ICSI助孕患者濾泡液中T、B淋巴細(xì)胞亞群對獲卵率的影響

徐進(jìn)，張翠蓮，李航生，張靜，常瓊，張耀，張合龍

（河南省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，鄭州 450003）

早在幾十年前人們就認(rèn)識到免疫因素對不孕的影響［1］。自此以后人們開始研究免疫系統(tǒng)對生殖系統(tǒng)各個(gè)方面的影響，臨床上把由免疫因素引起的不孕癥稱為免疫性不孕［2］。研究發(fā)現(xiàn)，習(xí)慣性流產(chǎn)及多次體外受精-胚胎移植（IVF-ET）失敗的患者，多存在外周血淋巴細(xì)胞比例異常［3-6］。T 細(xì)胞是重要的淋巴細(xì)胞，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，主要行使CD4＋T細(xì)胞的遲發(fā)型超敏反應(yīng)（DTH）和CD8＋T 細(xì)胞的毒性殺傷（CTL）作用。血液中的T 淋巴細(xì)胞比例失調(diào)往往預(yù)示著妊娠失敗或者流產(chǎn)［3-6］。

濾泡液為卵母細(xì)胞提供生存的微環(huán)境，濾泡液中富含卵母細(xì)胞發(fā)育成熟所必須的激素、蛋白、糖類、活性氧、抗凋亡因子、細(xì)胞因子、生長因子等化學(xué)物質(zhì)［7］，濾泡液中還含有豐富的淋巴細(xì)胞，這些物質(zhì)的紊亂或比例失調(diào)直接影響到卵母細(xì)胞的質(zhì)量、獲卵率及受精率甚至患者的妊娠結(jié)局。

本實(shí)驗(yàn)通過測定ICSI助孕治療患者取卵日濾泡液中T、B 淋巴細(xì)胞比例，以探討濾泡液中T、B淋巴細(xì)胞對卵母細(xì)胞及胚胎的可能影響。

材料與方法

一、材料

1.患者選擇及處理：選自首次接受ICSI助孕治療的患者。

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡＜35歲，身體健康，無免疫性疾病史，平素月經(jīng)規(guī)律，基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平正常，不育因素為單純男方嚴(yán)重少弱精子癥或梗阻性無精子癥。

患者于黃體中期開始給予達(dá)必佳（輝凌，德國）0.1mg，ih，qd，連續(xù)用藥18d后改為0.05mg，ih，qd，同時(shí)加用促排卵藥（果納芬，默克雪蘭諾，德國，或普麗康，默沙東，荷蘭）150～225U，ih，qd。當(dāng)有60%的卵泡平均直徑超過18mm 時(shí)，給予HCG（珠海麗珠）7 000～10 000U 肌肉注射，36.5～37h手術(shù)取卵。

2.濾泡液收集及分組：手術(shù)日經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下濾泡液抽吸取卵，收集取卵后清亮濾泡液待測。根據(jù)獲卵情況分為兩組：獲卵率（獲卵數(shù)／穿刺卵泡數(shù)）＞80%為A 組（20例），獲卵率＜50%為B組（20例）。

3.主要儀器：流式細(xì)胞儀（NAVIOS）（Becton-Dickinson，美國）、臺式離心機(jī)、渦旋震蕩器、微量移液器（1 000μl、100μl、10μl）、流式細(xì)胞專用試管。

4.檢測試劑：Mouse IgG1-FITC、Mouse IgG1-PE、Mouse IgG1-APC、CD3-FITC、CD8-PE、CD45-PerCP、CD4-APC、CD19-APC，PBS，BD FACS Lysing Solution紅細(xì)胞裂解液（10×）（Becton-Dickinson，美國）。

二、方法

1.實(shí)驗(yàn)步驟：取7支流式試管，分別標(biāo)記①對照管、②FITC、③PE、④PerCP、⑤APC、⑥3-8-4-45、⑦3-16／56-19-45。對照管分別加入20μl Mouse IgG1-FITC、Mouse IgG1-PE、Mouse IgG1-APC、CD45-PerCP熒光抗體；②～⑤管依次加入20μl CD3-FITC、CD8-PE、CD45-PerCP、CD4-APC 熒 光 抗體；⑥管分別加入20μl CD3-FITC、CD8-PE、CD45-PerCP、CD4-APC熒光抗體；⑦管分別加入20μl CD3-FITC、CD45-PerCP、CD19-APC熒光抗體。

