1株斜生柵藻擴大培養(yǎng)條件的優(yōu)化

季祥　成杰　廖利民　鞏東輝　蔡祿　齊云　陳冠益

摘要：為了促進微藻快速生長、提高微藻生物量，在試驗室條件下對1株含油量相對較高、長勢較好的斜生柵藻進行10 L擴大培養(yǎng)，并通過單因素和正交試驗對4種主要營養(yǎng)鹽進行優(yōu)化。結(jié)果表明，在擴大培養(yǎng)的10 L反應器中，斜生柵藻的最適生長條件為：NaNO3 1.0 g/L、K2HPO4·3H2O 0.10 g/L、MgSO4·7H2O 0.100 g/L、FeCl3·6H2O 0.008 g/L，斜生柵藻在該優(yōu)化后的10 L培養(yǎng)基中生長情況良好，且最大生物量（D680 nm）可達1.91，分別是10 L-BG11、250 mL-BG11條件下的1.20、1.28倍。

關(guān)鍵詞：斜生柵藻；擴大培養(yǎng)；生物量；生長條件；優(yōu)化

中圖分類號： Q968.4 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0303-03

隨著人類社會資源的短缺和環(huán)境問題的日益突出，世界各國正面臨著能源匱乏和生態(tài)環(huán)境破壞的危機，因此尋求一種新型的可再生能源成為世界各國科學家普遍關(guān)注的科學問題和發(fā)展趨勢[1]。生物柴油是清潔的、環(huán)境友好的可再生能源，但由于其原材料成本較高，目前生物柴油的價格仍高于傳統(tǒng)柴油。而在眾多的能源微生物中，微藻具有種類繁多、光合利用度高、自身合成油脂能力強等優(yōu)點[2]。利用藻類油脂生產(chǎn)生物柴油具有緩解溫室效應，不與人爭糧、不與糧爭地的眾多優(yōu)點，通過微藻油轉(zhuǎn)化生產(chǎn)生物柴油具有廣闊的開發(fā)利用前景。為了快速獲得較大的微藻生物量，對微藻的擴大培養(yǎng)顯得至關(guān)重要，而在不同反應器中，微藻對營養(yǎng)鹽的需求也不一樣。因此，筆者對試驗室的1株含油量較高的斜生柵藻進行了10 L擴大培養(yǎng)研究，對其生長條件進行了優(yōu)化，最大限度地提高該藻的生物量，為其工業(yè)化生產(chǎn)應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種來源

試驗藻種為斜生柵藻（Scenedesmus obliquus），保存于內(nèi)蒙古自治區(qū)生物質(zhì)能源化利用重點實驗室。

1.2 培養(yǎng)條件

試驗采用10 L廣口瓶為反應器，以前期工作[3]改進的BG11培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，裝液量為7 L，接種量5%，置于環(huán)境溫度（25±1） ℃、光照強度5 000 lx、光照周期14 L/10 d的條件下培養(yǎng)。

1.3 微藻生物量的測定

微藻生物量的測定采用濁度比色法[4]。本試驗采用752紫外可見分光光度計，在波長680 nm處測定培養(yǎng)液的吸光度（D680 nm），試驗結(jié)果數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17.0、Origin Pro 8.0和Microsoft Office Excell 2007軟件進行分析處理。

1.4 斜生柵藻生長條件的優(yōu)化

1.4.1 4種主要營養(yǎng)鹽單因子試驗 試驗對影響斜生柵藻生長最主要的N、P、Mg、Fe營養(yǎng)鹽進行研究，在接種前1 d分別換上不加N、P、Mg、Fe營養(yǎng)鹽的改進BG11培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后按0、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L的質(zhì)量濃度加入NaNO3，按0、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 g/L的質(zhì)量濃度加入K2HPO4·3H2O，按0、0.050、0.075、0.100、0.125 g/L的質(zhì)量濃度加入MgSO4·7H2O，按0、0.002、0.004、0.006、0.008、0.010 g/L的質(zhì)量濃度加入FeCl3·6H2O。每組均作3個平行試驗，待微藻處于穩(wěn)定生長期，取最大的D680 nm平均值，考察在不同濃度的N、P、Mg、Fe營養(yǎng)鹽條件下斜生柵藻的生長情況。

