不同發(fā)酵程度茶葉的體內(nèi)與體外抗氧化功能比較

東方，揭國良，何普明

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院食品學(xué)院，廣東廣州 510520；2.浙江大學(xué)茶學(xué)系，浙江杭州 310058）

茶葉是世界上最受歡迎的飲料之一。根據(jù)茶葉加工過程中多酚類物質(zhì)氧化 （即茶學(xué)界稱之為“發(fā)酵”）的程度，可將茶葉分為不發(fā)酵的綠茶，微發(fā)酵的白茶，輕發(fā)酵的黃茶，半發(fā)酵的青茶，全發(fā)酵的紅茶和后發(fā)酵的黑茶等六大類[1]。目前國內(nèi)外有關(guān)綠茶和紅茶的抗氧化作用及機(jī)理研究報道很多。近年來，普洱茶的抗氧化等生物活性也已開始受到人們的重視[2-3]。

大量的研究報道證實了茶葉中的多酚類物質(zhì)具有抗氧化、抗癌、抗突變、降血脂、降血壓、殺菌、消炎等多種保健功能，是茶葉中最主要的有效成分[4]。綠茶的多酚類物質(zhì)主要是未經(jīng)氧化的兒茶素類，紅茶的多酚類物質(zhì)則主要是兒茶素類經(jīng)酶促氧化或非酶促氧化形成的聚合物如茶黃素和茶紅素（大分子的未知結(jié)構(gòu)物）等[5]。普洱茶由于有微生物參與作用，在漫長的溫、濕環(huán)境下其多酚類的變化更為復(fù)雜。已有研究機(jī)構(gòu)從普洱茶中分離得到一種高氧化的黑茶素類化合物，為普洱茶中存在特異多酚類物質(zhì)提供了有力證據(jù)[6]。本文選用了綠茶、紅茶、普洱茶等3種不同發(fā)酵程度的茶葉，研究其多酚類組成及其含量，測定其體外清除自由基的能力，同時選用8～12月齡正常小鼠為模型，觀察這三種茶對小鼠的丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPX）的影響，旨在探明不同發(fā)酵工藝所產(chǎn)生活性成分及其抗氧化功效的差異性。

1 材料與方法

1.1 動物及飼喂條件

昆明小鼠，清潔級，體重30 g 左右，雌性，由浙江省實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)于定時交換空氣（每小時 6次）、恒溫（23±2 ℃）、定時適當(dāng)亮度的照明（6:30～18:30）、相對濕度 50%～60%的動物實驗室。小鼠自由攝食、飲水?；A(chǔ)飼料為浙江省實驗動物中心提供的用于鼠類生長發(fā)育期的固體飼料。

1.2 茶粉與試劑

普洱茶粉，自制，取普洱茶（由浙江省茶葉進(jìn)口公司提供，產(chǎn)地云南）以 1∶10，1∶5 的茶水比例在沸蒸餾水中30 min 浸提2次，浸提液合并，真空冷凍干燥后得普洱茶粉。綠茶粉與紅茶粉購自浙江省龍游茗皇天然食品開發(fā)有限公司 （各茶粉均為該茶類的水提物噴霧干燥）。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG，純度＞98%）與茶多酚（TP，純度TP＞95%，EGCG＞40%）由浙江大學(xué)茶葉科技開發(fā)有限公司提供。二苯基苦基偕腙肼（DPPH）、兒茶素標(biāo)樣與茶黃素標(biāo)樣均購自Sigma公司。甲醇、乙腈均為色譜純，購自天津四友有限公司。其余試劑均為國產(chǎn)A.R 級。

1.3 方法

1.3.1 各茶粉中化學(xué)成分組成及含量測定

茶多酚測定：酒石酸鐵比色法[7]；黃酮類測定：三氯化鋁法[7]；沒食子酸、兒茶素及茶黃素測定：HPLC 法[8-9]。

1.3.2 體外自由基（DPPH）測定[10]

