1株溶磷細(xì)菌P0417的溶磷機(jī)制

管?chē)?guó)強(qiáng)　李倩　季蓉蓉　陳菊　錢(qián)靜亞　黃達(dá)明

摘要：以Ca3（PO4）2為磷源，研究溶磷細(xì)菌伯克霍爾德氏菌P0417產(chǎn)生的有機(jī)酸和磷酸酶對(duì)其溶磷效果的影響，探討溶磷細(xì)菌P0417的溶磷機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溶磷細(xì)菌P0417液體搖瓶培養(yǎng)5 d后，溶磷量達(dá)503.53 μg/mL；溶磷細(xì)菌P0417產(chǎn)生的有機(jī)酸包括草酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、丙酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸，濃度總量達(dá)420.59 mg/L；有機(jī)酸的溶磷量為493.89 μg/mL，磷酸酶粗酶液的溶磷量為18.37 μg/mL。結(jié)果表明，溶磷細(xì)菌P0417的溶磷機(jī)制主要是通過(guò)分泌有機(jī)酸進(jìn)行溶磷的。

關(guān)鍵詞：溶磷細(xì)菌；機(jī)制；有機(jī)酸；磷酸酶

中圖分類(lèi)號(hào)： Q935 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0432-03

磷在農(nóng)業(yè)中起重要的作用，但也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的限制因素之一。磷在土壤中的存在形式主要以難溶性磷酸鹽為主，不易被作物吸收，因此無(wú)法滿(mǎn)足一般作物的生長(zhǎng)需求。在堿性土壤中，難溶性磷鹽主要為Ca3（PO4）2，酸性土壤中主要的磷鹽為FePO4、AlPO4[1-2]。土壤中的一些微生物具有溶解難溶性磷酸鹽的活性，主要包括細(xì)菌、真菌、放線菌等[3]。不同的微生物溶磷能力有較大的差異，其溶磷量在1421～643.2 μg/mL之間[4-6]。土壤溶磷微生物不僅可以提高植物對(duì)磷的利用效率，改善植物營(yíng)養(yǎng)條件，增加抗病能力[7]；而且還可以改善土壤結(jié)構(gòu)，提高有機(jī)質(zhì)含量，改良鹽堿地，對(duì)培育和充分發(fā)揮土壤生態(tài)肥力、保持農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的平衡等均具有極其重要的作用[8]。

有關(guān)溶磷微生物的研究和應(yīng)用已有多年，但其溶磷機(jī)理還不十分清楚，從而極大地限制了溶磷微生物的生產(chǎn)應(yīng)用[9]。筆者所在的課題組前期已經(jīng)從桂花樹(shù)根際土壤中篩選出1株具有溶磷功能的細(xì)菌，經(jīng)鑒定為德克霍爾德氏菌P0417，本研究從該溶磷菌對(duì)Ca3（PO4）2的溶磷作用出發(fā)，探討溶磷菌產(chǎn)生的有機(jī)酸和磷酸酶對(duì)溶磷量的影響，完善溶磷菌的溶磷機(jī)理，為提高溶磷菌對(duì)難溶性磷的利用效率、開(kāi)發(fā)溶磷微生物肥料等提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

菌株P(guān)0417由筆者所在的實(shí)驗(yàn)室自行篩選，鑒定為德克霍爾德氏菌。

1.2 培養(yǎng)基

PKO培養(yǎng)基：10 g Ca3（PO4）2，10 g葡萄糖，0.3 g MgSO4·7H2O，0.3 g NaCl，0.3 g KCl，0.03 g FeSO4·7H2O，0.03 g MnSO4·4H2O，0.5 g （NH4）2SO4，pH值7.0～7.2，1 000 mL水。Ca3（PO4）2單獨(dú)滅菌后加入。

1.3 主要試劑及配制方法

供液相分析用有關(guān)試劑均為分析純，流動(dòng)相水為娃哈哈純凈水。

供液相分析用標(biāo)準(zhǔn)樣品的配制：0.01 mg/mL酒石酸，0.1 mg/mL 草酸，0.005 mg/mL蘋(píng)果酸，0.02 mg/mL檸檬酸，0.000 5 mg/mL乙酸，0.01 mg/mL丙酸，0.002 5 mg/mL琥珀酸。