1.4.2 正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行正交試驗，按表1因素水平表中各水平分別加入NaNO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O和FeCl3·6H2O營養(yǎng)鹽，參照正交試驗法[5]選用L9（34）設(shè)計進行正交試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaNO3對斜生柵藻生長的影響

微藻在增殖過程中需要營養(yǎng)物質(zhì)，氮是微藻體內(nèi)許多重要有機化合物的組成成分之一，在許多方面影響植物的代謝過程和生長發(fā)育。其中，氮是微藻細胞蛋白質(zhì)葉綠素的組成成分，是組成核酸的重要元素之一，同時微藻體內(nèi)的各種生物酶也含有氮[6]。微藻在生長過程中通常能利用銨鹽、硝酸鹽及尿素作氮源，本試驗以NaNO3為氮源，在培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的NaNO3，考察不同質(zhì)量濃度的NaNO3在10 L培養(yǎng)體系中對斜生柵藻生長的影響，結(jié)果如圖1所示。

從整體上看，隨著NaNO3質(zhì)量濃度的不斷增加，斜生柵藻的生物量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。利用軟件分析可知，NaNO3質(zhì)量濃度與斜生柵藻生物量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），且各組間生物量差異顯著（P<0.05）。當NaNO3質(zhì)量濃度為0時，生物量最低；隨著NaNO3質(zhì)量濃度的增加，柵藻生物量逐漸上升，當質(zhì)量濃度為1.0 g/L時，斜生柵藻生物量在各組間最大，D680 nm為1.59，而持續(xù)增加NaNO3質(zhì)量濃度并不能促進微藻的生長，生物量開始逐漸降低，說明過高質(zhì)量濃度的NaNO3會抑制斜生柵藻的生長。由此得出，NaNO3最適質(zhì)量濃度為1.0 g/L（圖1）。

2.2 K2HPO4·3H2O對斜生柵藻生長的影響

磷是植物生長發(fā)育心需的營養(yǎng)元素之一，是微藻體內(nèi)許多有機化合物的組成成分，同時磷以多種方式參與微藻體內(nèi)的各種代謝過程，是生物體內(nèi)ATP、GTP、核酸、磷脂、輔酶等化合物合成的基本元素，在微藻生長發(fā)育中起重要的作用。本試驗以K2HPO4·3H2O為磷源，研究不同質(zhì)量濃度的K2HPO4·3H2O對斜生柵藻生長的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，K2HPO4·3H2O質(zhì)量濃度在0～0.14 g/L范圍內(nèi)均能促進斜生柵藻生長，且生物量與其呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。當K2HPO4·3H2O質(zhì)量濃度為0～0.10 g/L時，磷鹽對斜生柵藻生物量的促進作用明顯，同時在0.10 g/L時生物量達到最大；而當K2HPO4·3H2O質(zhì)量濃度大于0.10 g/L 時，該藻的生物量呈現(xiàn)下降趨勢，但隨著磷鹽質(zhì)量濃度緩慢增加，柵藻生長表現(xiàn)出一定的耐受性。因此，在10 L培養(yǎng)體系中，斜生柵藻的K2HPO4·3H2O最適質(zhì)量濃度為 0.10 g/L。endprint

