精子空泡對ICSI患者胚胎發(fā)育及臨床結(jié)局的影響

孟祥黔，曾泳梅，劉思瑤，黃軍，周建明，鐘影

（四川省成都市錦江區(qū)婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，成都 610016）

不孕不育夫婦中約40%因男方因素所致，其中50%不育男性的精子形態(tài)異常，男性不育可能與精子形態(tài)異常有關(guān)。在形態(tài)異常的精子中，精子頭部異常是精子形態(tài)異常的主要類型，約占70%［1-3］。其中，精子空泡頭異常比例最高，其次是梨形頭和小頭異常，雙頭和大頭異常的發(fā)生率最低。截至目前，研究人員普遍認(rèn)為精子空泡與精子活力和男性生育能力息息相關(guān)，尤其是精子頭部核區(qū)域出現(xiàn)的空泡，認(rèn)為其是男性精子畸形的表現(xiàn)［4］。

自1992年卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）技術(shù)誕生以來，傳統(tǒng)的ICSI往往在200～400倍鏡下挑選所謂的“好精子”注射入卵，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，一種新的技術(shù)誕生了，即活精子細(xì)胞器形態(tài)學(xué)檢查（MSOME）［5］。該技術(shù)是利用高質(zhì)量的Nomarshi光學(xué)系統(tǒng)實時檢查精子動態(tài)，通過數(shù)字化處理圖像，放大倍數(shù)可以超過6 000倍，并經(jīng)電腦顯示器放大系統(tǒng)選擇形態(tài)好的精子。該技術(shù)最大的優(yōu)點就是對活動精子進(jìn)行實時觀察，且對精子無任何損傷性。相比而言，傳統(tǒng)ICSI對挑選的精子進(jìn)行評估時具有一定的局限性，僅僅評估頂體和核［6］。而利用精子放大系統(tǒng)則能更好地觀察精子形態(tài)，可以清晰地觀察到精子頭部的細(xì)微結(jié)構(gòu)。早期對精子細(xì)微結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，精子核區(qū)域常常出現(xiàn)至少1個空泡［7］，只有在高倍鏡下才能發(fā)現(xiàn)精子頂體到核區(qū)域的空泡［8］。關(guān)于精子空泡的起源機制目前仍不明確。有研究認(rèn)為精子空泡是一種正常的自然現(xiàn)象［8］；亦有研究表明精子空泡起源于精子頂體，同時暗示精子頂體的存在［9］；但其他研究人員對圓頭精子進(jìn)行觀察時，在精子頭部同樣也發(fā)現(xiàn)了空泡，從而提示空泡的起源并非頂體。到目前為止，人類對精子頭部空泡是否導(dǎo)致男性不育及其潛在的其他作用尚不明確。

本研究利用精子MSOME 放大系統(tǒng)對ICSI患者的精子放大6 000倍后進(jìn)行觀察，并對含有空泡的精子進(jìn)行拍照，測量空泡直徑及其位置，隨后將不同類別的精子注射入卵并單獨培養(yǎng)，進(jìn)一步了解精子空泡對胚胎發(fā)育、胚胎移植后臨床結(jié)局的影響。研究結(jié)果報告如下。

資料與方法

一、研究對象

選擇2014年1～11月在我院接受輔助生殖治療的患者57例，其中9例為重復(fù)周期。所有患者均由同一位醫(yī)生接診治療，均行常規(guī)長方案促排卵并常規(guī)ICSI助孕治療。

ICSI指征［10］：（1）嚴(yán)重少、弱、畸精子癥；（2）不可逆的梗阻性無精子癥；（3）生精功能障礙（遺傳缺陷疾病所致者除外）；（4）男性免疫性不育；（5）體外受精（IVF）失??；（6）精子頂體異常。

二、研究方法

1.卵母細(xì)胞的采集與處理：所有患者均使用常規(guī)長方案促排卵：黃體中期予以促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH-a，達(dá)必佳，F(xiàn)erring，瑞士）0.05mg肌注，14d后予以重組卵泡刺激素（rFSH，果納芬，Merck Serono，德國）150～300U 對卵巢進(jìn)行刺激，B超監(jiān)測卵泡生長發(fā)育狀況，待卵泡直徑大于18mm后，給予重組人絨毛膜促性腺激素（rHCG，艾澤，Merck Serono，德國）250 mg肌注，36h后在B超介導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵。將獲得的卵母細(xì)胞于透明質(zhì)酸酶（Hyaluronidase，80 U／ml，Sage，美國）中消化去除顆粒細(xì)胞后，置于含Vitrolife序貫培養(yǎng)液（G-IVF，Vitrolife，瑞典）的培養(yǎng)皿中放置37℃、6%CO2的培養(yǎng)箱（Thermo Scientific Forma 3110，美國）培養(yǎng)備用。

