紅、黑米皮對(duì)高脂血癥模型大鼠臟器組織的保護(hù)作用

徐惠龍，楊志堅(jiān)，程租鋅，鄭金貴

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122;2.福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)研究所，福建福州350002)

米皮是指稻(Oryza sativa L.)的穎果經(jīng)加工而脫下的果皮，其含有蛋白質(zhì)、多糖、脂肪酸、維生素、肌醇、植酸和礦物質(zhì)等功能性成分[1].紅米和黑米是由于花色素在米皮大量積累而顯示出特定顏色[2]，它們不但營(yíng)養(yǎng)豐富，而且有良好的藥用功能，自古素有“藥米”之稱，是民間滋補(bǔ)佳品.紅、黑米皮作為功能性食品已引起許多學(xué)者的關(guān)注，具有多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)等特點(diǎn)，且長(zhǎng)期服用無(wú)毒副作用，在預(yù)防和治療代謝性疾病具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，并應(yīng)用于抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤等疾病[3－5].陳起萱等[6]研究顯示，紅米和黑米可減輕高脂引起的兔動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，其作用機(jī)制可能是通過(guò)改善血脂水平和提高抗氧化能力，從而減少動(dòng)脈壁細(xì)胞及其他成分的氧化損傷.但以上研究主要集中在血液、主動(dòng)脈少數(shù)組織上，缺乏同時(shí)觀察多個(gè)組織器官的藥理效應(yīng)，且各組織器官之間的相互聯(lián)系也被忽視.前期的研究證實(shí)，紅、黑米皮不僅可以降低高脂血癥(hyperlipidemia，HLP)模型大鼠的體重和器官指數(shù)，還可以改善其血脂水平[7].本試驗(yàn)基于前期藥理效應(yīng)的基礎(chǔ)上，以肝臟、主動(dòng)脈和心臟組織的病變程度為切入點(diǎn)，進(jìn)一步研究紅、黑米皮對(duì)HLP的改善作用及其可能機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 紅、黑米皮的制備 福紅819(紅米)和福紫681(黑米)由福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)研究所選育，其稻谷產(chǎn)量高、功能成分含量高.米皮為新鮮的糙米經(jīng)精米機(jī)碾25 s所制成的材料，粉碎過(guò)篩(100目)后，用蒸餾水配制成懸浮液，置4℃保存?zhèn)溆?

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠40只，體重180－200 g，清潔級(jí)，購(gòu)自上海斯萊克試驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào):SCXK(滬2007-0005).

1.1.3 試劑 主要試劑有天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為20120401、20120603)，谷光甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)、游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為 20120711、20120719、20120718、20120723)，多聚甲醛，蘇木精，伊紅，無(wú)水乙醇，二甲苯.

1.1.4 儀器 主要儀器有UV-1700紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)、BT224半自動(dòng)生化分析儀(意大利Biotecnica公司)、LeicaTP1020型脫水機(jī)、LeicaEG1150c型包埋機(jī)、LeicaRM2165型石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司)、普通光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司).

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組與試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)前大鼠飼喂普通飼料，適應(yīng)7 d后隨機(jī)取10只作為正常對(duì)照組;其余30只用高脂飼料(含87.3%基礎(chǔ)飼料、2%膽固醇、10%豬油、0.5%膽酸鈉和0.2%丙基硫氧嘧啶)飼喂28 d，建立HLP模型(經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉，眼眶靜脈取血0.5 mL，分離血清檢測(cè)血脂水平)，隨機(jī)分成模型組、紅米皮組和黑米皮組，每組10只.從29 d起，正常組和模型組每千克大鼠灌胃20 mL蒸餾水，紅米皮組每千克大鼠灌胃20 mL 0.09 g·mL－1紅米混懸液，黑米皮組每千克大鼠灌胃20 mL 0.09 g·mL－1黑米混懸液.每天上午于8:00－9:00時(shí)灌胃1次，并記錄進(jìn)食量，共56 d.試驗(yàn)過(guò)程中，正常組飼喂普通飼料，其余各組飼喂高脂飼料，自由飲食飲水，每周稱量一次體重.試驗(yàn)結(jié)束前，禁食(不禁水)16 h，取血處死，取肝臟、腹主動(dòng)脈和心臟.

1.2.2 指標(biāo)檢測(cè) 采血后，離心制備血清，ALT、AST、GSH-Px、SOD和CAT的活性及FFA的濃度均按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定.取0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm塊狀的肝臟、腹主動(dòng)脈和心臟分別置于10%多聚甲醛溶液中固定72 h，依次用75%、95%和100%乙醇梯度脫水，石蠟包埋切片，再用95%和85%乙醇梯度脫蠟水化，蘇木精—伊紅(H-E)染色后，于光學(xué)顯微鏡下觀察3種組織器官的病理改變.