2.3 MgSO4·7H2O對斜生柵藻的生長影響

鎂是葉綠素的組成成分，在葉綠素合成和光合作用中起重要作用[7]，鎂還參與生物體內(nèi)的氮代謝和活性氧代謝。在試驗中選取MgSO4·7H2O提供鎂元素，研究不同質(zhì)量濃度的Mg2+對斜生柵藻擴大培養(yǎng)時生長的影響，試驗結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，斜生柵藻在不同質(zhì)量濃度的MgSO4·7H2O條件下所達到的最大生物量有所差異。當培養(yǎng)液中不含鎂時，斜生柵藻生物量較低，當培養(yǎng)液中鎂元素存在時，可見其生物量迅速增加，由軟件分析可知，鎂質(zhì)量濃度與微藻生物量是顯著正相關(guān)的（P<0.01），同時含有Mg2+與缺鎂條件下的生物量差異顯著（P<0.05）。而當MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度達0.05 g/L后，生物量表現(xiàn)出一定程度的先下降后上升的趨勢，但趨勢較緩，增量不明顯，差異也不顯著（P>0.05）。這可能主要是由于培養(yǎng)液中持續(xù)鎂質(zhì)量濃度的增加，對微藻生長產(chǎn)生了一定的抑制作用，同時由于微藻機體自身的耐受能力，在微藻適應了較高質(zhì)量濃度下的Mg2+后，出現(xiàn)一定程度的生長現(xiàn)象，可以推測后續(xù)持續(xù)增加鎂質(zhì)量濃度會造成微藻生物量急劇降低。綜合以上分析結(jié)果可知，0.100 g/L為 MgSO4·7H2O 的最適質(zhì)量濃度。

2.4 FeCl3·6H2O對斜生柵藻生長的影響

鐵元素在微藻生理上有重要作用，是一些重要的氧化-還原酶催化部分的組分。鐵雖然不是葉綠素的組成成分，但缺鐵時，葉綠體的片層結(jié)構(gòu)發(fā)生很大變化，嚴重時甚至使葉綠體發(fā)生崩解。而且鐵在微藻體內(nèi)以各種形式與蛋白質(zhì)結(jié)合，作為重要的電子傳遞體或催化劑參與許多生命活動。本試驗以FeCl3·6H2O為鐵鹽，考察不同質(zhì)量濃度的Fe3+對斜生柵藻擴大培養(yǎng)時生長的影響，試驗結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，盡管培養(yǎng)液中對Fe3+含量要求較低，但對微藻生物量的影響很大。由軟件分析結(jié)果可知，F(xiàn)e3+與斜生柵藻生物量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。當培養(yǎng)液中缺鐵時，斜生柵藻生物量較低；FeCl3·6H2O的增加能夠迅速促進微藻生物量的積累，當FeCl3·6H2O質(zhì)量濃度達0.006 g/L時，生物量達到最高，D680 nm為1.59；而隨著質(zhì)量濃度的進一步增加，微藻生物量開始降低，表現(xiàn)出抑制作用。說明適宜的Fe3+質(zhì)量濃度能夠促進微藻細胞增殖，有利于生物量積累。因此，F(xiàn)eCl3·6H2O的最適質(zhì)量濃度為0.006 g/L。

2.5 4種營養(yǎng)鹽對斜生柵藻生長影響程度和優(yōu)化水平組合

在不同條件下，斜生柵藻對營養(yǎng)鹽的需求有很大的差異，為了研究斜生柵藻在擴大培養(yǎng)時的最佳培養(yǎng)基配比，采用正交設(shè)計對這4種營養(yǎng)鹽進行多因子組合試驗，按表1因素水平表分別加入營養(yǎng)鹽，在10 L反應器中培養(yǎng)，結(jié)果見表2。

由表2可知，4種營養(yǎng)鹽對斜生柵藻生長的影響程度從大到小為A>D>B>C，即NaNO3質(zhì)量濃度>FeCl3·6H2O質(zhì)量濃度>K2HPO4·3H2O質(zhì)量濃度>MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度，NaNO3質(zhì)量濃度水平對斜生柵藻生長的影響最大，其次為FeCl3·6H2O質(zhì)量濃度。通過分析4因素的均值可知，4種營養(yǎng)鹽的最優(yōu)水平組合為A2B2C2D3，即NaNO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeCl3·6H2O的最佳質(zhì)量濃度為1.0、0.10、0.008 g/L，通過后續(xù)試驗驗證可知，斜生柵藻在該優(yōu)化條件下的生物量D680 nm可達1.91，是各試驗設(shè)計組中最高的。此外，在正交試驗中4種營養(yǎng)鹽的最適質(zhì)量濃度與單因素的最適質(zhì)量濃度相吻合的有NaNO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O，而FeCl3·6H2O較單因素試驗中的質(zhì)量濃度不同，這可能是由于各因素的交互作用所致。因此，以正交試驗分析所得的最適優(yōu)化組合培養(yǎng)基對斜生柵藻進行10 L擴大培養(yǎng)，可以獲得斜生柵藻的最大生物量。