將溶于甲醇的DPPH （濃度為1 ×10-3mol/L）0.8 mL，與2.4 mL 不同濃度的三類茶粉的甲醇溶液混合，充分混勻后在室溫、暗室中放置30 min，測定517 nm 下吸光值ODsample。以甲醇代替各樣品溶液作為對照得 （ODck），計算清除率：%DPPH scavenging rate= （ODck-ODsample）×100/ODck。

1.3.3 動物分組及給藥

動物試驗按衛(wèi)生部1996年文件“保健食品功能學(xué)評價程序和檢驗方法的測定”[11]進(jìn)行。隨機(jī)分成4組，設(shè)對照組、綠茶組、紅茶組與普洱茶組。采用灌胃給藥，各茶組劑量為 0.9 g·kg-1·d-1，對照組灌胃相當(dāng)量的對照液（蒸餾水）。每天記錄各組小鼠的體重變化。給藥3周后斷頭取血與肝組織，進(jìn)行三項指標(biāo)測定：MDA 含量 （采用四乙氧基丙烷對照法）、SOD 活性（采用氯化硝基四氮唑藍(lán)法，酶活定義：抑制NBT 光化還原反應(yīng)的50%為一個酶活力單位）與GSH-PX 活性（采用DTNB 法，鼠血清GSH-PX 活力單位定義：規(guī)定每1 mL 血清，每分鐘扣除非酶反應(yīng)的1 g[GSH]降低后，使1 g[GSH]降低1 為一個酶活力單位；肝臟GSH-PX 比活力單位：規(guī)定肝臟每毫克蛋白質(zhì)，每分鐘扣除非酶反應(yīng)，使GSH 降低1 μmol 為一個酶活力單位。

1.3.4 統(tǒng)計方法

采用SAS System for Windows V8 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，表示方法為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（mean±S.E.）。采用兩樣本均數(shù)t 檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 各茶粉的化學(xué)成分組成及含量

由表1可知，綠茶中的多酚含量均高于紅茶與普洱茶，而黃酮類含量則低于紅茶與普洱茶。紅茶與普洱茶具有相當(dāng)量的沒食子酸，且含量均高于綠茶。在綠茶與普洱茶中僅檢測到少量的茶黃素，紅茶中的茶黃素含量高于綠茶與普洱茶。由表2可知，綠茶的兒茶素以EGC 與EGCG 為主，約占總量的70%以上，非酯型兒茶素高于酯型兒茶素，且兒茶素總量高于紅茶與普洱茶。GC 為紅茶與普洱茶的主要兒茶素，分別占各自總量的47%與89%。紅茶與普洱茶中兒茶素也以非酯型為主，且紅茶兒茶素總量高于普洱茶。

表1 各茶粉化學(xué)成分組成及其含量（單位：mg/g）Table 1 Chemical compositions of green tea,black tea and pu-erh tea(Unit:mg/g)

表2 各茶粉兒茶素組成及其含量（單位：mg/g）Table 2 Catechins in green tea，black tea and pu-erh tea（Unit:mg/g）

2.2 各茶粉體外清除DPPH 的能力

由表3可知，在DPPH 反應(yīng)體系中，各茶粉濃度的對數(shù)與清除率存在著線性關(guān)系（P＜0.01）。由線性方程得出的抑制50%DPPH 時所需濃度（IC50），可知各茶粉對DPPH 自由基的清除效果由強(qiáng)到弱依次為綠茶＞紅茶＞普洱茶。

表3 各茶粉清除DPPH 自由基能力Table 3 DPPH-scavenging activity of green tea，black tea and pu-erh tea

2.3 各茶粉對小鼠體重變化的影響

小鼠分組時的體重與實驗?zāi)┢跁r體重結(jié)果見表4。由于小鼠為成齡小鼠，生長緩慢。從表4 中可以看出，各組老鼠在實驗?zāi)┢隗w重略有下降，但與實驗初期比較并無顯著性差異（P＞0.05），說明各茶粉的灌胃方式未對小鼠產(chǎn)生體重上的影響。

表4 實驗期間小鼠體重變化（單位：g）Table 4 Changes of body weight（BW）and BW change of each tested group in experimental period （Unit:g）

