%，采用好氧48 h、厭氧24 h的固態(tài)發(fā)酵工藝.以上研究結(jié)果存在差異的原因可能與菌種、發(fā)酵工藝以及測(cè)定指標(biāo)等不同所致.因此，適合的料水比一定要根據(jù)不同菌種和發(fā)酵條件等，通過試驗(yàn)來確定.

3.3 微生物發(fā)酵可以顯著提高豆粕的品質(zhì)

3.3.1 微生物發(fā)酵對(duì)豆粕常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的影響 本試驗(yàn)中，豆粕經(jīng)微生物發(fā)酵后，豆粕中粗蛋白質(zhì)的總量無顯著變化，但蛋白質(zhì)組成發(fā)生了改變，大、中分子蛋白質(zhì)水平降低了，小肽和游離氨基酸的水平提高了，改善了豆粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，這一結(jié)果與陳中平等[24]的研究結(jié)果一致，而且發(fā)酵豆粕的pH和活菌數(shù)也有顯著性變化.豆粕在發(fā)酵過程中，原料豆粕中的真蛋白質(zhì)在枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和酵母菌分泌的眾多酶系作用下，由大分子蛋白質(zhì)分解為小分子蛋白質(zhì)，有序地降解為多肽以及大量具有特殊生理活性的小肽和游離氨基酸等，這就使得發(fā)酵豆粕中的小肽和游離氨基酸含量增加.

研究表明，微生物發(fā)酵可以把蛋白質(zhì)水解為氨基酸、多肽和小肽等小分子物質(zhì)，提高蛋白質(zhì)的利用率[25].Hong et al[5]研究表明，豆粕發(fā)酵后，豆粕中的大分子蛋白質(zhì)降解為小分子肽;馬文強(qiáng)等[3]研究表明，發(fā)酵后豆粕中的大分子蛋白質(zhì)含量較發(fā)酵前降低了75.57%，中分子蛋白質(zhì)含量較發(fā)酵前降低了86.7%，小分子蛋白質(zhì)含量較發(fā)酵前提高了2.25倍.雖然前人的研究存在差異，但發(fā)酵均不同程度地改善了豆粕品質(zhì).本試驗(yàn)結(jié)果表明，豆粕在發(fā)酵過程中，枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和酵母菌分泌的眾多酶系也有效地將豆粕中的大分子蛋白質(zhì)降解為小分子蛋白質(zhì).

3.3.2 微生物發(fā)酵對(duì)pH和活菌數(shù)的影響 豆粕經(jīng)發(fā)酵后，具有濃郁的酸香味，提高豆粕的適口性.許多研究表明，pH為4.5－5.5，會(huì)明顯提高飼料的誘食性.

豆粕發(fā)酵后除會(huì)提高常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分外，還含有有益微生物及其代謝產(chǎn)物.由于在豆粕發(fā)酵過程中加入了有益微生物，因此發(fā)酵后的物料中含有大量有益微生物種群，其種類主要取決于發(fā)酵前物料中所添加的微生物，常見的有芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌，這些益生性微生物對(duì)于環(huán)境和畜禽的健康均具有非常重要的作用.陳文靜[26]對(duì)發(fā)酵后的豆粕進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)乳酸菌數(shù)達(dá)到107cfu·g－1;康立新[27]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中微生物代謝產(chǎn)生的有效活菌數(shù)達(dá)到4.20×108cfu·g－1.本試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵后的豆粕進(jìn)行測(cè)定，其活菌含量也有極顯著提高，活菌數(shù)達(dá)到2.54×109cfu·g－1.

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示:發(fā)酵72 h組的游離氨基酸+寡肽和(游離氨基酸+寡肽)/粗蛋白質(zhì)極顯著高于發(fā)酵48 h組，pH極顯著低于發(fā)酵48 h組;料水比為1∶0.70組的游離氨基酸和活菌數(shù)顯著高于料水比為1∶0.40組，游離氨基酸/粗蛋白質(zhì)、寡肽、寡肽/粗蛋白質(zhì)和(游離氨基酸+寡肽)/粗蛋白質(zhì)極顯著高于料水比為1∶0.40 和 1∶0.55 組，pH 極顯著低于料水比為1∶0.40 和1∶0.55 組，多肽、多肽/粗蛋白質(zhì)和游離氨基酸+寡肽極顯著高于料水比為1∶0.40組.本試驗(yàn)得出的凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌混合菌種發(fā)酵豆粕的最佳工藝條件為:凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌的配比為(2∶5∶3)×108，料水比為1∶0.70(即含水量為 49.19%)，接種量為 0.02%，厭氧發(fā)酵 72 h.

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