改進(jìn)的通用緩沖試劑（MUB）儲(chǔ)備液的配制：12.1 g三羥甲基氨基甲烷（Tris），11.6 g順丁烯二酸，7 g檸檬酸和6.3 g硼酸于488 mL 1 mol/L NaOH溶液中，用水稀釋至1 L，儲(chǔ)存于冰箱中。

改進(jìn)的通用緩沖試劑（MUB）的配制：取200 mL MUB儲(chǔ)存液于500 mL燒杯中，用0.1 mol/L HCl滴定到溶液中使pH值為6.5，再用水定容至1 L。用0.1 mol/L NaOH滴定另一份200 mL MUB儲(chǔ)備液使其pH值為11，然后用水定容至1 L。

0.025 mol/L對(duì)硝基苯磷酸二鈉溶液的配制：溶解 0.630 g 對(duì)硝基苯磷酸二鈉于40 mL改進(jìn)的通用緩沖液中，緩沖液pH值為6.5時(shí)用于檢測(cè)酸性磷酸酶，pH值為11時(shí)用于檢測(cè)堿性磷酸酶，用相同pH值的MUB儲(chǔ)備液將溶液稀釋到50 mL，放置冰箱中，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 有機(jī)酸的測(cè)定

液相色譜分離條件：色譜柱為Hypersil C18（250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相為0.02 mol/L KH2PO4緩沖溶液—甲醇溶液（98% ∶ 1%），用1 mol/L磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.6，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；進(jìn)樣量10 μL，流速0.5 mL/min，柱溫為室溫。

1.4.1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的定性定量測(cè)定 將7種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品按上述色譜分離條件在高效液相色譜上樣，分別得出其出峰時(shí)間。并將不同濃度的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，以有機(jī)酸濃度作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)其定量分析。

1.4.2 發(fā)酵液中有機(jī)酸的定性定量測(cè)定 將菌株用LB液體培養(yǎng)基制成菌懸液（濃度約為10 億個(gè)/mL，即波長(zhǎng)600 nm，D值1.0），按菌懸液與PKO液體培養(yǎng)基比例為 1 ∶ 100 接種，即每100 mL培養(yǎng)基接菌懸液1 mL，以不接菌空白PKO液體培養(yǎng)基為對(duì)照，在28 ℃、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)120 h。取發(fā)酵液2 mL，10 000 r/min離心，再經(jīng)0.22 μm濾膜真空抽濾后上液相色譜，將其圖譜與標(biāo)準(zhǔn)樣品圖譜進(jìn)行比對(duì)。

1.4.3 有機(jī)酸對(duì)磷酸鈣的溶解作用 人工模擬配制菌株P(guān)0417發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸，即向與發(fā)酵液相同濃度的有機(jī)酸混合溶液加入與培養(yǎng)基同質(zhì)量的Ca3（PO4）2于三角瓶中，與接菌的培養(yǎng)基在相同條件下培養(yǎng)120 h，做3組平行試驗(yàn)，以不加有機(jī)酸溶液為空白對(duì)照組，測(cè)定溶磷量[10-11]。

1.5 磷酸酶活性測(cè)定

1.5.1 發(fā)酵液中磷酸酶活性的測(cè)定[12] 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取6支試管，依次吸取l g/L標(biāo)準(zhǔn)對(duì)硝基酚溶液0、1、2、3、4、5 mL 分別裝于試管中，用無(wú)菌水定容至5 mL，在每個(gè)試管中再加入1 mL 0.5 mol/L氯化鈣和4 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉，振蕩后過(guò)濾，測(cè)定420 nm條件下濾液吸光度。以1 h 1 L發(fā)酵液中作用于底物并釋放出產(chǎn)物的微摩爾數(shù)稱(chēng)為1個(gè)酶活力單位，記為μmol/（L·h）。endprint

吸取1 mL發(fā)酵液，加入4 mL pH值為6.5的MUB，再加l mL 0.025 mol/L對(duì)硝基苯磷酸二鈉溶液，振蕩幾秒鐘。塞住瓶塞，37 ℃條件下培養(yǎng)l h后，加入1 mL 0.5 mol/L氯化鈣和4 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉，振蕩后用折疊濾紙過(guò)濾懸液。將澄清濾液在420 nm比色。此為酸性磷酸酶活性測(cè)定方法，堿性磷酸酶時(shí)所用MUB試劑pH值為11。