2.4 各茶粉對小鼠血清及肝組織中MDA 含量的影響

圖1 各茶粉對小鼠血清及肝組織中丙二醛含量的影響Fig.1 Effect of green tea，black tea and pu-erh tea on the content of MDA in the serum and liver of rats

由圖1A可知，與對照組相比，普洱茶組能顯著降低小鼠血清中MDA 含量（P＜0.05），綠茶組與紅茶組均無顯著性差異（P＞0.05）。圖1B 的結(jié)果表明紅茶組（P＜0.01）與普洱茶組（P＜0.05）均能降低小鼠肝組織中MDA 的含量，綠茶組與對照組相比，無顯著性差異（P＞0.05）。

2.5 各茶粉對小鼠肝組織中SOD 活力的影響

由圖2可知，綠茶組與紅茶組能提高小鼠肝組織中的SOD 活性，與對照組相比達(dá)到極顯著差異 （P＜0.01），而普洱茶組則對小鼠肝組織中的SOD 活性則具有一定的抑制作用。這三組茶提取物處理對小鼠血清中的SOD 活性與對照組比較無顯著性影響。

2.6 各茶粉對小鼠血清及肝組織中GSH-PX 活力的影響

圖3A 表明綠茶組與紅茶組均能顯著提高小鼠血清中GSH-PX 活性，與對照組相比達(dá)到極顯著差異 （P＜0.01），普洱茶組對小鼠血清中GSHPX 活性無顯著性影響 （P＞0.05）。肝組織中的GSH-PX 活性結(jié)果表明（圖3B），三類茶組均能提高小鼠肝臟中GSH-PX 活性，與對照組相比，綠茶組與紅茶組達(dá)到顯著差異（P＜0.05），普洱茶組則達(dá)到極顯著差異（P＜0.01）。

圖2 各茶粉對小鼠肝組織中超氧化物歧化酶活力的影響Fig.2 Effect of green tea，black tea and pu-erh tea on the activity of SOD in the liver of rats

圖3 各茶粉對小鼠血清及肝組織中谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響Fig.3 Effect of green tea，black tea and pu-erh tea on the activity of GSH-PX in the serum and liver of rats

3 討論

不同的發(fā)酵程度影響了綠茶、紅茶與普洱茶的多酚組成與含量差異。綠茶殺青加工過程中，利用高溫鈍化酶的活性，在短時間內(nèi)制止由酶引起的一系列氧化反應(yīng)，因此綠茶中多酚類物質(zhì)主要是未經(jīng)氧化的兒茶素類。紅茶與普洱茶均屬于“發(fā)酵茶”，二者的化學(xué)成分具有一定的相似之處，如具有相當(dāng)量的沒食子酸與未參加多酚氧化反應(yīng)的GC 等。但由于二者的發(fā)酵方式及條件不同，也存在諸多化學(xué)成分的差異[12]，紅茶的多酚類物質(zhì)還存在一些兒茶素類經(jīng)酶促氧化（PPO 與POD）或非酶促氧化形成的聚合物如TF 等[13]。普洱茶由于有微生物參與作用，在漫長的溫、濕環(huán)境下其多酚類的變化更為復(fù)雜，且具有一定量的黃酮化合物。在本次研究中，紅茶（水提物）有約1%茶黃素，可能是大部分茶黃素已進(jìn)一步氧化轉(zhuǎn)化為茶紅素或茶褐素等物質(zhì)。普洱茶中大多數(shù)兒茶素已被氧化，僅存在一定量的GC（約占水提物的5.4%），且高于綠茶與紅茶。盡管普洱茶中多酚的含量比綠茶類少，但用超濾分離法得到的普洱水提物經(jīng)分析后得出高分子量物質(zhì)（MW＞3000 Daltons）多于50%（w/w），且普洱茶中沒食子酸的含量高于綠茶[14]。已有研究報道從云南省普洱茶中分離得到11種化合物分別為GC、EC、C、楊梅素、沒食子酸、山奈酚、山奈酚-3-O-beta-D-葡萄糖甙、山奈酚-3-O-蘆丁糖甙、槲皮素、槲皮素-3-O-beta-D 葡萄糖甙以及2，5-二羥基苯甲酸，其中確定沒食子酸為普洱茶中的主要生物活性成分之一[15-16]。