分別取100μl處理后的濾泡液細(xì)胞懸液加入每支試管中。依次用1×FACS Lysing Solution及PBS處理后，4℃避光1h內(nèi)上機(jī)檢測。標(biāo)本用NAVIOS 流式細(xì)胞儀獲取數(shù)據(jù)。每個(gè)樣本收集10 000個(gè)細(xì)胞。

2.軟件分析：用Kaluza軟件進(jìn)行結(jié)果分析，在CD45／SSC散點(diǎn)圖設(shè)門（R1）為淋巴細(xì)胞，其余散點(diǎn)圖顯示均為R1 門細(xì)胞，以①管為標(biāo)尺，分別得出CD3和CD4 雙 陽 細(xì) 胞、CD3 和CD8 雙 陽 細(xì) 胞、CD19陽性細(xì)胞。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料（%）采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組患者基本特征

兩組患者的平均年齡、不育年限、基礎(chǔ)卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）水平、平均用藥天數(shù)、平均用藥量相比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表1）。

表1 兩組患者基本情況比較（±s）

表1 兩組患者基本情況比較（±s）

組 別 例數(shù) 平均年齡（歲）不育年限（年） FSH（U／L） LH（U／L） E2（pmol／L） P（nmol／L） 用藥天數(shù)（d） 用藥量（U）A組 20 29.7±3.2 3.2±2.5 7.5±2.3 5.7±4.1 92.9±35.2 2.2±1.0 11±2.4 2 280±357 B組 20 28.5±4.3 3.7±2.1 6.8±2.9 5.2±3.8 104.2±37.4 1.6±1.3 12±3.1 2 132±348

二、兩組獲卵及胚胎形成情況比較

A 組的平均獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、受精卵數(shù)及可利用胚胎數(shù)均顯著高于B組（P＜0.05）；兩組間獲卵率（獲卵數(shù)／穿刺卵泡數(shù)）比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），但受精率（受精卵數(shù)／成熟卵數(shù)）及可利用胚胎率（可利用胚胎數(shù)／受精卵數(shù)）均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表2）。

三、兩組濾泡液中淋巴細(xì)胞亞群的比較

兩組間CD4＋T 淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；A 組CD8＋T 淋巴細(xì)胞顯著低于B組（P＜0.05）（表3，圖1）。

表2 兩組獲卵及胚胎形成情況結(jié)果比較［（±s），%］

表2 兩組獲卵及胚胎形成情況結(jié)果比較［（±s），%］

注：與A 組比較，＊P＜0.05

組別 例數(shù) 穿刺卵泡數(shù)（個(gè)）獲卵數(shù)（枚）MⅡ卵數(shù)（枚） 獲卵率 受精卵數(shù)（枚） 受精率 可利用胚胎數(shù)（枚）可利用胚胎率A 組 20 14.1±4.2 12.8±4.3 9.3±6.2 90.8 7.7±3.4 82.8 5.2±3.4 67.5 B組 20 13.5±3.1 6.6±3.7＊ 5.1±2.7＊ 48.9＊ 4.2±2.6＊ 82.4 2.8±1.6＊66.7

表3 兩組濾泡液中淋巴細(xì)胞亞群的比較（%）

圖1 濾泡液中淋巴細(xì)胞亞群流式細(xì)胞分析

討 論

濾泡液作為卵母細(xì)胞生存的微環(huán)境，含有豐富的卵母細(xì)胞發(fā)育成熟所必需的化學(xué)物質(zhì)，包括激素、蛋白、活性氧、細(xì)胞因子、生長因子等。濾泡液微環(huán)境的改變直接影響到母體的生育能力，代謝紊亂和能量失衡可以引起卵巢功能的紊亂，影響到生長發(fā)育中卵母細(xì)胞的質(zhì)量［8］。濾泡液中的皮質(zhì)醇可能對卵丘細(xì)胞脂質(zhì)分解起一定作用，其含量與卵丘細(xì)胞脂質(zhì)含量成負(fù)相關(guān)［9］。研究表明濾泡液中過氧化物含量和抗氧化狀態(tài)影響不育患者的妊娠結(jié)局。卵巢的氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯高于血漿的氧化應(yīng)激反應(yīng)，升高的氧化應(yīng)激水平有利于促排卵過程中獲得較多的成熟卵［10］。卵巢儲備功能降低或高齡患者能夠改變卵泡細(xì)胞、濾泡液的代謝物質(zhì)，這些改變能夠影響卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能及胚胎的發(fā)育潛能［11］。濾泡液中還含有淋巴細(xì)胞，特發(fā)性不育患者的濾泡液中細(xì)胞毒性CD16＋、CD56-、NK 細(xì)胞亞群數(shù)量增加，并且這種增加能夠降低受精率［12］。

