羅丹明B分子印跡固相萃取小柱的研制及應(yīng)用*

李偉鎮(zhèn)，劉燕玲，吳倩瑜，周清

(1.廣東省第一榮軍醫(yī)院藥劑科，廣州 510260；2.廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院，廣州 510006)

羅丹明B(Rhodamine B)是一種桃紅色的人工合成堿性染料，主要用于造紙、制漆、紡織、皮革和瓷器的工業(yè)染色，也曾用作食品添加劑，但后來(lái)證明其具有潛在的致癌和致突變等危險(xiǎn)。2008年，羅丹明B在我國(guó)被列入第一批《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單》中，歐盟等國(guó)家已不允許在食品中使用。但由于羅丹明B具有價(jià)格低廉、色澤鮮艷、著色穩(wěn)定等特點(diǎn)，一些不法商家為了降低成本，常將其作為蘇丹紅替代品，這給人們的飲食安全帶來(lái)極大隱患［1］。

目前，羅丹明B的檢測(cè)主要采用高效液相色譜熒光法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜紫外法等［2–4］。由于羅丹明B在食品中添加量一般較小，檢測(cè)時(shí)給樣品前處理帶來(lái)了難度，因此建立一種準(zhǔn)確、可靠、簡(jiǎn)便的前處理方法在食品安全領(lǐng)域有著重要意義。

筆者研制了一種對(duì)羅丹明B具有特異識(shí)別性能的固相萃?。?–8］小柱，在萃取過(guò)程中能同時(shí)實(shí)現(xiàn)分離和富集，大大簡(jiǎn)化了前處理過(guò)程，同時(shí)提高了測(cè)量的準(zhǔn)確度。該固相萃取小柱選擇性較好，可應(yīng)用于食品、化妝品檢測(cè)等相關(guān)領(lǐng)域。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC–10ATvp型，配有UV檢測(cè)器和LcSolution色譜工作站，日本島津公司；

紫外可見分光光度計(jì)：TU–1810型，日本島津公司；

恒溫水浴鍋：HH–6型，江蘇金壇市宏華儀器廠；

水浴恒溫振蕩儀：金壇市富華儀器有限公司；

固相萃取小柱及篩板：深圳逗點(diǎn)生物科技有限公司；

數(shù)控固相萃取儀：SC–8L–150型，廣州市智真生物科技有限公司；

羅丹明B：分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；

偶氮二異丁腈(AIBN)：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

丙烯酰胺(AM)：分析純，成都市科龍化學(xué)試劑廠；

乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)：分析純，阿拉丁試劑有限公司；

甲醇、乙腈、氨水：分析純，廣州市化學(xué)試劑廠。

1.2 羅丹明B分子印跡聚合物的制備

稱取0.239 5 g (0.5 mmol )羅丹明B置于圓底燒瓶中，加入100 mL乙腈及15 mL甲醇溶解，加入0.142 2 g (2 mmol)丙烯酰胺(AM)振蕩30 min，以使AM和羅丹明B均勻混合并充分作用，然后加入2 mL (10 mmol)乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)，30 mg偶氮二異丁腈(AIBN)，充分混勻后超聲振蕩5 min，通N2除氧10 min后密閉，置于65℃恒溫水浴中反應(yīng)24 h，得到紅色聚合物沉淀于燒瓶底部。

將上述聚合物用濾紙過(guò)濾后包好，放入索氏提取器，用甲醇–氨水洗脫模板分子，直至洗脫液中檢測(cè)不到模板分子。取出聚合物置于烘箱60℃下干燥，然后密閉放入干燥器中待用。

空白聚合物的制備除不加模板分子外，其余步驟同羅丹明B分子印跡聚合物制備。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

稱取羅丹明B 0.239 5 g，用蒸餾水溶解于500 mL容量瓶中，得濃度為1.000 mmol／L的母液。吸取適量母液用蒸餾水稀釋成濃度為0.002～0.012 mmol／L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(10個(gè))。用1 cm比色皿，以蒸餾水為參比，在553 nm波長(zhǎng)下測(cè)定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度(A )，以A為縱坐標(biāo)，以羅丹明B濃度c為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.4 絡(luò)合量測(cè)定

稱取模板聚合物10份(每份30 mg)，分別置于50 mL具塞錐瓶中，分別加入1.3中系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20 mL。置于振蕩器上在室溫下振蕩24 h。用針筒吸取清液，濾膜過(guò)濾后取濾液，根據(jù)需要稀釋，用紫外分光光度法測(cè)定吸附后濾液的吸光度，計(jì)算模板聚合物對(duì)羅丹明B的吸附量。

1.5 固相萃取

1.5.1 固相萃取柱的制作及前處理

準(zhǔn)確稱取模板聚合物和空白聚合物各0.5 g，分別裝入固相萃取小柱中(柱容量5 mL，直徑8 mm)，以蒸餾水為勻漿劑，濕法裝入固相萃取小柱中，壓緊上篩板；用甲醇反復(fù)沖洗，制得羅丹明B分子印跡聚合物與非印跡聚合物固相萃取小柱。

