L-茶氨酸生物制備技術和生物功能研究進展

賁培玲，朱巖巖，殷志敏*

（1.滁州城市職業(yè)學院，安徽滁州 239000；2.南京師范大學生命科學學院，江蘇南京 210046）

茶葉被譽為“世界三大飲料之一”，其中含有的兒茶素、膽甾烯酮、咖啡堿、茶氨酸、葉酸、泛酸等成分有益于人體健康。L-茶氨酸，即N-乙基-γ谷氨酰胺（Nethyl-γ-L-glutamine），屬酰胺類化合物，是茶葉中含量最豐富的游離氨基酸，是茶葉的主要呈味物質[1]。在新鮮的茶葉中，L-茶氨酸的含量約占干重的1%～2%；在茶湯中，L-茶氨酸的浸出率可高達80%。L-茶氨酸有多種生物學功效，如保護腦神經、抗疲勞、抗腫瘤等，已被廣泛研究和關注。

1 L-茶氨酸的理化性質

茶氨酸的分子式為C7H14N2O3，相對分子量為174.20，化學結構式見圖1，構型有D型和L型，自然界存在的茶氨酸均為L型。L-茶氨酸純品為白色針狀結晶，極易溶于水，不溶于乙醇或乙醚，水溶液為微酸性，具有焦糖的香味和味精的鮮味。L-茶氨酸的性質比較穩(wěn)定，熔點為217～218℃，在沸水中煮沸5 min，或將其溶于pH 3.0 的溶液中在25℃下存放12個月，其含量基本保持不變[2]。

圖1 L-茶氨酸結構式Fig.1 Chemical structure of L-theanine

2 L-茶氨酸生物制備技術的研究現(xiàn)狀

茶氨酸在食品、化工及醫(yī)藥等領域的應用廣泛，需求量大。目前生產茶氨酸的方法主要有提取法、植物組織培養(yǎng)法、化學合成法和生物合成法。隨著生物技術的發(fā)展和應用，利用微生物發(fā)酵生產酶，進而利用酶來催化生產L-茶氨酸的技術日益受到重視。用于合成茶氨酸的酶主要有：茶氨酸合成酶、谷氨酰胺酶、γ-谷氨酰甲胺合成酶、谷氨酰胺合成酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和γ-谷氨酰轉肽酶。酶催化合成L-茶氨酸的原理有：（1）谷氨酸和乙胺為底物的連接合成反應，反應需要ATP 供能；（2）谷氨酰胺和乙胺為底物的?；D移反應。酶催化生產L-茶氨酸過程見圖2，下面介紹幾種用于合成茶氨酸的酶的研究和應用狀況。

圖2 酶催化生產L-茶氨酸Fig.2 Biotechnological production of L-theanine by enzymes

2.1 茶氨酸合成酶 （Theanine synthetase，TS，EC 6.3.1.6）

茶氨酸合成酶是茶樹獨有的酶，對谷氨酸、乙胺和ATP 有高親和力，主要在茶樹的根部催化谷氨酸與乙胺生成L-茶氨酸，L-茶氨酸從根部輸送到葉中[3]。李平等[4]以茶籽為原料培育茶苗，從茶苗中提取L-茶氨酸合成酶。L-茶氨酸合成酶的最佳反應溫度為35℃，作用時間為40 min，pH 為7.5。但是因為該酶不穩(wěn)定，對其分離純化條件仍需研究。

2.2 谷氨酰胺合成酶 （L-glutamine synthetase，GS，EC 6.3.1.2）

GS 催化谷氨酸和乙胺合成L-茶氨酸，反應需要ATP。Yamamoto 等[5]將腐臭假單胞菌Y-30 的GS 基因克隆轉化入大腸桿菌E.coli AD494（DE3）/pET21a-GS 細胞中，GS 能伴隨發(fā)酵能量的轉移催化合成L-茶氨酸。朱文嫻等[6]將熒光假單胞菌GS 基因轉接入pET32a 質粒中，再將重組質粒轉化到E.coli BL21 中，構建合成L-茶氨酸的基因工程菌。工程菌株經0.1 mmol/L IPTG，28℃誘導表達，濕菌體的酶活力達到41.79 U/mg prot。工程菌催化L-谷氨酸鈉和鹽酸乙胺反應生成L-茶氨酸的產量達6.2 g/L。