1.5.2 發(fā)酵液中磷酸酶對(duì)磷酸鈣的溶解作用

1.5.2.1 磷酸酶粗酶液的制備及分離純化 按“1.4.2”節(jié)的方法接菌振蕩培養(yǎng)72 h，并參照黃毅等的方法[13-14]略加修改，取發(fā)酵液過(guò)濾后濾液在4 ℃、12 000 r/min條件下離心20 min，收集上清液；向其中加入硫酸銨至40%飽和度，4 ℃靜置3 h后，4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min，收集上清液；再向其加入硫酸銨至70%飽和度，4 ℃條件下鹽析3 h后，在4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min，收集沉淀；沉淀用含0.5 mol/L NaCl的0.02 mol/L Tris-Hcl 緩沖液（pH值為8.6）溶解后超濾，慮管通過(guò)離心力使有機(jī)酸等小分子通過(guò)，大分子蛋白截留得到粗酶液。

1.5.2.2 粗酶液對(duì)磷酸鈣的溶解作用 加入1%磷酸鈣到粗酶液中，測(cè)定溶磷量。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷細(xì)菌分泌產(chǎn)生的有機(jī)酸的種類(lèi)及其溶磷效果

2.1.1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖 7種有機(jī)酸的出峰時(shí)間分別是草酸5.201 min，酒石酸6.420 min，蘋(píng)果酸8510 min，丙酸10.486 min，乙酸11.301 min，檸檬酸 15.250 min，琥珀酸18.445 min（圖1）。

2.1.2 發(fā)酵液中有機(jī)酸的色譜圖 與標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖的出峰時(shí)間進(jìn)行比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)不接菌空白樣品的色譜圖中只有草酸、酒石酸、蘋(píng)果酸和乙酸存在，且含量較少，未見(jiàn)丙酸、檸檬酸和琥珀酸。而接菌的樣品發(fā)酵液色譜圖中7種有機(jī)酸均存在，而且草酸的含量明顯增高（圖2、圖3）。

2.1.3 菌株產(chǎn)有機(jī)酸的質(zhì)量濃度 分別將不同濃度的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，以有機(jī)酸濃度作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（表1），通過(guò)比對(duì)相應(yīng)有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線得到該樣品產(chǎn)有機(jī)酸的濃度（表2）。

菌株P(guān)0417的發(fā)酵液中，不僅有機(jī)酸的種類(lèi)增多，而且含量也增加。發(fā)酵液中有機(jī)酸的濃度最終可達(dá)420.59 mg/L，約是空白對(duì)照組的10倍，其中草酸和琥珀酸的增加量最多（表2）。

2.1.4 有機(jī)酸對(duì)磷酸鈣的溶解作用 在不接溶磷菌條件下，向培養(yǎng)基中加入同種濃度的7種有機(jī)酸混合液，得出7種有機(jī)酸混合液的溶磷量是493.89 μg/mL，而溶磷菌P0417的溶磷量為503.53 μg/mL（表3），說(shuō)明溶磷菌的溶磷作用可能存在多種機(jī)制，而有機(jī)酸的螯合作用是溶磷菌P0417溶磷的主要途徑。

2.2 溶磷細(xì)菌分泌產(chǎn)生的磷酸酶活性及其溶磷效果

2.2.1 發(fā)酵液中磷酸酶活性的測(cè)定 在相同條件下同時(shí)測(cè)定120 h內(nèi)發(fā)酵液中酸性磷酸酶活力的變化和堿性磷酸酶活力的變化，發(fā)現(xiàn)酸性磷酸酶活力隨時(shí)間變化而不斷變化，且在72 h時(shí)達(dá)到最高，達(dá)2 186 μmol/（L·h），堿性磷酸酶活性也隨時(shí)間變化，且在72 h時(shí)達(dá)到最高，為2 571 μmol/（L·h） 。此外，在以磷酸鈣為單一磷源的培養(yǎng)基中，堿性磷酸酶的活力明顯高于酸性磷酸酶的活力（圖4）。

