一種便捷高產(chǎn)的辣椒疫霉菌游動孢子產(chǎn)生方法

許亞池+王述彬+刁衛(wèi)平+劉金兵+潘寶貴+郭廣君+戈偉+劉娜

摘要：辣椒疫霉菌游動孢子的形成是辣椒疫病發(fā)生的前提，疫霉菌產(chǎn)孢條件的優(yōu)化對辣椒疫病抗性育種具有重要意義。本試驗(yàn)對V8培養(yǎng)基的濃度、黑暗培養(yǎng)時(shí)間及無菌水處理等條件進(jìn)行探索，以期獲得辣椒疫霉菌游動孢子產(chǎn)生的最佳條件。結(jié)果表明：5% V8培養(yǎng)基最適合辣椒疫霉菌菌絲生長及產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量可達(dá)100萬個(gè)/mL，在光照試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)5 d黑暗處理時(shí)菌絲生長濃密且在光照條件下易于產(chǎn)孢。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，無菌水對產(chǎn)孢量有重要作用，黑暗處理后加入適量無菌水進(jìn)行光照能夠大大提高產(chǎn)孢量，最高產(chǎn)孢量可達(dá)750萬個(gè)/mL。本試驗(yàn)簡化了辣椒疫霉菌的培養(yǎng)，獲得了游動孢子最佳產(chǎn)孢條件，為辣椒抗疫霉病研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：辣椒；疫霉菌；游動孢子；產(chǎn)孢條件

中圖分類號：S436.418.1+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0172-02

辣椒疫病是由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）所引起的世界性病害，可造成幼苗猝倒、莖稈枯死和果實(shí)腐爛。辣椒疫霉菌最早由美國學(xué)者 Leonian于 1922 年分離并定名為Phytophthora capsici[1]，屬鞭毛菌亞門（Mastigomycotina ）卵菌綱（Oomycetes） 霜霉目（Peronosporales）疫霉屬（Phytophthora）真菌[2]。辣椒疫病于1918年在美國首次發(fā)生后并迅速傳播至整個(gè)世界，我國也于20世紀(jì)50年代在江蘇發(fā)現(xiàn)辣椒疫病的發(fā)生[3]。目前在我國各地均有發(fā)生，是我國辣椒生產(chǎn)上的主要病害之一。在辣椒種質(zhì)資源疫病抗性評價(jià)與抗性相關(guān)基因表達(dá)及克隆等相關(guān)研究中，需要預(yù)先誘發(fā)出大量疫霉菌游動孢子作為接種菌源，而對辣椒疫霉菌產(chǎn)孢條件和游動孢子釋放條件的優(yōu)化是上述研究的前提。鑒于目前辣椒疫霉菌培養(yǎng)及產(chǎn)胞條件研究結(jié)論復(fù)雜多樣，還未有一致的標(biāo)準(zhǔn)和方法，本試驗(yàn)選用混合蔬菜汁配制的改良V8培養(yǎng)基，對辣椒疫霉病菌絲培養(yǎng)和產(chǎn)胞過程中的光照、水分等因素進(jìn)行研究，探索辣椒疫霉菌最佳產(chǎn)孢條件，旨在簡化辣椒疫霉菌培養(yǎng)及游動孢子產(chǎn)生過程，為辣椒疫病抗性育種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用的辣椒疫霉菌來自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院資源與環(huán)境研究所，金寶湯V8 100%混合蔬菜汁飲料購于金寶湯亞洲有限公司。

基本培養(yǎng)基：瓊脂粉10 g+碳酸鈣1.0 g，加蒸餾水定容至500 mL，120 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 V8培養(yǎng)基配比對菌絲生長及產(chǎn)孢影響 配制5%、10%、15%、20%等4種濃度的V8培養(yǎng)基，編號為1、2、3、4，以基本培養(yǎng)基作為空白對照組，編號為0，每組3次重復(fù)。將供試?yán)苯芬呙咕袎K轉(zhuǎn)接到上述5種培養(yǎng)基上，置于28 ℃暗培養(yǎng)5 d后記錄菌落直徑，再移至28 ℃全光照條件下培養(yǎng) 5 d，10倍顯微鏡下觀察孢子囊，記錄孢子囊數(shù)，然后誘導(dǎo)孢子囊釋放游動孢子并計(jì)算濃度。