2.3 γ-谷氨酰甲胺合成酶（γ-glutamylmethylamide synthetase，GMAS，EC 6.3.4.12）

Kimura 等[7]從噬甲基菌AA-30 中純化出GMAS，該酶在pH 值7.5 和40℃條件下有最大活性，可將底物L-谷氨酸和乙胺催化合成L-茶氨酸。而從 E.coli AD494（DE3）/pET21a-GM 提取 GMAS，催化谷氨酸和乙胺的反應需與糖酵解耦合，即需利用酵母提供ATP 再生系統(tǒng)，并需要Mg2+和Mn2+的參與。增加GMAS 和底物濃度，能增加L-茶氨酸產量。但是高濃度的乙胺（900 mM 或更多）抑制酵母系統(tǒng)糖酵解導致L-茶氨酸產量降低[8]。

2.4 谷氨酰胺酶（Glutaminase，GLS，EC 3.5.1.2）

GLS 在堿性條件下催化L-谷氨酰胺水解為L-谷氨酸和NH3，將谷氨酰胺基團轉移至乙胺，合成L-茶氨酸，且不需要供能。本實驗室研究了優(yōu)化重組谷氨酰胺酶催化L-谷氨酰胺和乙胺生成L-茶氨酸的反應條件。從假單胞菌DSM14399 中獲得GLS 基因（PnGLS）為909 bps，編碼302個氨基酸蛋白質，含有GLSs 關鍵的催化基團（Ser61，Lys64，Asn111，Lys193 和 Ser194）。生產 L-茶氨酸的最佳條件是0.3M 谷氨酰胺，1.5M 乙胺和1.5U/5mL重組PnGLS，pH 10.0（100 mM 硼酸鹽緩沖液），37℃反應5 h，紙層析和HPLC 檢測L-茶氨酸產量21.8 g/L[9]。

2.5 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（glutamyl cysteine synthetase，γ-GCS，EC 6.3.2.2）

γ-GCS 是谷胱甘肽合成關鍵酶，能將L-谷氨酸和L-半胱氨酸為底物催化合成γ-谷氨酰半胱氨酸，還能催化L-谷氨酸和胺生成γ-谷氨酰胺衍生物。Miyake 等[10]將重組質粒E.coli DH5α/pGSK1 表達的γ-GCS，并利用葡萄糖糖酵解產生的ATP，在反應18 h后能以429 mM 乙胺合成12.1 mM L-茶氨酸。

2.6 γ-谷氨酰轉肽酶（glutamyltranspeptidase，γ-GGT，EC 2.3.2.2）

γ-GGT 在哺乳動物組織谷胱甘肽代謝中發(fā)揮關鍵作用，也是催化轉移L-γ-谷氨酰基的特異酶。細菌的GGT 在胞質或胞外是可溶的非糖基化蛋白，并且有更廣泛的底物，有利于生物技術應用。Suzuki 等[11]首次報道用E.coil K-12 的GGT催化-γ-谷氨?；c乙胺生成L-茶氨酸。本實驗室從E.coil K-12 中克隆出γ-GGT 轉入原核表達載體pET28a 中，從而構建了在E.coli BL21（DE3）菌株高效表達γ-GTT 的工程菌，該菌經0.2 mM IPTG、20℃誘導表達8 h，粗酶液的酶活力1.5 U/mL，約是出發(fā)菌株E.coil K-12 的26倍。在37℃、pH 10.0條件下，工程菌粗酶液催化267 mM 谷氨酰胺和2.0 M 乙胺生成L-茶氨酸26.9 g/L，谷氨酰胺的轉化率為57.8%[12]。運用小泛素相關修飾（SUMO）融合技術在E.coli K-12 中表達及純化重組蛋白GGT，用M9（由甘油和無機鹽）和0.1%（重量/體積）的乳糖分別作為培養(yǎng)基和誘導劑，在1 L 的發(fā)酵液中能獲得純度不低于95%的GGT。1500 U 的純化重組GGT 在1 L 的反應體系中合成41 g L-茶氨酸[13]。Bindal 等[14]用地衣芽孢桿菌ER-15 重組表達GGT，反應體系為50 mM Tris-Cl 緩沖液中（pH 9.0）含 80 mM L-谷氨酰胺、600 mM 乙胺和1.0 U/mL GGT，在37℃下85%～87%L-谷氨酰胺可以轉換成L-茶氨酸。利用碳酸鈣固定化GGT，1 L 反應體系中可獲得35.2 g L-茶氨酸。將枯草芽孢桿菌168 GGT 基因克隆到大腸桿菌BL21（DE3）中可分泌表達γ-GGT。γ-GGT 的催化活性的最佳pH 值為10.0，在37℃下，γ-GGT 催化200 mM 的L-谷氨酰胺和2.2 M 乙胺生產L-茶氨酸，轉換率78%，而在底物為500 mM L-谷氨酰胺和1 M 乙胺時，轉換率下降至58%和45%，該研究為高底物濃度的L-茶氨酸的工業(yè)化生產提供依據(jù)[15]。