1.5.2 固相萃取及洗脫

配制0.05 mmol／L的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液，取5 mL上樣，連接固相萃取儀，設(shè)定萃取時(shí)間約5 min，收集過(guò)柱液，根據(jù)需要稀釋后用紫外分光光度法測(cè)定過(guò)柱液的吸光度，計(jì)算萃取率。

分別用80%甲醇、純甲醇10 mL洗脫，洗脫時(shí)間約5 min，收集洗脫液，根據(jù)需要稀釋后用紫外分光光度法測(cè)定吸光度，計(jì)算洗脫率。

1.6 色譜條件

色譜柱：C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，中國(guó)迪馬公司)；流動(dòng)相：甲醇–水(體積比為75∶25)，流量為0.6 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：553 nm；進(jìn)樣體積：20 μL。

1.7 樣品前處理

取3 g市售辣椒，研磨粉碎后置于錐形瓶中，加入甲醇25 mL，超聲15 min，靜置一段時(shí)間后取上層清液，轉(zhuǎn)移入離心管，離心后取上層清液5 mL通過(guò)模板聚合物(MIP)小柱。按1.5.2方法處理后收集洗脫液，過(guò)0.22 μm膜，吸取濾液0.5 mL并稀釋至10 mL。在1.6色譜條件下測(cè)量羅丹明B的色譜峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 印跡聚合物制備條件

為了使模板聚合物具有較佳的選擇性和識(shí)別能力，選擇模板分子、功能單體、交聯(lián)劑的質(zhì)量比例為1∶4∶20。制備聚合物過(guò)程中，在模板分子中先加入一定量的乙腈和甲醇混合溶劑，再加入AM，混勻，振蕩30 min，以便使功能單體與模板分子得到充分混合。隨著引發(fā)劑(AIBN)用量的增加，聚合速率加快，生成聚合物的相對(duì)分子質(zhì)量減小。實(shí)驗(yàn)選擇引發(fā)劑用量為30 mg。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

測(cè)定1.3中羅丹明B系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A，以A對(duì)羅丹明濃度(c，mmol／L)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=95.45c+0.021，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，線性范圍為0.002～0.012 mmol／L。

2.3 絡(luò)合量測(cè)定結(jié)果

按1.4方法測(cè)定吸附前后標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的變化，按式(1)計(jì)算吸附量。羅丹明B模板、空白聚合物吸附量測(cè)定結(jié)果見表1，吸附量對(duì)比見圖1。

式中：Q——吸附量，mg／g；

c0——吸附前標(biāo)準(zhǔn)溶液的起始濃度，mmol／L；

c——吸附后溶液濃度，mmol／L；

V——加入標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；

M——羅丹明B的相對(duì)分子質(zhì)量，M=479；

30——聚合物取樣量，mg。

表1 羅丹明B模板、空白聚合物的吸附量

圖1 MIP，NMIP柱吸附量對(duì)比

由表1及圖1可以看出，羅丹明B模板聚合物(MIP)和空白聚合物(NMIP)的吸附量隨著溶液濃度增大而提高，模板聚合物的吸附能力比空白聚合物的吸附能力明顯提高，由此可認(rèn)為羅丹明B模板聚合物對(duì)羅丹明B具有特異性識(shí)別性能。

2.4 固相萃取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 萃取率

按1.5方法制作固相萃取小柱并進(jìn)行萃取實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。由表2可知，模板柱的萃取率明顯高于空白柱，說(shuō)明模板柱為特異性吸附起主要作用，呈現(xiàn)出較好的選擇性；而空白柱為非特異性吸附起主要作用。

表2 模板、空白聚合物固相萃取羅丹明B實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 洗脫劑比較

按1.4方法洗脫被萃取的羅丹明B，洗脫率結(jié)果見表3。由表3可知，用80%甲醇能將大部分的羅丹明B洗脫下來(lái)；用100%甲醇，基本能將羅丹明全部洗脫下來(lái)，洗脫效果顯著，因此可直接采用純甲醇作為洗脫劑。

表3 洗脫劑洗脫能力比較

2.5 方法精密度與回收試驗(yàn)

按1.7方法處理辣椒樣品后進(jìn)行測(cè)定，樣品中均未檢出羅丹明B。在辣椒樣品中分別添加3種不同水平的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行回收試驗(yàn)，羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液及加標(biāo)后辣椒樣品溶液的色譜圖見圖2，試驗(yàn)結(jié)果見表4。由圖2可知，制備的固相萃取柱的選擇性較好，由表4可知，平均回收率為90.0%～95.0%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～1.7%。

圖2 羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液及辣椒加標(biāo)樣品色譜圖

表4 精密度及回收試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

3 結(jié)語(yǔ)

靜態(tài)平衡吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明印跡聚合物的吸附能力明顯強(qiáng)于空白聚合物，呈現(xiàn)出較好的特異性識(shí)別性能；固相萃取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明印跡聚合物小柱的選擇性較好，吸附量較大，且易于洗脫，可應(yīng)用于食品、化妝品等相關(guān)領(lǐng)域羅丹明B的檢測(cè)。

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