1.2.2 黑暗培養(yǎng)時(shí)間對菌絲生長及產(chǎn)孢影響 將辣椒疫霉菌接種于5%V8培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗培養(yǎng)，設(shè)置3、4、5、6 d黑暗處理，編號為3、4、5、6，以全光照作為空白對照，編號為0，每組3次重復(fù)。培養(yǎng)后3 d開始依照試驗(yàn)設(shè)置將黑暗處理的培養(yǎng)皿移到全光照條件下，培養(yǎng)后6 d時(shí)記錄菌落直徑，10 d 后在10倍顯微鏡下觀察孢子囊，記錄孢子囊數(shù)，然后誘導(dǎo)游動孢子囊釋放游動孢子并計(jì)算濃度。

1.2.3 水處理對產(chǎn)孢影響 取28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d后的疫霉菌，以全光照不加無菌水為對照組，以全光照加入10 mL無菌水為處理組，每組3個(gè)重復(fù)。5 d后誘導(dǎo)孢子囊釋放游動孢子并計(jì)算濃度。

1.2.4 菌落直徑數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 菌落直徑（cm）=3個(gè)培養(yǎng)皿菌落直徑之和/3。

1.2.5 疫霉菌孢子囊數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 10倍顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，觀察記錄孢子囊數(shù)并求出1個(gè)視野的平均孢子囊數(shù)：1個(gè)視野的平均孢子囊數(shù)（個(gè)）=10個(gè)視野總孢子囊數(shù)/10。

1.2.6 誘導(dǎo)孢子囊釋放游動孢子及其濃度計(jì)算 在培養(yǎng)皿內(nèi)加入10 mL無菌水，4 ℃冰箱處理30 min，取出置于室溫 30 min，沖洗下白色菌落，吸取等量孢子懸浮液，10倍顯微鏡下利用25×16規(guī)格血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)并計(jì)算游動孢子濃度：游動孢子濃度（個(gè)/mL）=5個(gè)中方格內(nèi)游動孢子數(shù)/80×400×10 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 V8培養(yǎng)基配比對菌絲生長及產(chǎn)孢影響

辣椒疫霉菌5 d黑暗培養(yǎng)5 d光照培養(yǎng)后在顯微鏡10倍視野下鏡檢，發(fā)現(xiàn)0號偶爾有孢子囊出現(xiàn)在視野中，菌絲短而稀疏；1號5%V8試驗(yàn)組菌絲較密，接種塊中央附近孢子囊出現(xiàn)較少，邊緣孢子囊多，1個(gè)視野中平均有50個(gè)邊緣孢子囊；2號10%試驗(yàn)組、3號15%試驗(yàn)組平均20、40個(gè)；4號20%試驗(yàn)組的中央、邊緣孢子囊個(gè)數(shù)差異不明顯，1個(gè)視野中平均3個(gè)孢子囊。菌落直徑與血球計(jì)數(shù)板所得游動孢子濃度見圖1。由圖1可以看出，1號5%V8培養(yǎng)基最有利于辣椒疫霉菌菌絲生長與產(chǎn)孢。

2.2 黑暗處理時(shí)間對辣椒疫霉菌菌絲生長及產(chǎn)孢的影響

辣椒疫霉菌經(jīng)過0、3、4、5、6 d黑暗處理后在培養(yǎng)后10 d 于10倍顯微鏡下鏡檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0 d處理菌絲稀少，稀疏地在培養(yǎng)基上生長，1個(gè)視野中平均2個(gè)孢子囊；3 d處理菌絲稀疏，1個(gè)視野中平均4個(gè)孢子囊；4 d處理菌絲較3 d處理濃密，1個(gè)視野中平均90個(gè)孢子囊；5 d處理菌絲成棉絮狀，但邊緣較少，1個(gè)視野中平均140個(gè)孢子囊；6 d處理菌絲與5 d處理差異不大，但1個(gè)視野中平均15個(gè)孢子囊。由圖2可以看出，在3 d黑暗處理中辣椒疫霉菌雖然菌落直徑最大，但其菌絲較5 d黑暗培養(yǎng)的菌絲不夠濃密，并且光照處理后產(chǎn)孢效果沒有5 d黑暗培養(yǎng)的強(qiáng)，綜合選擇5 d黑暗培養(yǎng)作為最佳黑暗培養(yǎng)時(shí)間。endprint