T 細(xì)胞作為免疫效應(yīng)細(xì)胞，主要行使CD4＋T細(xì)胞的DTH 和CD8＋T 細(xì)胞的CTL 作用。CD8＋細(xì)胞毒性T 細(xì)胞在細(xì)胞免疫、抗病毒感染、抗腫瘤及器官移植排斥中發(fā)揮重要作用。其主要作用是直接特異性殺傷帶有MHC-Ⅰ類分子的靶細(xì)胞。成熟B細(xì)胞可在識別抗原后進(jìn)一步分化為能分泌特異性免疫球蛋白的漿細(xì)胞和攜帶抗原信息的記憶性B細(xì)胞。B細(xì)胞能產(chǎn)生抗體發(fā)揮抗體的中和作用、調(diào)理作用及抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。另外活化的B 細(xì)胞可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和造血過程。

在月經(jīng)各期和早孕的子宮內(nèi)膜中T 細(xì)胞數(shù)量相對穩(wěn)定，和外周血中T 細(xì)胞不同，子宮內(nèi)膜間質(zhì)中超過2／3 的T 細(xì)胞為CD8＋T 細(xì)胞（外周血中CD4＋T 細(xì)胞占65%，CD8＋占35%）。在圍著床期，子宮內(nèi)膜局部分泌一些化學(xué)因子，能使T 細(xì)胞（主要是Th2細(xì)胞）遷移進(jìn)入子宮，使胚胎成功著床［13］。通過比較妊娠過程中外周血和蛻膜中T 細(xì)胞情況，發(fā)現(xiàn)子宮蛻膜主要為Th2和Tc2，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于外周血。所以，子宮內(nèi)膜或蛻膜的Th2和Tc2細(xì)胞可能通過其產(chǎn)生的細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)圍著床期子宮內(nèi)膜對胚胎的適應(yīng)性反應(yīng)，有利于胚胎的成功種植和妊娠的維持［14-15］。T 細(xì)胞在卵巢功能早衰中起著至關(guān)重要的作用，其中Th1細(xì)胞占優(yōu)勢。Th1細(xì)胞分泌白介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞及黃體細(xì)胞MHC-Ⅱ類抗原的表達(dá)，誘發(fā)自身免疫應(yīng)答，使顆粒細(xì)胞和卵泡受到破壞，從而發(fā)生卵巢功能早衰。這類患者外周血CD8＋T 細(xì)胞明顯升高，CD4＋／CD8＋T 細(xì)胞的比值下降，與血清E2水平下降相關(guān)。卵巢功能早衰患者的卵巢內(nèi)還能檢測到細(xì)胞毒性殺傷細(xì)胞。T 細(xì)胞在濾泡液中的研究表明，濾泡液中T 細(xì)胞數(shù)量的變化并不能預(yù)示妊娠的結(jié)局［16］。CD27是記憶性B細(xì)胞的表面抗原。不孕患者及有不良孕史的患者外周血CD27＋B 細(xì)胞明顯低于正常懷孕組。外周血CD27＋B 細(xì)胞的表達(dá)降低或不正常表達(dá)，均提示免疫功能的紊亂［17-20］。但不孕患者外周血總的B 細(xì)胞數(shù)與正?；颊呦啾炔]有顯著性增加。不孕患者和多次IVF 助孕失敗的患者濾泡液中CD27＋B 細(xì)胞明顯高于流產(chǎn)組和宮外孕組［21］。無論是不孕患者還是助孕后成功受孕的患者卵泡液中B 細(xì)胞的百分率都小于外周血濃度［21］。

我們的研究顯示，濾泡液中T 淋巴細(xì)胞亞群的變化并不影響患者的受精率及可利用胚胎率，但卻影響獲卵率。兩組患者濾泡液中成熟B 淋巴細(xì)胞數(shù)并沒有顯著不同，提示B 淋巴細(xì)胞參與的體液免疫調(diào)節(jié)在濾泡液中的影響可能很小。免疫系統(tǒng)中免疫細(xì)胞之間相互影響，所分泌的細(xì)胞因子之間存在網(wǎng)格狀交互作用。免疫細(xì)胞對卵母細(xì)胞及獲卵率的影響也絕不是單一的作用，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

［1］ Medawarp B.Some immunological and endocrinological problems raised by the evolution of viviparity in vertebrates［J］.Symp Soc Exp Biol，1953，7：320-338.

［2］ Kaider AS，Kaider BD，Janowic PB，et al.Immunodiagnostic evaluation of women with reproductive failure［J］.Am J Reprod Immunol，1999，42：335-346.

