芍藥種子萌發(fā)抑制物的生物測(cè)定及分析鑒定

張少?gòu)?qiáng)

（本溪縣林業(yè)局，遼寧 本溪 117100）

芍藥種子萌發(fā)抑制物的生物測(cè)定及分析鑒定

張少?gòu)?qiáng)

（本溪縣林業(yè)局，遼寧 本溪 117100）

本文通過(guò)生物測(cè)定、系統(tǒng)分離及GC-MS鑒定的方法對(duì)芍藥種子中的萌發(fā)抑制物進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，芍藥種子中存在萌發(fā)抑制物；芍藥種子系統(tǒng)分離相的抑制作用從強(qiáng)到弱依次為C相＞B相＞D相＞A相，B、C、D各相對(duì)種子的萌發(fā)率和胚根生長(zhǎng)均有顯著影響；芍藥種子系統(tǒng)分離相的B相中所含有的抑制物質(zhì)為2，4-二叔丁基苯酚和乙烯，C相中所含有的抑制物質(zhì)為2，4-二叔丁基苯酚、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯和鄰苯二甲酸二丙酯，D相中所含有的抑制物質(zhì)為2，4-二叔丁基苯酚。

芍藥；種子；萌發(fā)；抑制物

芍藥（Paeonia lactiflora）為芍藥科芍藥屬多年生草本植物。芍藥在長(zhǎng)期的系統(tǒng)演化過(guò)程中形成了獨(dú)特的上下胚軸雙重休眠特性[1]，自然條件下從播種到出苗需要6～7個(gè)月的時(shí)間[2]，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，給芍藥的人工栽培和種子檢驗(yàn)帶來(lái)很大的困難。

萌發(fā)抑制物是導(dǎo)致芍藥種子休眠的一個(gè)重要因素。目前，關(guān)于種子中萌發(fā)抑制物質(zhì)的研究已有相當(dāng)多的報(bào)道，但多數(shù)研究只停留在對(duì)抑制物的初步提取與分離水平上，達(dá)到鑒定水平的較少，芍藥屬植物種子內(nèi)源抑制物的研究也處于初級(jí)階段。關(guān)雪蓮等[3]在對(duì)新疆塊根芍藥種子萌發(fā)特性進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)芍藥種皮和種胚浸提液對(duì)白菜種子萌發(fā)和幼苗建成都有影響，這可能是種皮和種胚都含有萌發(fā)抑制物質(zhì)所致。張榮榮等[4]在對(duì)芍藥內(nèi)源抑制物質(zhì)活性的研究中發(fā)現(xiàn)，去胚乳的胚在10 d左右就能長(zhǎng)出胚根，當(dāng)胚根休眠打破后，子葉或胚中抑制胚芽萌動(dòng)的激素占主導(dǎo)，各部位抑制作用大小為：胚乳＞胚（子葉）＞種皮。本試驗(yàn)對(duì)芍藥種子中萌發(fā)抑制物的生物測(cè)定、系統(tǒng)分離及分析鑒定進(jìn)行了研究，旨在為探討芍藥種子休眠原因，揭示芍藥種子休眠機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所需的芍藥種子于2010年9月購(gòu)自甘肅牡丹園藝公司，種子凈度為95.3%，千粒重為150.86 g，含水量為36.03%。生物活性測(cè)定所用白菜種子，純度為92%，凈度為95%，發(fā)芽率為80%以上。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 芍藥種子萌發(fā)抑制物的生物測(cè)定

取芍藥種子6 g，用預(yù)冷的80%甲醇冰浴研磨，4℃浸提48 h，抽濾，重復(fù)兩次，合并濾液，35℃減壓蒸干，加入6 mL甲醇，分別配置成濃度為0.2 g/mL、0.4 g/mL、0.6 g/mL、0.8 g/mL、1.0 g/mL的浸提液。

分別取上述不同濃度的浸提液2 mL置于直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中（對(duì)照以相同體積的蒸餾水代替），放置100粒白菜種子，白菜種子用前在35℃溫水中浸泡15 min，每處理3次重復(fù)，放于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后統(tǒng)計(jì)白菜種子的發(fā)芽率，72 h后測(cè)量胚根長(zhǎng)。所得數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 芍藥種子萌發(fā)抑制物的分離及生物測(cè)定