2.精子準(zhǔn)備：采用梯度離心法洗滌精液，將洗滌好的精液加入精子緩沖液（Spermrinse，Vitrolife，瑞典）中混勻后置于37℃、6%CO2的培養(yǎng)箱中備用。

3.常規(guī)ICSI：將處理后的精液吸取少許加入注射皿中的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）里，在200～400倍顯微鏡下挑選形態(tài)較好的精子（挑選要求：精子頂體完整、形態(tài)正常；精子頭部外部形態(tài)完好無損；精子頸部形態(tài)正?；蝾i部液滴較?。痪游膊啃螒B(tài)正常且無斷缺；盡量挑選前行精子；如果死精子較多時可選微動精子或尾部彎曲的精子），進(jìn)行制動（精子制動時，制動位點應(yīng)在精子尾部靠近精子頭部的1／3處，注射針下壓后橫向快速向右拉動注射針，待看到精子尾部明顯折痕時，表示制動完成），制動1～2次即可，然后放置PVP標(biāo)記過的位置，之后把準(zhǔn)備好的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入注射皿中的緩沖液滴（G-mops，Vitrolife，瑞典）中，注射時，卵母細(xì)胞的極體調(diào)整為6點或12點方向進(jìn)行注射。

4.精子放大系統(tǒng)的使用：在200～400 倍下挑選精子并確定后，注射前利用精子Nomarshi光學(xué)系統(tǒng)（OCTAX CytoScreenTM，德國）行MSOME 對精子進(jìn)行放大觀察，同時對頭部有空泡的精子進(jìn)行拍照，測量空泡直徑并觀察空泡所在位置。整個實時觀察過程中對精子不造成任何損傷，觀察結(jié)束后按照ICSI的常規(guī)流程進(jìn)行注射，注射時按照精子拍照時的順序一一對應(yīng)地將精子注射入卵母細(xì)胞，隨后按照注射順序進(jìn)行單獨培養(yǎng)，以便觀察精子形態(tài)對胚胎發(fā)育的影響。

5.胚胎培養(yǎng)及質(zhì)量評估：顯微注射后的卵母細(xì)胞均置于序貫培養(yǎng)液（卵裂期胚胎用G-1 液，囊胚 用G-2 液，Vitrolife，瑞 典）中，在37℃、6%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微注射16～20h后觀察受精情況，出現(xiàn)兩原核（2PN）為正常受精。采用本實驗室常規(guī)評分法對胚胎進(jìn)行評分，第3 天（D3）胚胎采用WIH 評分法［11］，囊胚采用Gardner評 分 法［12］。

6.胚胎移植與妊娠結(jié)果判斷：選擇優(yōu)質(zhì)胚胎或囊胚1～2個在B超下進(jìn)行胚胎移植，移植后4周超聲檢查顯示子宮腔內(nèi)可見孕囊及胎心搏動者確定為臨床妊娠。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果以百分率（%）表示，采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、精子放大系統(tǒng)下的精子形態(tài)

在精子放大系統(tǒng)下對精子行MSOME 觀察精子形態(tài)，對頭部有空泡的精子進(jìn)行拍照（圖1、圖2），測量空泡直徑并觀察空泡所在位置。

二、有無空泡與胚胎發(fā)育

觀察空泡精子和無空泡精子注射后胚胎發(fā)育的情況，發(fā)現(xiàn)兩組的胚胎冷凍率、妊娠率有顯著性差異（P＜0.05），其余各實驗室指標(biāo)比較均無顯著性差異（P＞0.05），無空泡組的正常受精率和胚胎著床率略高于空泡組，妊娠者中無空泡精子者比例較高（表1）。