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用x±s表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠進(jìn)食量的變化

各組大鼠在試驗(yàn)期間日平均攝食量均沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差異(P＞0.05).這說(shuō)明試驗(yàn)中所用劑量的米皮對(duì)大鼠的一般生理狀況并未產(chǎn)生不良的影響.

2.2 大鼠血清生化指標(biāo)的變化

由表1可知:食用高脂飼料后，大鼠血清ALT和AST的活性及FFA的濃度顯著升高(P＜0.05)，而CAT、GSH-Px和SOD的活性顯著降低;與模型組相比，紅、黑米皮組ALT、AST的活性及FFA的濃度顯著降低(P＜0.05)，CAT、GSH-Px和 SOD的活性均不同程度升高，其中，ALT活性分別下降了14.73%和64.50%，AST活性分別下降了16.59%和41.79%，F(xiàn)FA 濃度分別降低了41.54%和31.54%，CAT活性分別升高了45.09%和101.16%，GSH-Px活性分別升高了13.02%和36.26%，SOD活性分別升高了10.28%和28.60%.

2.3 大鼠肝臟病理學(xué)的變化

從圖1可見:正常組大鼠的肝細(xì)胞排列非常整齊，可見圓而大的細(xì)胞核，胞漿著色較為均勻，未見脂肪變性及細(xì)胞壞死(圖1A)，說(shuō)明普通飼料對(duì)大鼠的脂質(zhì)代謝沒有產(chǎn)生不良影響;模型組的肝細(xì)胞排列非常松散，肝細(xì)胞腫大且排列混亂，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間隙可見許多大小不一的空泡，中央靜脈周圍病變最為明顯，甚至可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和輕度的肝細(xì)胞壞死現(xiàn)象(圖1B)，說(shuō)明大量的脂質(zhì)在肝臟沉積，并呈彌漫性重度脂肪變性而導(dǎo)致輕微的脂肪肝，已成功建立HLP大鼠模型;紅米皮組的肝細(xì)胞排列較為整齊，未見有壞死的細(xì)胞，肝細(xì)胞較正常仍有腫大的現(xiàn)象，肝細(xì)胞間隙可見脂肪滴而形成的空泡，但脂變肝細(xì)胞數(shù)目較模型組明顯減少(圖1C);黑米皮組的肝細(xì)胞排列較整齊，且結(jié)構(gòu)完整，接近于正常，基本上沒有脂肪滴空泡，肝細(xì)胞基本恢復(fù)正常(圖1D).這表明黑米皮在改善肝臟病變程度優(yōu)于紅米皮.

表1 大鼠血清生化指標(biāo)的變化1)Table 1 The bichemical indices in serum among different groups rats

圖1 大鼠肝臟病理組織學(xué)觀察(10×20)Fig.1 Histopathology of liver tissues from rats in four groups(10 ×20)

2.4 大鼠主動(dòng)脈橫截面病理學(xué)的變化

從圖2可見:正常組大鼠的主動(dòng)脈形態(tài)正常，高倍鏡下可見血管內(nèi)膜表面光滑完整，無(wú)明顯增厚，中膜邊緣清晰，管腔內(nèi)無(wú)贅生物(圖2A);而模型組主動(dòng)脈的內(nèi)膜明顯增厚，管腔內(nèi)可見許多形狀無(wú)規(guī)則、大小不一樣的脂肪滴泡沫等贅生物，但血管壁上還未見動(dòng)脈粥樣硬化斑塊(圖2B);紅米皮組的血管內(nèi)膜表面光滑完整，稍微增厚，介于正常組和模型組之間，但未見泡沫細(xì)胞(圖2C);黑米皮組的血管內(nèi)膜表面光滑完整，無(wú)明顯增厚，管腔內(nèi)無(wú)泡沫細(xì)胞，接近于正常組(圖2D).這表明黑米皮在改善主動(dòng)脈病變程度優(yōu)于紅米皮.

2.5 大鼠心臟病理學(xué)的變化

從圖3可見，各組大鼠心臟未見脂肪組織浸潤(rùn)而形成的空泡，這可能是由于HLP模型大鼠造模時(shí)間還不夠，還未形成心肌脂肪性病變.