［3］ Gleicher N，Liu HC，Dudkiewitcz A，et al.Autoantibody profiles and immunoglobulin levels a predictors of in vitro fertilization［J］.Am J Obstet Gynecol，1994，170：1145-1149.

［4］ Ng SC，Gilman-Sachs A，Thaker P，et al.Expression of intracellular Th1and Th2cytokines in women with recurrent spontaneous abortion，implantation failures after IVF／ET or normal pregnancy［J］.Am J Reprod Immunol，2002，48：77-86.

［5］ Nip MM，Taylor PV，Rutheford AJ，et al.Autoantibodies and antisperm antibodies in sera and follicular fluids of infertile patients；relation to reproductive outcome after in-vitro fertilization［J］.Hum Reprod，1995，10：2564-2569.

［6］ Kwak-Kim JY，Chung-Bang HS，Ng SC，et al.Increased T helper 1cytokine responses by circulating T cells are present in women with recurrent pregnancy losses and in infertile women with multiple implantation failures after IVF［J］.Hum Reprod，2003，18：767-773.

［7］ Revelli A，Delle Piane L，Casano S，et al.Follicular fluid content and oocyte quality：from single biochemical markers to metabolomics［J］.Reprod Biol Endocrinol，2009，7：40.

［8］ Leroy JL，Rizos D，Sturmey R，et al.Intrafollicular conditions as a major link between maternal metabolism and oocyte quality：a focus on dairy cow fertility［J］.Reprod Fertil，2011，24：1-12.

［9］ Simerman AA，Hill DL，Grogan TR，et al.Intrafollicular cortisol levels inversely correlate with cumulus cell lipid content as a possible energy source during oocyte meiotic resumption in women undergoing ovarian stimulation for in vitro fertilization［J］.Fertil Steril，2015，103：249-257.

［10］ Velthut A，Zilmer M，Zilmer K，et al.Elevated blood plasma antioxidant status is favourable for achieving IVF／ICSI pregnancy［J／OL］ .Reprod Biomed Online，2013，26：345-352.

［11］ Pacella L，Zander-Fox DL，Armstrong DT，et al.Women with reduced ovarian reserve or advanced maternal age have an altered follicular environment［J］.Fertil Steril，2012，98：986-994.

［12］ Wold AS，Arici A.Natural killer cells and reproductive failure［J］.Curr Opin Obstet Gynecol，2005，17：237-241.

［13］ Ingman WV，Jones RL.Cytokine knockouts in reproduction：the use of gene ablation to dissect roles of cytokines in reproductive biology［J］.Hum Reprod Update，2008，14：179-192.

［14］ Kalu E，Bhaskaran S，Thum MY，et al.Serial estimation of Th1：Th2 cytokines profile in women undergoing in vitro fertilization-embryo transfer［J］.Am J Reprod Immunol，2008，59：206-211.

［15］ Saito S，Nakashima A，Shima T，et al.Th1／Th2／Th17and regulatory T-cell paradigm in pregnancy［J］.Am J Reprod Immunol，2010，63：601-610.

［16］ Gaafar TM，Hanna MO，Hammady MR，et al.Evaluation of cytokines in follicular fluid and their effect on fertilization and pregnancy outcome［J］.Immunol Invest，2014，43：572-584.

［17］ Agematsu K，F(xiàn)utatani T，Hokibara S.Absence of memory B cells in patients with common variable immunodeficiency［J］.Clin Immunol，2002，103：34-42.

［18］ Warnatz K，Denz A，Dr?ger R，et al.Severe deficiency of switched memory B cells（CD27（＋）IgM （-）IgD（-））in subgroups of patients with common variable immunodeficiency：a new approach to classify a heterogenous disease［J］.Blood，2002，99：1544-1551.

［19］ Bohnhorst JO，Thoen JE，Natvig JB，et al.Significantly depressed percentage of CD27＋（memory）B cells among peripheral blood B cells in patients with primary Sj?gren’s syndrome［J］.Scand J Immunol，2001，54：421-427.

［20］ Bohnhorst JO，Bjorgan MB，Thoen JE.Abnormal B cell differentiation in primary sjogren’s syndrome results in a depressed percentage of circulating memory B cells and elevated levels of soluble CD27that correlate with serum IgG concentrations［J］.Clin Immunol，2002，103：79-88.

［21］ Vujisic S，Zidovec Lepej S，Aksamija A，et al.B-and T-cells in the follicular fiuid and peripheral blood of patients undergoing IVF／ET procedures［J］.AJRI，2004，52：379-385.