二、空泡位置與胚胎發(fā)育

圖1 空泡位于頂體＋核位置 ×6 000

圖2 空泡位于精子頂體位置 ×6 000

比較精子頭部空泡的位置與胚胎發(fā)育的關(guān)系。由于兩組樣本量的原因，因此實驗室各指標(biāo)均無顯著性差異（P＞0.05）（表2）。

三、空泡直徑與胚胎發(fā)育

本次研究中所觀察到的精子空泡直徑均低于2μm。3組不同空泡直徑的精子注射入卵后實驗室各指標(biāo)比較均無顯著性差異（P＞0.05）（表3）。

表1 空泡精子和無空泡精子注射后各實驗室指標(biāo)比較［n（%）］

表2 不同空泡位置對胚胎發(fā)育的影響［n（%）］

表3 不同空泡直徑對胚胎發(fā)育的影響［n（%）］

討 論

關(guān)于精子空泡的起源到目前為止仍不明確，因此精子空泡引起了眾多研究者的興趣［13］。精子空泡是否僅出現(xiàn)在不育男性精子中，或者畸形精子癥患者中，或者如少數(shù)研究者認(rèn)為的那樣，精子空泡是一種自然現(xiàn)象？為了解決上述的疑問，Watanabe等［14］于2011年對不同男性精液進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，具有生育能力的男性精液中，95.80%的精子頭部含有空泡。其他研究者對不育男性精液的研究發(fā)現(xiàn)，在其他指標(biāo)正常的情況下，精子空泡分別占97.70%［8］和98.40%［15］；不育男性精液指標(biāo)不正常的 情 況 下，空 泡 精 子 分 別 占98.80%［8］和99.40%［14］。最近，研究者對不育2年以上、接受輔助生殖治療的患者51例和有生育能力者50例的精液進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，精子空泡數(shù)量、位置均無顯著性差異［16］。在普遍認(rèn)為男性精子中有空泡出現(xiàn)的基礎(chǔ)上，人們開始關(guān)注精子空泡大小，圍繞“大空泡”（指空泡體積占精子頭部＞4%）展開了一系列研究，并獲得不同結(jié)果。較早對ICSI患者的研究表明，“大空泡”在精子中的比例為30% ～40%［11］。Monqaut等［17］研 究 表 明，“大 空 泡”占 不育男性精子比例的61.8%。另外有研究者將“大空泡”定義為空泡占頭部體積的50%，在此基礎(chǔ)上研究大空泡所占比例，結(jié)果分別為（25.2±19.2）%［18］或（30.1±17.8）%［19］。上述研究中，精子空泡大小僅僅是依靠操作者的主觀評估。與此同時，研究者對精子空泡進(jìn)行精確測量得知，有生育能力男性精液中，“大空泡”（指空泡體積占精子頭部＞13%）精子占（9.2±7.2）%，少弱畸精子癥患者中，該類精子占（38±5.1）%［20］。

隨著MSOME 技術(shù)與ICSI技術(shù)的相互結(jié)合，胞漿內(nèi)選擇性單精子注射（IMSI）技術(shù)就此誕生并逐步取得進(jìn)展。該技術(shù)對精子進(jìn)行實時觀察并放大6 000倍，放大后能觀察到傳統(tǒng)ICSI時400倍鏡下所挑選精子時無法觀察到的細(xì)微結(jié)構(gòu)，如精子空泡。同時，精子空泡相關(guān)研究也表明，精子空泡與受精低下［21］、低 的 線 粒 體 膜 電 位［22］、高 的 染 色 體 異 常［22］、精子DNA 損傷［23］有關(guān)。然而，精子空泡與胚胎發(fā)育之間的關(guān)系仍不明確。本中心借助精子放大系統(tǒng)對精子拍照并運用軟件測量精子空泡直徑，進(jìn)一步研究精子空泡對正常受精、D3優(yōu)胚及可用囊胚的形成以及移植后患者臨床結(jié)局的影響。本研究結(jié)果表明，無空泡組的正常受精率略高于空泡組（74.1%vs.71.4%），但無統(tǒng)計學(xué)差異，這可能與空泡組樣本較少存在一定的偏倚有關(guān)；另外，本次研究中所觀察到的精子空泡直徑均低于2μm，可能對正常受精結(jié)果并不造成顯著影響。Greco等［24］對男性精子進(jìn)行分類，第1類（精子頭部形態(tài)正常，無空泡或空泡體積＜頭部的4%）和第2類（精子頭部形態(tài)正?；蝾^部最多含2個空泡，一個＜頭部的4%，另一個＞頭部的4%）為第1組，第3類（頭部形態(tài)正常伴3個及以上小空泡，空泡體積＜頭部的4%）和第4類（精子頭部形態(tài)異常，有大空泡和小空泡）為第2組，兩組的受精率（73.7%vs.66.9%）比較，無顯著性差異。