3 L-茶氨酸的生物學功能研究

L-茶氨酸經口被動物攝入后在小腸粘膜刷狀緣以鈉離子依賴的轉運體轉運入血，并可以通過亮氨酸轉運系統(tǒng)透過血腦屏障進入腦部。采用灌胃的方法使大鼠服用200 mg/kg L-茶氨酸后，血清中L-茶氨酸峰值出現(xiàn)在0.5～1.0 h 之間，腦組織中L-茶氨酸濃度5 h 達到峰值，24 h后這些組織中的L-茶氨酸完全消失。L-茶氨酸在體內的分解代謝主要在腎臟中進行，L-茶氨酸在腎臟中被谷氨酰胺酶所催化降解成谷氨酸和乙胺[16]。

3.1 神經保護作用

L-茶氨酸在短暫性腦缺血動物模型上顯示出具有腦神經保護作用。將沙鼠雙側頸動脈閉塞3 min后可誘導短暫性前腦缺血。腦缺血7 d后，海馬CA1 區(qū)錐體神經元退化或消失。在缺血30 min前給1 μL 的500 μM L-茶氨酸，海馬CA1 區(qū)錐體神經元保持良好。L-茶氨酸預處理顯著抑制神經元缺血，抑制海馬區(qū)CA1 區(qū)細胞死亡[17]。L-茶氨酸通過抑制缺血神經細胞死亡減少認知功能障礙，可以預防腦血管病。

Zukhurova 等[18]研究利用大鼠腦缺血再灌注模型探討L-茶氨酸對腦損傷的影響，他們將大鼠進行30 min 的大腦中動脈閉塞，隨后進行48 h 的再灌注，再灌注結束后檢測神經的缺損及腦梗死面積。研究結果顯示，在大鼠腦缺血再灌注后3 h和12 h 給予L-茶氨酸（1 mg/kg 和4 mg/kg）能顯著縮小腦梗塞面積。再灌注后3 h、12 h 和24 h 給予L-茶氨酸可使神經系統(tǒng)狀態(tài)得到改善。再灌注期間在紋狀體內重復注射L-茶氨酸使總量達800 μg/kg 能顯著阻止谷氨酸受體激動劑介導的腦損傷。該研究說明L-茶氨酸在大鼠腦卒中模型中具有神經保護作用。

魚藤酮和氧橋氯甲橋萘是帕金森癥 （PD）相關的神經毒性物質，L-茶氨酸（500 μM）抑制魚藤酮和氧橋氯甲橋萘誘導的神經母細胞瘤 （SHSY5Y）細胞DNA 斷裂和細胞凋亡、部分阻止魚藤酮和氧橋氯甲橋萘誘導血紅素氧合酶-1（HO-1）上調；L-茶氨酸預處理明顯阻斷魚藤酮和氧橋氯甲橋萘誘導細胞外信號調節(jié)激酶2（ERK1/2）磷酸化下調、顯著抑制SH-SY5Y 細胞中腦源性神經營養(yǎng)因子 （BDNF）與膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（GDNF）表達的下調。這些結果表明，L-茶氨酸直接提供神經保護作用抵御PD 相關的神經毒性刺激，有可能用于臨床治療PD[19]。

3-硝基丙酸（3-NP）能誘導大鼠亨廷頓舞蹈病（HD）樣癥狀，大鼠每天口服L-茶氨酸（100 mg/kg或 200 mg/kg），1 h 后腹腔注射 3-NP （1 mg/kg），共進行14 d。實驗顯示，L-茶氨酸顯著抑制3-NP誘導的大鼠行為學的改變和氧化應激，恢復3-NP減弱的超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、過氧化物酶（CAT）和琥珀脫氫酸（SDH）的活性，減少3-NP 誘導的紋狀體神經元損傷[20]。

L-茶氨酸亦能抑制鎘誘導的細胞凋亡。L-茶氨酸可抑制鎘誘導的PI3K/Akt 磷酸化以及ERK1/2 和JNK 信號通路的激活，并降低鎘誘導的ROS 產生和線粒體跨膜電位的中斷，從而降低Bax/Bcl-2 比值，抑制caspase-9 和caspase-3 激活以及PARP 切割[21]。