取芍藥種子4 g，用預(yù)冷的80%甲醇冰浴研磨，4℃浸提48 h，抽濾，重復(fù)兩次，合并濾液，35℃減壓蒸干，然后加入4 mL的甲醇（濃度為1 g/mL），采用系統(tǒng)分離的方法分離提取萌發(fā)抑制物，見(jiàn)圖1。

將A相、B相、C相、D相提取液在35℃條件下減壓蒸干，然后定容至4 mL，分別取2 mL置于直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中（對(duì)照以同體積的蒸餾水代替），待乙醚揮發(fā)至干后，每個(gè)培養(yǎng)皿加入2 mL蒸餾水，進(jìn)行白菜種子萌發(fā)試驗(yàn)，方法同1.2.1。

1.2.3 芍藥種子萌發(fā)抑制物的分析鑒定

取6 g芍藥種子，用預(yù)冷的80%甲醇冰浴研磨，4℃浸提48 h，抽濾，重復(fù)兩次，合并濾液，35℃減壓濃縮蒸干，然后加入6 mL甲醇定容，按照1.2.2的系統(tǒng)分離方法分離得到A相、B相、C相、D相萃取液。取B相、C相、D相萃取液于沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測(cè)試中心進(jìn)行GC-MS鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 芍藥種子萌發(fā)抑制物的活性分析

芍藥種子甲醇浸提液對(duì)白菜種子萌發(fā)率和胚根生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表1。

表1 芍藥種子甲醇浸提液對(duì)白菜種子萌發(fā)的影響

由表1可知，浸提液濃度為0.2 g/mL時(shí)，白菜種子的萌發(fā)率為92.00%，與對(duì)照90.00%接近；浸提液濃度為0.4 g/mL、0.6 g/mL時(shí)，白菜種子的萌發(fā)率略有減小；浸提液濃度增加到0.8 g/mL時(shí)，白菜種子的萌發(fā)率明顯降低，為64.00%；浸提液濃度為1.0 g/mL時(shí)，白菜種子萌發(fā)率為66.00%，雖略有上升但變化不大。5種濃度浸提液對(duì)白菜種子胚根生長(zhǎng)的影響均較大，胚根長(zhǎng)度與對(duì)照相比較短，并隨著浸提液濃度的增大逐漸變短，分別為2.18 cm、1.15 cm、1.17 cm、0.92 cm、0.88 cm。

方差分析結(jié)果表明，濃度為0.2 g/mL的浸提液對(duì)白菜種子萌發(fā)率的影響與對(duì)照相比無(wú)顯著差異；濃度為0.4 g/mL和0.6 g/mL的浸提液對(duì)白菜種子萌發(fā)率的影響與對(duì)照相比差異顯著，但兩者相比沒(méi)有顯著差異；濃度為0.8 g/mL和1.0 g/mL的浸提液對(duì)萌發(fā)率的影響與對(duì)照、0.4 g/mL和0.6 g/mL的浸提液相比都有顯著差異，但兩者之間差異不顯著。濃度為0.2 g/mL的浸提液對(duì)白菜種子胚根長(zhǎng)的影響與對(duì)照相比差異顯著；濃度為0.4 g/mL、0.6 g/mL、0.8 g/mL、1.0 g/mL的浸提液對(duì)白菜種子胚根長(zhǎng)的影響與對(duì)照和0.2 g/mL的浸提液相比均有顯著差異，但四者相比差異不顯著?？梢?jiàn)，芍藥種子的甲醇浸提液中存在萌發(fā)抑制物質(zhì)，且隨著浸提液濃度的增大，抑制作用逐漸增強(qiáng)。

2.2 芍藥種子萌發(fā)抑制物的分離及生物測(cè)定結(jié)果

對(duì)芍藥種子的甲醇浸提液進(jìn)行系統(tǒng)分離得到4種分離相，各相對(duì)白菜種子的發(fā)芽率和胚根生長(zhǎng)影響見(jiàn)表2。