精子空泡在注射入卵后對患者胚胎發(fā)育的影響也引起研究者們的關(guān)注。有研究顯示，由于精子的個體形態(tài)差異，導(dǎo)致胚胎具有不同的發(fā)育潛力，精子頭部無空泡或者少于2個小空泡相比其他形態(tài)精子而言，囊胚形成率較高［25］。亦有研究認(rèn)為精子空泡的存在影響囊胚的形成［26］。2014年，Vingris等［27］對72對行輔助生殖治療夫婦的14 400條精子進(jìn)行分組分析，研究發(fā)現(xiàn)精子空泡數(shù)低于2個的精子比例與囊胚形成、胚胎種植率呈正相關(guān)，且無空泡的精子流產(chǎn)率較低。

為了能更好地觀察精子空泡對胚胎發(fā)育的影響，本研究將精子注射入卵后進(jìn)行了單獨培養(yǎng)，觀察胚胎發(fā)育情況，結(jié)果顯示雖然各組間比較無顯著性差異，但無空泡組的可用囊胚形成率和D3 優(yōu)胚率均高于空泡組，而進(jìn)一步將空泡精子進(jìn)行分組后發(fā)現(xiàn)，空泡直徑分別為＜1μm、1～1.5μm、＞1.5～2μm的精子注射入卵后，3組的正常受精率、D3優(yōu)胚率、可用囊胚形成率均無顯著性差異，這一方面可能與本研究所納入的樣本量較少有關(guān)，另一方面可能與在低倍鏡下挑選精子時，往往對存在清晰可見的大空泡精子放棄使用，因此本研究所納入的精子空泡直徑均較小有關(guān)。Watanabe 等［14］在400 倍下，觀察不育和有生育能力男性的精子形態(tài)發(fā)現(xiàn)，空泡＞1.5μm 所占比例分別是4.6%和4.2%。有研究顯示，精液指標(biāo)正常和不正常男性精子空泡大小的平 均 值：前 者 空 泡 平 均 大 小 為1.49 μm［8］，1.8μm［15］；后 者 為1.59μm［8］，1.9μm［15］。Setti等［28］對60 對接受ICSI治療患者的549 枚胚胎進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，精子大空泡的出現(xiàn)會影響受精卵的卵裂、D3優(yōu)胚、囊胚的形成以及形成囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞數(shù)，同時還建議大空泡的體積應(yīng)該低于精子頭部的24.5%，當(dāng)大空泡體積低于19.5%時，所形成的囊胚質(zhì)量較高。2013 年，Knez等［29］在研究中首次運用精子放大系統(tǒng)和胚胎動態(tài)觀察系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)無空泡精子形成的胚胎卵裂至4細(xì)胞和形成囊胚均要早于大空泡精子。

相關(guān)研究還顯示，精子空泡的存在不會影響卵母細(xì)胞的受精和受精卵的早期卵裂，但是D3 胚胎移植后，患者的臨床結(jié)局和活產(chǎn)率有顯著性差異，且IMSI技術(shù)的運用能提高臨床妊娠率和胚胎種植率［30-31］。本研究結(jié)果顯示，無空泡組與空泡組D3胚胎移植后的著床率（40.3%vs.22.2%）比較無顯著性差異，但臨床妊娠率（77.3%vs.22.7%）比較有顯著性差異，研究結(jié)果與前述研究有所不同，可能與樣本量較小、精子空泡直徑均較小有關(guān)。本研究中無空泡組的臨床妊娠患者無一例流產(chǎn)，胚胎質(zhì)量亦相對好于空泡組，這與之前研究報道精子放大系統(tǒng)能有效提高胚胎質(zhì)量［32］、增加臨床妊娠率［33］、相比傳統(tǒng)ICSI周期更能降低流產(chǎn)率［34-35］的結(jié)果相似。

綜上所述，精子頭部空泡直徑低于2μm 時，與無空泡精子相比，兩者注射入卵后，僅胚胎冷凍率和妊娠率有顯著性差異，而胚胎著床率和其余實驗室指標(biāo)均無顯著性差異。但樣本量較少是本次研究存在的主要問題，后續(xù)研究應(yīng)加大樣本量以驗證精子空泡對胚胎著床率和臨床妊娠率的影響，并做好長期的隨訪工作以觀察妊娠后新生兒的健康狀況，為臨床應(yīng)用提供一定參考。

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