3.2 改善記憶和認知功能障礙

茶氨酸影響神經傳遞，尤其是抑制性突觸傳遞。孕鼠自由采食茶氨酸。幼年大鼠的體重增長率與對照組無差異。測定幼年大鼠血清中神經遞質濃度如多巴胺，5-羥色胺，GABA 和甘氨酸，茶氨酸組濃度比對照組高；幼年大鼠大腦皮層和海馬和腦神經生長因子（NGF）在mRNA 水平增加。然而，這些差異在神經成熟期結束時丟失。結果表明，茶氨酸能增強神經生長因子和神經遞質的合成和促進中樞神經系統(tǒng)（CNS）成熟[22]。 Takeda[23]等給新生大鼠喂食0.3%的L-茶氨酸水溶液，隨后的6周內均保持腦內L-茶氨酸可測出。他們發(fā)現(xiàn)茶氨酸不影響大鼠在開場中的自發(fā)行為，但可增加動物站立的探究行為，并能增強大鼠的目標識別記憶（Object recognition memory）。 此外，茶氨酸促進大鼠腦中海馬顆粒細胞的生長，提示其促進海馬的發(fā)育。給斷奶后的幼年大鼠喂食0.3%的L-茶氨酸水溶液3個月，應激引起的大鼠認知功能障礙和海馬長時程增強（LTP）的損害顯著被抑制，這種抑制作用可能與茶氨酸調控糖皮質激素分泌相關[24]。

淀粉樣蛋白β（Aβ）誘導的神經毒性是阿爾茨海默?。ˋD）主要的病理機制。給小鼠口服L-茶氨酸 2 和 4 mg/kg，持續(xù) 5周，再側腦注射 Aβ1-42（2 μg/鼠），L-茶氨酸能顯著抑制 Aβ1-42引起的記憶障礙。此外，L-茶氨酸減少Aβ1-42誘導的大腦皮質和海馬區(qū)神經細胞死亡，顯著減少腦內脂質氧化和提高GSH 水平，提示氨酸可以預防和治療AD[25]。

3.3 抗抑郁

利用小鼠強迫游泳試、懸尾、開場和利血平實驗，研究人員發(fā)現(xiàn)L-茶氨酸具有抗抑郁活性，并可能與其調節(jié)中樞系統(tǒng)單胺神經遞質相關[26]。L-茶氨酸和氟西汀相同，可以有效改善抑郁模型大鼠的抑郁行為，并提高前額皮層、伏隔核、海馬區(qū)、腦干等腦區(qū)單胺神經遞質如去甲腎上腺素（NE）、5-HT、DA 及部分代謝產物的濃度，降低谷氨酸及其前體谷氨酰胺的濃度，說明L-茶氨酸的抗抑郁機制可能和氟西汀類似，即抑制神經元對5-HT的重攝取以增加細胞外可以和突觸后受體結合的5-HT 水平[27]。

3.4 鎮(zhèn)靜、抗焦慮

給大鼠注射0.970 mg/kg 以上的咖啡堿后，大鼠大腦的β波增強，δ波減弱，α和θ波無變化，說明其處于興奮狀態(tài)?？Х葔A的興奮作用持續(xù)180 min 以上。如果在給大鼠注射咖啡堿后10 min再給其注射0.781 mg/kg L-茶氨酸，15 min后檢測出大鼠大腦中的β波減弱，δ波增強。表明L-茶氨酸抑制了咖啡堿引起的興奮作用[28]。

L-茶氨酸能顯著抑制阿片戒斷癥狀，包括好斗、腹肌僵硬、腹部捫診發(fā)聲、踱步、干嘔、落水狗樣動作、自慰等。L-茶氨酸能快速起效，持續(xù)2.5 h。高架十字迷宮和埋珠實驗結果表明L-茶氨酸能減少小鼠焦慮樣行為但并不影響其運動行為。說明L-茶氨酸可在阿片類戒斷以及焦慮相關行為的藥物治療方面發(fā)揮作用[29]。

