木犀草素在電沉積石墨烯修飾電極上的電化學研究及測定

賴文婷，李小寶，王文成，田鑫，溫校勇，范德方，馬重，孫偉

（熱帶藥用植物化學教育部重點實驗室海南師范大學化學與化工學院，海南?？?71158）

木犀草素（Luteolin，3，4，5，7-四羥基黃酮）是一種天然黃酮類化合物，在自然界中分布廣泛，存在于許多植物中如菊花，金銀花，紫蘇葉，落花生等[1].木犀草素具有許多生化和藥理作用，包括抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎和抗癌作用，它不僅可用于體外抗炎作用，而且具有抗腫瘤細胞增殖及增敏抗腫瘤藥物作用[2].目前已經(jīng)有多種檢測木犀草素的方法[3-5]，例如高效液相色譜法、毛細管電泳法、紫外光譜法、氣相色譜法、分光光度法等，然而這些方法存在操作繁瑣、靈敏度差、儀器昂貴、準確度不高等缺點.在木犀草素的結構中帶有4 個酚羥基結構，因此可以采用電化學的方法進行研究，而且電化學方法具有操作簡單、成本低廉等優(yōu)點，所以用電化學方法對木犀草素的研究具有重要意義.Lunte等人對木犀草素的電化學行為進行了研究[6]；Zhao 等制作了多壁碳納米管修飾電極用于花生殼中木犀草素含量的測定[7]；Zeng 等將多孔碳修飾于電極表面用電化學方法測定了木犀草素[8].

石墨烯（GR）是一種具有二維結構的納米碳材料，具有獨特的幾何結構，其機械和電子性能，已經(jīng)引起了人們極大的興趣[9].由于GR 具有良好的導電性，可以加快電極表面的電子傳遞速率，因此其被廣泛應用于電化學分析和電化學傳感檢測[10].離子液體修飾碳糊電極（CILE）是一種新型的修飾電極，它以離子液體為粘合劑和修飾劑的碳糊電極，表現(xiàn)出良好的電化學性能，已被廣泛應用于制備各種電化學傳感器[11].

本文以CILE 為工作電極利用電沉積的方法制備了石墨烯修飾電極，進而建立了一種檢測木犀草素的簡單靈敏的電化學分析新方法.由于電極表面石墨烯的存在，木犀草素在修飾電極上出現(xiàn)了一對明顯的氧化還原峰，電化學信號與裸電極相對顯著增大，將該電極應用于木犀草素含量的測定，取得了良好的效果.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI 1210A型電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）；三電極系統(tǒng)：CILE或GR/CILE為工作電極，鉑電極為輔助電極，參比電極為飽和甘汞電極.

1.0 mmol/L木犀草素儲備液（西安玉泉生物科技有限公司）以無水乙醇配制備用，正己基吡啶六氟磷酸鹽（HPPF6，中國科學院蘭州化學物理研究所綠色化學與研究中心），氧化石墨烯（太原炭美有限公司），石墨粉（上海膠體化工廠），支持電解質(zhì)為0.10 mol/L PBS 所用其它試劑均為分析純，試驗用水均為二次蒸餾水.

1.2 修飾電極的制備

根據(jù)文獻的方法制備CILE[12]，具體是將1.6 g 石墨粉和0.8 g HPPF6混合，研磨均勻后填入空心玻璃管中壓實，以銅絲作為導線，使用前將電極表面在硫酸紙上打磨平整.

GR/CILE 的制備方法是將CILE 浸在含有3.0 mg/mL GO 和0.15 mol/L LiClO4的混合溶液中，在-1.3 V（vs.SCE）電位下恒電位法沉積300 s后取出，用超純水沖洗后N2吹干即可得到GR/CILE.

1.3 實驗過程

在電位窗口0～1.0 V 之間利用三電極系統(tǒng)對木犀草素的標準溶液進行循環(huán)伏安掃描，研究木犀草素的電化學行為；考察緩沖液pH以及掃描速度等實驗條件對木犀草素的電化學行為的影響；利用示差脈沖伏安法測定不同濃度的木犀草素溶液，繪制出工作曲線.