2.3 全光照時(shí)加入無菌水對游動孢子釋放的影響

辣椒疫霉菌經(jīng)過5 d黑暗培養(yǎng)和5 d光照培養(yǎng)后與奧林巴斯顯微鏡10倍視野下觀察（圖3、圖4），經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)得到加入無菌水的游動孢子濃度高達(dá)750萬個(gè)/mL，未加入無菌水的游動孢子濃度為50萬個(gè)/mL。在加入無菌水的試驗(yàn)組中發(fā)現(xiàn)，孢子囊一旦成熟就會在水的作用下釋放游動孢子，游動孢子聚集在菌絲附近形成游動孢子樹的現(xiàn)象（圖5）。

3 結(jié)論與討論

在以往的研究中，對辣椒疫霉菌產(chǎn)孢所適宜的培養(yǎng)基和

誘導(dǎo)方法存在不同觀點(diǎn)。王曉敏等發(fā)現(xiàn)，胡蘿卜培養(yǎng)基適合辣椒疫霉菌菌絲生長和游動孢子囊產(chǎn)生[4-6]；劉正坪等研究發(fā)現(xiàn)，在馬鈴薯+番茄、PV8上疫霉菌菌絲生長狀況最佳[7]；而徐作珽等認(rèn)為V8培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，能很好地促進(jìn)辣椒疫霉菌孢子囊的產(chǎn)生，V8培養(yǎng)基較利馬豆培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基和胡蘿卜培養(yǎng)基、PDA等具有營養(yǎng)元素穩(wěn)定、制作簡單方便等優(yōu)點(diǎn)[8]。本研究在有關(guān)V8培養(yǎng)基對辣椒疫霉菌培養(yǎng)的報(bào)道介紹下，利用V8混合蔬菜汁來配制不同濃度的培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)5%配比最有利于菌絲生長及產(chǎn)孢。

張政兵等發(fā)現(xiàn)，辣椒疫霉菌菌絲生長對光照不敏感，但孢子囊的產(chǎn)生需要光照[9]。有學(xué)者認(rèn)為在光照培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)孢之前需要黑暗培養(yǎng)，該過程作用是為辣椒疫霉菌產(chǎn)孢積累營養(yǎng)物質(zhì)，但對于黑暗培養(yǎng)的時(shí)間還未見研究。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，光照處理相對黑暗處理有抑制菌絲生長的現(xiàn)象，導(dǎo)致在全光照下培養(yǎng)的菌落直徑較小，氣生菌絲稀疏；并且發(fā)現(xiàn)菌落直徑與產(chǎn)孢量并不存在正相關(guān)關(guān)系，菌落直徑大的產(chǎn)孢量不一定大；本試驗(yàn)在辣椒疫霉菌產(chǎn)孢需要光照這一觀點(diǎn)上與前人結(jié)論一致。在光照培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)孢之前需要黑暗培養(yǎng)，先增加疫霉菌的營養(yǎng)生長，王曉敏推測可能由于營養(yǎng)生長積累了為產(chǎn)生孢子所需的養(yǎng)分，但過分生長是不利于產(chǎn)孢的[4]。本試驗(yàn)為探索黑暗培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行比較試驗(yàn)，得出5 d黑暗處理的效果最好，菌絲生長濃密，光照培養(yǎng)后產(chǎn)孢較多。

辣椒疫霉菌孢子囊在16～28 ℃下多為間接萌發(fā)，即在水中孢子囊萌發(fā)釋放游動孢子，在30 ℃以上時(shí)多為直接萌發(fā)，即在濕度較低時(shí)，孢子囊萌發(fā)產(chǎn)生芽管[10]。辣椒疫霉菌侵染寄主的典型過程是通過游動孢子完成侵染的，所以研究水對于游動孢子產(chǎn)生及釋放的影響具有重要意義。侯全剛等一致認(rèn)為，連續(xù)光照有利于辣椒疫霉菌產(chǎn)孢[11-12]，但在全光照條件下是否加無菌水培養(yǎng)少有研究，本研究得出水對游動孢子的釋放有重要作用，與未加無菌水對照組相比游動孢子濃度高出1個(gè)數(shù)量級。簡化游動孢子釋放程序是本研究最大的創(chuàng)新，選擇V8混合蔬菜汁來代替單一培養(yǎng)基，加之研究水對產(chǎn)孢影響得出最簡化的產(chǎn)孢條件，增加了游動孢子的釋放量，為辣椒疫病研究奠定了基礎(chǔ)。

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