3.5 肝臟保護作用

本實驗室的研究表明L-茶氨酸能抑制H2O2引起的肝細胞L02 存活率降低，并通過抑制Caspase-3 激活和PARP 切割及Bax/Bcl-2 比值的升高發(fā)揮抗凋亡作用[30]。L-茶氨酸在體內外均能保護動物抵御乙醇誘導的肝細胞損傷，降低乙醇對肝細胞的毒性作用，抑制乙醇誘導的肝細胞凋亡，減少乙醇引起的氧自由基和丙二醛（MDA）的含量，增加還原型谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，恢復肝細胞的抗氧化損傷的能力[31]。在小鼠體內，乙醇能夠誘導丙氨酸氨基轉氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉氨酶（AST）、甘油三酯（TG）和MDA 的含量升高，L-茶氨酸能逆轉這種升高作用。雄性ICR 小鼠每天喂食50、100、200 mg/kg L-茶氨酸7天后，用四氯化碳（CCl4）處理小鼠，發(fā)現(xiàn)L-茶氨酸能劑量依賴性地抑制CCl4引起的ALT 和AST 的升高，減少CCl4 引起的脂質過氧化，增加肝臟內還原型谷胱甘肽的含量和抗氧化酶的活性。L-茶氨酸還能通過下調細胞色素P4502 E1 的含量，抑制CCl4 的代謝活化。L-茶氨酸能抑制CCl4誘導的血漿中炎癥介質TNF-α和IL-1β增加，減少肝臟環(huán)氧化酶2（Cycloxygenase，COX-2）和誘導型一氧化氮合成酶（Inducible nitric oxide synthase， iNOS）表達減少，抑制四氯化碳引起的肝細胞凋亡[32]。

3.6 抗腫瘤作用

在體外實驗中，茶氨酸抑制人非小細胞肺癌A549 和白血病K562 細胞的生長是呈時間和劑量的依賴性。此外，茶氨酸對A549 細胞遷移的抑制作用。更重要的是，茶氨酸增強抗癌活性的抗癌藥物如曲古抑菌素A（組蛋白去乙酰化酶抑制劑）、小檗胺和去甲斑蝥素。抑制A549 細胞遷移的可能是茶氨酸對抗A549 細胞侵襲作用的重要機制[33]。合成的L-茶氨酸衍生物抑制肺腫瘤細胞和白血病細胞的遷移生長，誘導的肺癌細胞凋亡以及抑制肺癌細胞的生長[34]。

L-茶氨酸可以通過抑制谷氨酸轉運體抑制化療藥物阿霉素從埃利希腹水癌細胞中流出，從而提高阿霉素的抗腫瘤效應[35]。同樣，L-茶氨酸能增強其他蒽環(huán)類藥物順鉑、伊立替康抗腫瘤活性。L-茶氨酸還可以防止阿霉素誘導的急性肝損傷。因此，L-茶氨酸對抗腫瘤藥物療效的調節(jié)作用使其有望在臨床腫瘤化療中使用。

3.7 降血壓作用

Yokogoshi 等[36]給原發(fā)性高血壓大鼠（SHR）和正常的Wistar 大鼠（WKY）腹腔注射同劑量L-茶氨酸（0、500、1000、2000 mg/kg）。高劑量 L-茶氨酸（1000、2000 mg/kg）顯著降低 SHR 大鼠血壓。2000 mg/kg L-茶氨酸沒有改變正常大鼠血壓。L-茶氨酸處理的SHR 大鼠和WKY 大鼠的大腦中5-羥色胺顯著降低，呈劑量依賴性。Rogers 等[37]的研究顯示L-茶氨酸能降低人體血壓，拮抗咖啡因刺激引起的血壓升高。

3.8 增強人體免疫力作用

Kuriharai 等[38]的研究顯示，小鼠同時服用L-茶氨酸和L-半胱氨酸能提高GSH 水平，增高血清中IL-10/IFN-γ的比率，增加血清中特異抗原的IgG，促進Th2 細胞介導的免疫反應。小鼠同時服用L-茶氨酸和L-半胱氨酸能抑制腸道血液中IL-6 升高和GSH 降低。行為學分析顯示L-茶氨酸和L-半胱氨酸同時服用能促進術后行為活動和恢復進食。老年患者血清總蛋白低或血紅蛋白低，在接種疫苗前，服用L-茶氨酸和半胱氨酸，可加強機體對流感疫苗的免疫原性[39]。

L-茶氨酸有以上多方面的生理功能，不僅在藥用方面有很好的價值，在食品領域也有很好的利用前景。因為L-茶氨酸用于食品和保健品，對于食品級的酶的篩選和研究仍需深入。定點突變修飾或定向分子進化能提高工業(yè)用酶的活性和性能。未來L-茶氨酸高水平生產仍需要提高轉化率，降低生產成本以及改進下游生產工藝。對于L-茶氨酸的生理藥理功能也需進一步深入研究，以便更好地開發(fā)和利用L-茶氨酸。

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