研究表明茶葉中多酚類化合物清除自由基的能力遠(yuǎn)超過維生素C 和E 等抗氧化劑[17]。綠茶中的兒茶素具有較強(qiáng)的清除自由基和抗氧化活性[4-5]。紅茶在加工過程中由于酶促作用產(chǎn)生的茶黃素與茶紅素等也具有較強(qiáng)的抗氧化活性[18]。現(xiàn)有研究報道表明普洱茶提取物在Fenton 反應(yīng)體系中清除自由基作用，抑制巨噬細(xì)胞中脂多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生NO 的能力與螯合鐵離子作用均強(qiáng)于綠茶、紅茶、烏龍茶提取物[19]。此外筆者利用化學(xué)發(fā)光法和可見分光光度法比較了兩類發(fā)酵茶紅茶與普洱茶水提物在水相和油相中的抗氧化性，結(jié)果表明：普洱茶在水相中的抗氧化能力略低于紅茶；兩類茶水提物對某些油脂具有較好的抗氧化性[20]。本研究結(jié)果表明體外清除DPPH 自由基能力大小依次為綠茶＞紅茶＞普洱茶。由此可以看出，抗氧化劑在不同的體系中抗氧化性的強(qiáng)弱也不同，因此需采用不同的抗氧化作用機(jī)理的方法在不同的條件下測定，才能全面評價待測物的抗氧化活性。

SOD 與GSH-PX 是機(jī)體內(nèi)清除自由基的重要抗氧化酶，對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用[11]。本研究結(jié)果表明紅茶與綠茶均能有效提高SOD 活性，且紅茶略高于綠茶，表明了發(fā)酵茶中一些未鑒定的物質(zhì)可能具有綠茶主要活性分子EGCG 相當(dāng)或更強(qiáng)的功效。然而普洱茶對SOD 活性則起抑制作用，Kuo 等[21]也報道了類似的結(jié)果，表明了普洱茶中除了一些功效成分物質(zhì)外，一些具負(fù)面影響的物質(zhì)也需要受到關(guān)注。三種茶對GSH-PX 的活性均有促進(jìn)作用，且普洱茶對肝組織中的GSH-PX 活性促進(jìn)作用均強(qiáng)于綠茶與紅茶。MDA 是氧自由基攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸而形成的脂質(zhì)過氧化物，可反映出機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化和機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的損傷程度[11]。研究報道表明當(dāng)增至一定濃度時，普洱茶水提物抑制脂質(zhì)過氧化能力強(qiáng)于綠茶與紅茶[19，22]，這可能解釋了在本研究中與對照組相比普洱茶顯著降低了MDA 的含量，綠茶則無顯著性差異。普洱茶一些特殊保健功能可能與存在的特異多酚類物質(zhì)如兒茶素的寡聚體等密切相關(guān)。曾經(jīng)報道在普洱茶乙酸乙酯萃取層中分離出的E8 層在清除羥自由基、超氧陰離子的能力及其對H2O2誘導(dǎo)HPF-1 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用均強(qiáng)于EGCG，同時在E8 中未檢測到?jīng)]食子酸、兒茶素及茶黃素[23]。這也表明普洱茶發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一些未知的高分子量多酚類物質(zhì)如兒茶素衍生物或聚合物可能具有與EGCG 相當(dāng)甚至更強(qiáng)的抗氧化功效。因此，有必要從化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)及抗氧化機(jī)理等方面對這些物質(zhì)進(jìn)行研究，一方面可以豐富自由基生物醫(yī)學(xué)和茶葉化學(xué)的理論，為天然抗氧化劑、特種茶及茶多酚的后續(xù)研究與開發(fā)提供理論依據(jù)；另一方面可以利用這些活性物質(zhì)研制開發(fā)具有我國特色的天然藥物和功能食品，使傳統(tǒng)的茶葉生產(chǎn)向精深加工領(lǐng)域發(fā)展，為振興華茶和促進(jìn)國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展作出貢獻(xiàn)。

[1]Lin J K，Lin C L，Liang Y C，et al.Survey of catechins，gallic acid， and methylxanthines in green， oolong， pu-erh and black teas[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1998， 46（9）:3635-3642.