圖2 大鼠主動(dòng)脈橫截面病理組織學(xué)觀察(10×20)Fig.2 Histopathology of heart aorta from rats in four groups(10 ×20)

圖3 大鼠心臟病理組織學(xué)觀察(10×10)Fig3.Histopathology of heart from rats in four groups(10×10)

3 討論

HLP易引起“血稠”，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和病灶脫落，脂質(zhì)沉積于血管壁而形成斑塊，逐漸形成動(dòng)脈粥樣硬化而堵塞血管，從而影響血液循環(huán)，嚴(yán)重時(shí)就會(huì)發(fā)生冠心病、非酒精性脂肪肝和心肌梗死等疾病[8].HLP及其并發(fā)癥可影響機(jī)體多個(gè)臟器組織，其中涉及最直接的組織有血液、肝臟、主動(dòng)脈和心臟.紅、黑米皮含有酚酸、花色苷和γ-谷維素等抗氧化活性成分[9]，它們可以清除體內(nèi)多余的氧自由基而保護(hù)機(jī)體免受損傷，在防治HLP等心血管疾病上具有獨(dú)特的療效作用，這是本試驗(yàn)選擇米皮作為試驗(yàn)原材料的重要依據(jù).

紅米和黑米可以降低主動(dòng)脈脂質(zhì)斑塊面積[6，10]和改善腎臟脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[11]，而這種對(duì)器官的保護(hù)作用與其提高機(jī)體抗氧化能力[8]和免疫調(diào)節(jié)作用[12]密切相關(guān).本試驗(yàn)中，紅、黑米皮可以提高HLP模型大鼠CAT、SOD和GSH-Px等抗氧化酶活性，減輕肝臟、主動(dòng)脈的脂肪性病變程度，對(duì)于長(zhǎng)期高脂飲食的大鼠臟器具有一定的保護(hù)作用，這與前人[11，13]的研究結(jié)果相類似.針對(duì)改善病變效果來(lái)看，黑米皮對(duì)于HLP模型大鼠臟器的防治作用優(yōu)于紅米皮，這可能是由于黑米的花色苷、黃酮類物質(zhì)和胡蘿卜素高于紅米[14－15]而導(dǎo)致的.

肝臟是脂質(zhì)和脂肪酸代謝的中心，其功能的好壞影響血液中的脂質(zhì)水平[16].脂肪肝與HLP關(guān)系密切、互為因果，HLP患者脂質(zhì)代謝嚴(yán)重失調(diào)，肝臟逐漸沉積脂類物質(zhì)而變成為一個(gè)儲(chǔ)油罐，當(dāng)血液經(jīng)肝臟凈化時(shí)，血液將帶走一部分的脂類物質(zhì)而導(dǎo)致黏稠度增加，從而誘發(fā)脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病和心肌梗塞等疾病的發(fā)生.本試驗(yàn)中，紅、黑米皮能夠抑制HLP引起血清中AST、ALT活性及FFA濃度的上升，這可能是由于米皮中的活性成分在腸道調(diào)節(jié)脂類物質(zhì)在體內(nèi)的消化吸收或在肝臟內(nèi)結(jié)合了大量膽汁酸而排出體外，促使肝臟內(nèi)的脂質(zhì)源源不斷地向膽汁酸代謝途徑分解而轉(zhuǎn)移，阻斷了膽汁酸的腸肝循環(huán)，有效降低血液中的FFA濃度，這與前期的研究結(jié)果[7]相一致.

大量試驗(yàn)研究及流行病學(xué)調(diào)查表明，HLP是動(dòng)脈粥樣硬化病變形成的決定因素[17].本試驗(yàn)結(jié)果表明，高脂飲食大鼠主動(dòng)脈內(nèi)有大量的脂質(zhì)沉積，說(shuō)明主動(dòng)脈內(nèi)已經(jīng)發(fā)生脂肪性病變，但可能由于誘導(dǎo)時(shí)間還不夠長(zhǎng)，還未形成嚴(yán)重的動(dòng)脈粥樣硬化病癥;紅、黑米皮組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜雖有不同程度的增厚，但還未發(fā)生脂肪病變，這說(shuō)明米皮能清除動(dòng)脈內(nèi)脂質(zhì)沉積，改善血管內(nèi)膜狀況，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展.

綜上所述，紅、黑米皮對(duì)改善HLP模型大鼠臟器的病理具有積極作用，其中，黑米皮作為功能性食品對(duì)于保護(hù)機(jī)體免受氧自由基等損傷有較好的應(yīng)用前景，其作用機(jī)理及劑量依存關(guān)系有待進(jìn)一步的試驗(yàn)證實(shí).

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