2.6 斜生柵藻在不同培養(yǎng)條件的生長情況

為了進一步驗證斜生柵藻10 L擴大培養(yǎng)的最佳營養(yǎng)鹽條件，將經(jīng)正交試驗所得的營養(yǎng)鹽條件與BG11基礎(chǔ)培養(yǎng)條件分別在250 mL以及10 L培養(yǎng)體系下進行微藻整個生長周期的培養(yǎng)，試驗結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，斜生柵藻均能在3種不同培養(yǎng)條件下生長，總體生長趨勢相當，前6 d為調(diào)整期，6～15 d為對數(shù)生長期，18 d以后斜生柵藻逐漸進入到穩(wěn)定生長期，27 d后藻細胞開始衰亡；在優(yōu)化后的10 L培養(yǎng)體系條件下，斜生柵藻生長趨

勢明顯好于其余2組，且穩(wěn)定期收獲的生物量最大，D680 nm可達1.91，遠高于10 L-BG11、250 mL-BG11條件下的D680 nm（1.58）、D680 nm（1.48），分別是該2組的1.20、1.28倍。此外，在外界環(huán)境條件、營養(yǎng)鹽條件相同的情況下，微藻反應體系對其生長影響較大，250 mL體系生物量小于10 L體系，這可能是由于較大反應器更有利于微藻的生長繁殖，特別是在微藻生長繁殖后期，由于微藻細胞密度不斷增大，光遮蔽效應日益明顯，微藻生長對環(huán)境空間以及營養(yǎng)鹽的需求表現(xiàn)得更加突顯。

3 結(jié)論

在單因素試驗中，NaNO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeCl3·6H2O的最佳質(zhì)量濃度為1.0、0.10、0.100、0.006 g/L。在10 L反應體系中，NaNO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeCl3·6H2O的最佳質(zhì)量濃度為1.0、0.10、010、0.008 g/L。后續(xù)試驗證明，斜生柵藻在10 L-優(yōu)化培養(yǎng)中的生物量遠高于BG11基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別是10 L-BG11、250 mL-BG11培養(yǎng)條件的1.20、1.28 倍，同時10 L反應體系更利于微藻生長繁殖和生物量的積累，該研究也為微藻的擴大培養(yǎng)提供了依據(jù)。

參考文獻：endprint

[1]Brennan L，Owende P. Biofuels from microalgae-a review of technologies for production，processing，and extractions of biofuels and co-products[J]. Renewable and Sustainable Energy Reviews，2010，14（2）：557-577.

[2]Singh A，Nigam P S，Murphy J D. Renewable fuels from algae：an answer to debatable land based fuels[J]. Bioresource Technology，2011，102（1）：10-16.

[3]季 祥，王金榮，丁 瀟，等. 一株斜生柵藻的篩選及生長條件的優(yōu)化[J]. 水產(chǎn)科技情報，2010，37（6）：265-268.

[4]Mandotra S K，Kumar P，Suseela M R，et al. Fresh water green microalga Scenedesmus abundans：a potential feedstock for high quality biodiesel production[J]. Bioresource Technology，2014，156（101）：42-47.

[5]倪海兒. 生物試驗設(shè)計與分析[M]. 北京：科學出版社，2013：156-160.

[6]Seppl J，Tamminen T，Kaitala S. Experimental evaluation of nutrient limitation of phytoplankton communities in the Gulf of Riga[J]. Journal of Marine Systems，1999，23（1/2/3）：107-126.

[7]Huber S C，Maury W. Effects of magnesium on intact chloroplasts[J]. Plant Physiol，1980，65：350-354.張美德，艾倫強，盧 超，等. 硒對鎘脅迫下白術(shù)幼苗生理特性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43（10）：306-308.endprint