2 結果與討論

2.1 木犀草素在修飾電極上的循環(huán)伏安行為

考察了1.0×10-6μmol/L 的木犀草素在0.1 mol/L pH 2.0 的PBS 緩沖液中不同電極上的循環(huán)伏安曲線，結果見圖1.從圖中可以看出在CILE 和GR/CILE上均出現(xiàn)了一對氧化還原峰，為木犀草素的電化學行為[7].木犀草素是一種具有電化學活性的黃酮類化合物，可以在電極上直接發(fā)生氧化還原反應而出現(xiàn)一對氧化還原峰.木犀草素在CILE上的氧化峰電位（Epa）為0.603 V，還原峰電位（Epc）為0.555 V，氧化峰電流（Ipa）為10.26 μA，還原峰電流（Ipc）為9.96 μA.在GR/CILE上木犀草素的氧化還原峰電流明顯增大，Ipa為22.10 μA，Ipc為21.04 μA，這是由于GR 具有高比表面積和良好的導電性能，促進了木犀草素的電化學反應，因此GR/CILE 可以用于木犀草素的高靈敏檢測.

圖1 在pH 2.0的PBS緩沖液中1.0×10-6mol/L木犀草素在CILE(a)和GR/CILE(b)上的循環(huán)伏安圖，掃描速度為100 mV/sFig.1 Cycle voltammograms of 1.0×10-6mol/L luteolin on CILE(a)and GR/CILE(b)in pH 2.0 PBS

2.2 緩沖液pH對木犀草素的電化學行為的影響

在pH 1.5～6.0范圍內(nèi)考察了不同pH的PBS緩沖溶液對木犀草素測定的影響，結果見圖2A，從圖中可以看出氧化還原峰的峰電流和峰電位隨著pH 的改變而變化.當pH 為2.0 時氧化峰電流達到最大值（見圖2B），因此本實驗選擇pH為2.0為測定酸度.隨著pH 的增大，氧化還原峰電位發(fā)生負移，表明有質(zhì)子參與電極的反應.氧化峰電位和pH呈現(xiàn)良好的線性關系（見圖2C），線性回歸方程為Ep（aV）=-0.055pH+0.675，方程的斜率為-55 mV/pH，接近于理論值-59 mV/pH，這說明木犀草素在修飾電極上的發(fā)生等質(zhì)子等電子的反應.

2.3 氧化還原峰電流和掃速的關系

如圖3A 所示在pH 為2.0 的PBS 緩沖液中，1.0×10-6mol/L 的木犀草素溶液在不同掃速（10～280 mV/s）下的循環(huán)伏安圖.從圖中可以看出氧化還原峰電流隨著掃速的增大而增大，電流與掃速之間呈現(xiàn)出良好的線性關系（見圖3B），其線性回歸方程為Ipa（μA）=14.47+435.34υ（V/s）（γ=-0.999）和Ipc（μA）=-17.30-558.98υ（V/s）（γ=-0.9996），說明木犀草素在電極上的氧化還原反應為吸附控制過程.

隨著掃描速度的增大，氧化峰正移，還原峰負移，電位差變大，這說明木犀草素在電極上的反應為一個準可逆的過程.氧化還原峰的電位和掃速作圖得到兩條線性直線（見圖3C），其線性回歸方程為Epa（V）=0.71+0.024 lnυ（γ=0.9988）和Epc=0.48-0.034lnυ（γ=-0.992）.

圖2 (A)1.0×10-6mol/L木犀草素溶液在不同pH的PBS緩沖液循環(huán)伏安圖(a-f:6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.5)，(B)pH與氧化峰電流（Ipa）的關系，(C)pH與氧化峰電位的關系Fig.2 （A）Cycle voltammograms of 1.0×10-6mol/L luteolin in different pH PBS;(B)the relationship of the oxidation peak current and pH;(C)the relationship of the oxidation peak potential with pH value

圖3 （A）1.0×10-6mol/Lmol/L 木犀草素在GR/CILE 上不同掃速下的循環(huán)伏安疊加圖(a-m:10,20,40,60,80,100.0,120.0,150.0,180.0,200.0,220.0,250.0,280.0 mV/s)（B）掃速υ與氧化還原峰電流的關系圖；(C)氧化還原峰電位與lnυ的關系圖Fig.3 (A) Cycle voltammograms of 1.0×10-6mol/L luteolin on GR/CILE at different scan rate; (B) the relationship between redox peak currents and scan rate;(C)the relationship between redox peak potential and lnυ

2.4 線性范圍和檢出限

在最佳實驗條件下，記錄不同濃度的木犀草素在GR/CILE 上的示差脈沖伏安曲線（見圖4 A）及濃度與氧化峰電流的關系圖（見圖4 B）.當木犀草素的濃度在4.0×10-8μmol/L～4.0×10-6μmol/L 范圍內(nèi)氧化峰電流與濃度呈良好線性關系，線性方程為I（μA）=-20.21-99.77 C（μmol/L）（γ=-0.999），檢測限為1.0×10-8μmol/L（3S0/S）.