表2 芍藥種子提取液各分離相對(duì)白菜種子萌發(fā)的影響

由表2可知，白菜種子在A相萃取液培養(yǎng)條件下發(fā)芽率與對(duì)照接近，而B(niǎo)相、C相、D相萃取液培養(yǎng)條件下白菜種子發(fā)芽率均明顯小于對(duì)照。A相、B相、C相、D相對(duì)于白菜種子胚根生長(zhǎng)的影響也呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)，其中，以A相萃取液培養(yǎng)條件下胚根生長(zhǎng)最長(zhǎng)，B相、D相次之，C相最短。

方差分析結(jié)果表明：就萌發(fā)率而言，A相萃取液對(duì)白菜種子的萌發(fā)率影響不大，與對(duì)照相比沒(méi)有顯著差異；B相、D相萃取液對(duì)白菜種子萌發(fā)率有一定影響，與A相萃取液和對(duì)照相比有顯著差異，但B相、D相萃取液之間差異不顯著；C相萃取液對(duì)萌發(fā)率的影響結(jié)果與B相、D相萃取液相比有顯著差異。因此，對(duì)白菜種子萌發(fā)率抑制作用從強(qiáng)到弱依次為C相、B相、D相、A相萃取液和對(duì)照。而對(duì)于胚根長(zhǎng)而言，所表現(xiàn)的差異水平一致，即A相、B相、C相、D相萃取液對(duì)白菜種子胚根長(zhǎng)的影響與對(duì)照相比均有顯著差異，并且D相與A相、B相與D相、C相與B相，兩兩之間的差異也達(dá)到顯著水平。因此，對(duì)白菜種子胚根長(zhǎng)的抑制作用從強(qiáng)到弱依次為C相萃取液、B相萃取液、D相萃取液、A相萃取液、對(duì)照。

2.3 芍藥種子萌發(fā)抑制物的分析鑒定結(jié)果

鑒于B相、D相、C相萃取液對(duì)白菜種子生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制活性，對(duì)芍藥種子的B相、C相、D相萃取液中含有的萌發(fā)抑制物質(zhì)用GC-MS分析鑒定。

2.3.1 B相萃取液的鑒定結(jié)果

采用GC-MS分析法鑒定了B相萃取液的濃縮樣品，得到離子流程圖（圖2），共有100個(gè)峰，對(duì)離子流程圖中峰面積和Qual值較大的化合物進(jìn)行鑒定，共鑒定出26種，分別是：環(huán)己基二甲氧基甲基硅烷、十二烷、正十三烷、十四烷、十五烷、十六烷、十七烷、十八烷、二十烷、正二十一烷、二十二烷、正二十五烷、正二十七烷、四十三烷、5-乙基-2-甲基辛烷、2，4-二甲基十一烷、4，6-二甲基十二烷、2，6，11-三甲基十二烷、4-乙基十四烷、3-甲基十五烷、3-甲基十六烷、2，6，10，14-四甲基十六烷、8-甲基十七烷、2-甲基十八烷、2，4-二叔丁基苯酚、乙烯。

2.3.2 C相萃取液的鑒定結(jié)果

采用GC-MS分析法鑒定了C相萃取液的濃縮樣品，得到離子流程圖（圖3），共有100個(gè)峰，鑒定出化合物25種，分別是：環(huán)己基二甲氧基甲基硅烷、十二烷、十五烷、十六烷、正十九烷、二十烷、二十二烷、正二十一烷、二十四烷、正二十五烷、正二十七烷、正二十八烷、正三十烷、四十四烷、3-甲基癸烷、3，7-二甲基癸烷、2，4-二甲基十一烷、

2，6，10，14-四甲基十五烷、3-甲基十六烷、

2，6，10，14-四甲基十六烷、9-辛基十七烷、2，4-二叔丁基苯酚、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丙酯。