[2]東方，何普明，林智.普洱茶的抗氧化活性研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)， 2007， 28（5）:363-365.

[3]揭國良，何普明，丁仁鳳.普洱茶抗氧化特性的初步研究[J].茶葉， 2005， 31（3）:162-165.

[4]楊賢強(qiáng).茶多酚化學(xué)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2003.

[5]宛曉春，主編.茶葉生物化學(xué)（第三版）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003.

[6]周志宏，楊崇仁.云南普洱茶原料曬青毛茶的化學(xué)成分[J].云南植物研究， 2000， 22（3）:343-350.

[7]鐘蘿.茶葉品質(zhì)理化分析[M].上海:上?？萍汲霭嫔?，1989:258-261，303-304.

[8]Liang Y R，Lu J L，Zhang L Y.Comparative study of cream in infusions of black tea and green tea[Camellia sinensis （L.）O.Kuntze][J].International Journal of Food Science&Technology，2002， 37（6）:627-634.

[9]Tu Y Y，Xu X Q，Xia H L，et al.Optimization of theaflavin biosynthesis of tea polyphenols using an immobilized enzyme system and response surface methodology[J].Biotechnology Letters， 2005， 27（4）:269-274.

[10]Zhu Q Y，Robert M H，Jodi L E，et al.Antioxidative activities of oolong tea[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002， 50（23）:6929-6934.

[11]凌關(guān)庭.抗氧化食品與健康[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

[12]朱旗，Clifford M N，毛清黎，等.LC-MS 分析普洱茶與紅茶成分的比較研究[J].茶葉科學(xué)，2006，26（3）:191-194.

[13]邵宛芳，Clifford M N，Powell C.紅茶及普洱茶主要成份差異的初步研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1995，10（4）:285-292.

[14]Lu C H，Hwang L S.Safety，biological activity and the active components of Pu-er tea [C]//International Tea Symposium，2005:272-279.

[15]呂海鵬.普洱茶的化學(xué)成分分析及其抗氧化活性的研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2005.

[16]林智，呂海鵬，崔文銳，等.普洱茶的抗氧化酚類化學(xué)成分的研究[J].茶葉科學(xué)， 2006， 26（2）:112-116.

[17]Kaufmann J A，Bickford P C，Taglialatela G.Free radicaldependent changes in constitutive nuclear factor kappa B in the aged hippocampus J.Neuroreport， 2002， 13（15）:1917-1928.

[18]Luczaj W，Skrzydlewska E.Antioxidative properties of black tea J.Preventive Medicine， 2005， 40（6）:910-918.

[19]Duh P D，Yen G C，Yen W J，et al.Effects of Pu-erh tea on oxidative damage and nitric oxide scavenging[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2004， 52（26）:8169-8176.

[20]東方，揭國良，陳飛，等.普洱茶與紅茶抗氧化特性比較研究[J].茶葉， 2006， 32（4）:202-205.

[21]Kuo K L， Weng M S， Chiang C T， et al.Comparative studies on the hypolipidemic and growth suppressive effects of oolong，black， pu-erh， and green tea leaves in rats[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2005， 53（2）:480-489.

[22]Lin Y S， Tsai Y J， Tsay J S， et al.Factors affecting the levels of tea polyphenols and caffeine in tea leaves[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2003， 51（7）:1864-1873.

[23]Jie G L， Lin Z， Zhang L Z， et al.Free radical scavenging effect of pu-erh tea extracts and their protective effect on oxidative damage in human fibroblastcells[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2006， 54（21）:8058-8064.