2.5 重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和干擾離子的影響

GR/CILE 在1.0×10-6mol/L 的木犀草素溶液中循環(huán)伏安掃描500 圈后，峰電流能夠保持原來的93.4%，由此說明GR/CILE 在pH2.0 PBS 緩沖液中能夠有較好的穩(wěn)定性.該修飾電極在1.0×10-6mol/L的木犀草素溶液平行測定5次之后，相對偏差在4.1%，說明有較好的穩(wěn)定性.在含有1.0×10-6μmol/L 的木犀草素溶液中分別加入100倍的干擾物質(zhì)（鋇離子，鎘離子，鈷離子，鉀離子，錳離子，鈉離子，丙氨酸，賴氨酸，胱氨酸，蘇氨酸）進行干擾測定，結果表明相對偏差均小于5%，說明該方法有較好的選擇性.

3 結論

制備了CILE 和GR 修飾CILE，以其為工作電極利用循環(huán)伏安法和示差脈沖伏安法研究了木犀草素的電化學行為.GR在電極表面的存在大大的改善了電極的性能，并由此建立了一種檢測木犀草素的高靈敏度的電化學方法.在所選實驗條件下木犀草素濃度在4.0×10-8mol/L～4.0×10-6mol/L 范圍內(nèi)氧化峰電流與濃度之間有著良好的線性關系，檢測限為1.0×10-8mol/L（3S0/S）.

圖4 (A)不同濃度木犀草素在GR/CILE上的DPV曲線（a-g:8.0×10-7 mol/L,10.0×10-7 mol/L,2.0×10-6 mol/L,4.0×10-6mol/L,6.0×10-6 mol/L,8.0×10-6 mol/L,10.0×10-6 mol/L）;圖(B)氧化峰電流與濃度的線性關系Fig.4 （A）Differential pulse voltammograms of different concentrations of luteolin on GR/CILE;(B)the linear relationship of the oxidation peak current with concentration

[1]Haminiuk C W I,Maciel G M,Plata-Oviedo M S V,et al.Phenolic compounds in fruits–an overview[J].Food Sci Technol,2012,47(10):2023-2044.

[2]Katarna H A,Ivan C,Livia S A,et al.Protective effect of quercetin and luteolin in human melanoma HMB-2 cells[J].Mutation Research,2005,565(2,3):105-112.

[3]Areias F M,Valentao P,Andrade P B,et al.Phenolic finger?print of peppermint leaves[J].Food Chem,2001,73(3):307-311.

[4]Wittemer S M,Veit M J.Validated method for the determi?nation of six metabolites derived from artichoke leaf extract in human plasma by high-performance liquid chromatogra?phy-coulometric-array detection[J].J Chromatogr B,2003,793(2):367-375.

[5]Gutierrez F,Ortega G,Cabrera J L,et al.Quantification of quercetin using glassy carbon electrodes modified with multi?walled carbon nanotubes dispersed in polyethylenimine and polyacrylic acid[J].Electroanalysis,2010,22(22):2650-2657.

[6]Hendrickson H P,Kaufman A D,Lunte C E.Electrochemis?try of catechol-containing flavonoids[J].J Pharm Biomed Anal,1994,12(3):325-334.

[7]Zhao D M,Zhang X H,Feng L J,et al.Sensitive electro?chemical determination of luteolin in peanut hulls using multi-walled carbon nanotubes modified electrode[J].Food Chem,2011,127(2):694-698.

[8]Zeng L J,Zhang Y F,Wang H,et al.Electrochemical behav?ior of luteolin and its detection based on macroporous car?bon modified glassy carbon electrode[J].Anal Methods,2013,5(13):3365-3370.

[9]Novoselov K S,Geim A K,Morozov S V,et al.Electric field effect in atomically thin carbon films[J].Science,2004,306(5696):666-669.

[10]Gan T,Hu S.Electrochemical sensors based on graphene materials[J].Microchim Acta,2011,175(1-2):1-19.

[11]Shiddiky M J A,Torriero A A J.Application of ionic liq?uids in electrochemical sensing systems[J].Biosens Bioelec?tron,2011,26(6):1775-1787.

[12]Wang X L,Li G J,Liu L H,et al.Application of titanium dioxide nanowires and electroreduce graphene oxide modi?fied electrodes for the electrochemical detection of specific tlh gene sequence from Vibrio parahaemolyticus[J].Anal Methods,2015,7(6):2623-2629.