2.2.2 發(fā)酵液中磷酸酶對(duì)磷酸鈣的溶解作用 提取溶磷細(xì)菌P0417代謝產(chǎn)生的磷酸酶粗酶液，加入一定量磷酸鈣反應(yīng)后測(cè)其溶磷量為18.37 μg/mL。說(shuō)明磷酸酶也會(huì)產(chǎn)生一定的溶磷效果，但這種作用不是溶磷菌產(chǎn)生溶磷作用的主要原因。

3 結(jié)論與討論

20世紀(jì)初，人們就開(kāi)始研究土壤微生物與磷轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系，利用土壤溶磷菌降解土壤中豐富的難溶性磷源具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，有關(guān)溶磷的研究多集中在菌株篩選及應(yīng)用效果等方面，有關(guān)溶磷機(jī)制的研究仍比較薄弱，樊磊等認(rèn)為微生物對(duì)土壤溶磷的機(jī)理涉及有機(jī)酸、質(zhì)子和酶解等作用[15]。關(guān)于有機(jī)酸溶磷的觀點(diǎn)認(rèn)為，在微生物代謝過(guò)程中分泌的各種小分子量有機(jī)酸能與復(fù)合磷酸鹽中的鈣、鐵和鋁螯合釋放出磷酸根形成穩(wěn)定的可溶性復(fù)合物而被植物體吸收利用[16]。關(guān)于質(zhì)子溶磷的觀點(diǎn)認(rèn)為，微生物在代謝活動(dòng)中產(chǎn)生大量的質(zhì)子可以與磷酸鹽發(fā)生交換，使酸度提高，從而使磷礦粉溶解[17]。關(guān)于磷酸酶溶磷的觀點(diǎn)是指，溶磷微生物分泌的磷酸酶能夠溶解無(wú)機(jī)難溶磷[18]。也有研究報(bào)道有的菌株同時(shí)存在這幾種溶磷機(jī)制[19]。Narsian等認(rèn)為溶磷的最主要原因是溶磷微生物能夠產(chǎn)生大量的有機(jī)酸及磷酸酶等[20]。

本試驗(yàn)對(duì)溶磷微生物分泌的有機(jī)酸及產(chǎn)生的磷酸酶進(jìn)行了研究。通過(guò)液相色譜對(duì)發(fā)酵液分析后得出該微生物產(chǎn)生了草酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、丙酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸等多種有機(jī)酸，總濃度達(dá)420.59 mg/L，其中草酸和琥珀酸的分泌量最多。有機(jī)酸對(duì)Ca3（PO4）2的溶解量為493.89 μg/mL，而溶磷菌的溶磷量為503.53 μg/mL，說(shuō)明該微生物的溶磷作用主要來(lái)源于有機(jī)酸的分泌，這與Agnihotri的研究結(jié)果[21]基本一致。這些酸一方面使培養(yǎng)液的pH值下降，另一方面還與Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Al3+等離子以多種形式結(jié)合，使難溶性磷釋放出來(lái)[22]。溶磷過(guò)程中磷酸酶的活力隨時(shí)間的變化先增強(qiáng)后減弱又增強(qiáng)，說(shuō)明磷酸酶活力與溶磷量無(wú)關(guān)，Patgiri等的研究結(jié)果也表明高效溶磷菌株的溶磷量與磷酸酶的活力無(wú)關(guān)，而與蛋白質(zhì)的分泌量有關(guān)[23]。提取發(fā)酵粗酶液進(jìn)行溶磷效果分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，微生物分泌的磷酸酶也具有一定的溶磷效果，但溶磷量只有18.37 μg/mL。因此，在溶磷菌的溶磷作用中，溶磷菌分泌的有機(jī)酸主要起溶磷作用。endprint

在細(xì)菌P0417代謝過(guò)程中，草酸和琥珀酸的濃度相對(duì)較高，但菌體溶磷作用是否與這2種酸的產(chǎn)生有關(guān)需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。Deubel等指出，溶磷細(xì)菌分泌的有機(jī)酸種類(lèi)和數(shù)量并不是一成不變的，隨著外界碳源的改變，培養(yǎng)液中有機(jī)酸種類(lèi)和含量都會(huì)發(fā)生變化[24]，今后有必要在這方面開(kāi)展深入研究。

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