2.3.3 D相萃取液的鑒定結(jié)果

采用GC-MS分析法鑒定了D相萃取液的濃縮樣品，得到離子流程圖（圖4），共有70個(gè)峰，鑒定出化合物22種，分別是：環(huán)己基二甲氧基甲基硅烷、十四烷、十五烷、十六烷、十七烷、二十烷、正二十一烷、二十二烷、正二十五烷、正二十六烷、正三十烷、正三十六烷、3，7-二甲基癸烷、2，9-二甲基十一烷、3-甲基十二烷、2，6，10，14-四甲基十五烷、8-甲基十七烷、9-辛基十七烷、2，6，11-三甲基十二烷、2，6，10，14-四甲基十六烷、碘代十八烷、2，4-二特丁基苯酚。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)甲醇浸提液對(duì)白菜種子萌發(fā)情況的影響得出，芍藥種子中存在萌發(fā)抑制物，且抑制物的濃度越大，其抑制作用越強(qiáng)。參照南方紅豆杉種子浸提液的分離方法[5]，對(duì)芍藥種子浸提液進(jìn)行系統(tǒng)分離，得到A相、B相、C相、D相。這4種分離相對(duì)白菜種子的萌發(fā)和胚根生長(zhǎng)均有抑制作用。其中，A相萃取液的抑制作用最弱，在對(duì)芍藥種子浸提液的分離相進(jìn)行分析鑒定時(shí)，只對(duì)B相、C相、D相進(jìn)行了分析鑒定。

對(duì)芍藥種子系統(tǒng)分離相中所含有的萌發(fā)抑制物質(zhì)進(jìn)行GC-MS鑒定，B相中鑒定出26種化合物，C相中鑒定出25種化合物，D相中鑒定出22種化合物。目前，已知的天然的發(fā)芽抑制物大體可以分為幾類(lèi)，大多數(shù)是一些簡(jiǎn)單的低分子量有機(jī)化合物，其中最簡(jiǎn)單的且具揮發(fā)性的有HCN、NH3及乙烯；此外，還有醛類(lèi)化合物、酚類(lèi)化合物、酯類(lèi)化合物、生物堿類(lèi)。除此之外，還有阿魏酸、肉桂酸、咖啡酸和脫落酸等。因此，推測(cè)B相萃取液的濃縮樣品含有的萌發(fā)抑制物為2，4-二叔丁基苯酚和乙烯；C相萃取液含有的萌發(fā)抑制物為2，4-二特丁基苯酚、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丙酯；D相萃取液含有的萌發(fā)抑制物質(zhì)為2，4-二叔丁基苯酚。

本試驗(yàn)在B相、C相、D相中雖然發(fā)現(xiàn)了萌發(fā)抑制物質(zhì)，但是這些抑制物質(zhì)究竟存在于種子中的哪個(gè)部位及具體含量是多少，還有待于進(jìn)一步研究。

[1]李嘉玨.中國(guó)牡丹與芍藥[M].北京:中國(guó)林業(yè)出版社，1999.

[2]楊洋.芍藥種子萌發(fā)的生物學(xué)特性及破眠技術(shù)的研究[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)，2009.

[3]關(guān)雪蓮，周桂玲，盛方.新疆塊根芍藥種子萌發(fā)特性研究[J].種子，2009，28（5）:97-99.

[4]張榮榮，王康才.芍藥種子內(nèi)源抑制物質(zhì)活性的研究[J].中草藥，2008，39（12）:1880-1883.

[5]于海蓮.南方紅豆杉種子休眠機(jī)理及催芽技術(shù)的研究[D].北京:北京林業(yè)大學(xué)，2009.

Bioassay and Analytical Appraisal of the Seed Germination Inhibitors of Paeonia lactiflora

ZHANG Shaoqiang
(Forestry Bureau of Benxi County,Benxi 117100,Liaoning,China)

In this paper the seed germination inhibitors of Paeonia lactiflora were studied by the means of bioassay, systematic separation and GC-MS appraisal.The results showed that there were germination inhibitors existing in Paeonia lactiflora seeds and the sequence of the inhibiting effects of the seed systematic separation phases was C＞B＞D＞A,and the phases of B,C and D have significant effects on their seed germination rates and radicle growth;the inhibitors in the seed systematic separation phase B were 2,4-Ditertbutyl hydroquinone and ethylene，the inhibitors in phase C were 2,4-Ditertbutyl hydroquinone,Dibutyl phthalate,diisobutyl phthalate and Di-propyl ortho-phthalate and the inhibitor in phase D was 2,4-Ditertbutyl hydroquinone.

Paeonia lactiflora;Seeds;Germination;Inhibitors

S682.19

A

2095-0152（2015）03-0017-04

2015-04-01

2015-05-08

張少?gòu)?qiáng)（1969- ），男，高級(jí)工程師，研究方向：森林經(jīng)營(yíng)。E-mail：bxxcyb@163.com

楊婷婷）